本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地說，涉及一種檢測偽狂犬病毒野毒株的交叉等溫擴增引物組、試劑盒及應用。

背景技術：

豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)由偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)感染引起，是嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的一種重要傳染病。偽狂犬病毒屬于α皰疹病毒科，基因組為雙鏈DNA分子，大小約150kb，成熟病毒粒子攜帶50余種蛋白，其中gB、gE、gG、gI、TK等毒力基因是其復制非必需基。雖然我國曾采取gE基因缺失疫苗免疫與野毒感染抗體監(jiān)測相結合的策略一度實現(xiàn)了該病的控制與凈化，但2011年底豬群中變異毒株的出現(xiàn)導致廣泛使用的Bartha-K61弱毒疫苗無法再提供完全保護，許多已免疫的豬場仍相繼出現(xiàn)疑似偽狂犬病癥狀，造成我國養(yǎng)豬業(yè)的巨大損失。

PRV宿主譜極其廣泛，包括豬、牛、羊、鼠、兔、貓、犬等。豬是PRV感染后唯一可以存活的物種，但急性感染豬康復后，病毒基因組將一直存在于三叉神經節(jié)中造成潛伏感染，這增加了豬偽狂犬病的診斷與防控難度。目前，常用的偽狂犬病診斷方法主要包括病毒分離、兔體接種實驗、ELISA和PCR技術等。其中，PCR技術是基層獸醫(yī)普遍使用PRV病原檢測方法。然而，該技術在擴增過程中需要昂貴的熱循環(huán)功能儀與熟練的操作人員，妨礙該技術在獸醫(yī)基層進行廣泛的應用與推廣。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對上述的問題，提供了一種偽狂犬病毒野毒株的交叉等溫擴增快速檢測試劑盒及應用，該試劑盒具有高特異性、高敏感性、可視化、操作方法簡單的特點。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明公開了一種檢測偽狂犬病毒野毒株的交叉等溫擴增引物組，由外部引物F3、外部引物B3、探針引物B2、探針引物B1、交叉引物CPF組成；

外部引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

外部引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

交叉引物CPF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

探針引物B2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

探針引物B1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

進一步地，探針引物B2的5’端標記生物素Biotin；探針引物B1的5’端標記FITC。

本發(fā)明還提供一種檢測偽狂犬病毒野毒株的交叉引物擴增試劑盒，包括上述的檢測偽狂犬病毒野毒株的交叉等溫擴增引物組和核酸試紙條。

進一步地，核酸檢測試紙條為通用型核酸檢測試紙條。

進一步地，該試劑盒還包括全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置，該全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置為將通用型核酸檢測試紙條置入一個掌上塑料檢測裝置內得到。

進一步地，該試劑盒還包括dNTP混合物溶液、MgSO₄溶液、反應緩沖液、Bst WarmStart^TM DNA聚合酶、甜菜堿溶液。

進一步地，該試劑盒包括10×反應緩沖液2.5μL、濃度為8U/μL的Bst WarmStart^TMDNA聚合酶、濃度為10mmol/L的dNTP混合物溶液2.0μL、濃度為10mol/L的甜菜堿溶液2.5μL、濃度為100mmol/L的MgSO₄溶液1.0μL、濃度為10μmol/L的交叉引物CPF2.0μL、濃度為10μmol/L的探針引物B2 1.5μL、濃度為10μmol/L的探針引物B11.5μL、濃度為10μmol/L的外部引物F31.0μL、濃度為10μmol/L的外部引物B3 1.0μL。

本發(fā)明還提供一種上述的引物組或試劑盒在檢測待測樣品是否感染偽狂犬病毒野毒株中的應用。

本發(fā)明還提供一種檢測待測樣品是否感染偽狂犬病毒野毒株的方法，包括以下步驟：

1)用上述的引物組或試劑盒對待測樣品進行交叉等溫擴增，得到擴增產物；

2)反應：將得到的產物用核酸檢測試紙條檢測，5min后觀察結果；

3)結果判讀：直接肉眼判讀，

a)陰性：僅在質控區(qū)出現(xiàn)一條條帶，在檢測區(qū)內無條帶出現(xiàn)，證明待測樣品沒有偽狂犬病毒野毒株感染；

b)陽性：出現(xiàn)兩條條帶，一條位于檢測區(qū)內，另一條位于質控區(qū)內，證明待測樣品為偽狂犬病毒野毒株感染；

c)無效：質控區(qū)和檢測區(qū)內均無條帶出現(xiàn)，表明核酸試紙條失效。

進一步地，步驟1)中所述的恒溫反應的時間為60min；恒溫反應的溫度為65℃。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術效果：

1)由于交叉引物擴增檢測方法成本低廉，利用Bst WarmStart^TM DNA聚合酶在65℃實現(xiàn)等溫擴增，不需要復雜且昂貴的PCR儀，因此本發(fā)明提供的試劑盒使用成本低。

2)本發(fā)明所提供的試劑盒反應迅速，可以在60min內完成反應。

3)本發(fā)明提供的試劑盒得到的反應結果直觀準確，無需進行復雜操作。分別對引物與特異性親和探針進行生物標記，然后再用全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置對反應產物進行檢測，既可以準確對結果進行直觀、快速的判讀，又可以防止污染。

4)本發(fā)明提供的試劑盒特異性好，對偽狂犬病毒疫苗株Bartha-K61、豬腎細胞PK-15傳代系、豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒、血清5型副豬嗜血桿菌、血清2型豬鏈球菌都呈陰性反應；敏度性高，最低可以檢測到2TCID₅₀的偽狂犬病毒野毒株基因組DNA模板，與PCR方法敏感性相同。

5)本發(fā)明所述的偽狂犬病毒野毒株交叉等溫擴增試劑盒可快速、敏感的檢測偽狂犬病毒野毒株，無需昂貴儀器，只需一個恒溫水浴鍋即可完成反應。該試劑盒操作簡單、成本低廉，反應結果易于觀察，特異性好，非常適用于出口檢疫、食品衛(wèi)生以及畜牧養(yǎng)殖場的現(xiàn)場檢測，易于大范圍推廣應用。

當然，實施本發(fā)明的任一產品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明不同溫度下反應的電泳亮度關系圖，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道1～8依次對應反應溫度為57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃的反應產物；

圖2是本發(fā)明不同濃度交叉引物CPF與電泳亮度關系圖，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道1～11依次對應交叉引物CPR濃度為0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、1.4μM、1.6μM、1.8μM、2.0μM的反應產物；其他成分的用量如表2所示；

圖3是本發(fā)明提供的交叉等溫擴增試劑盒特異性實驗中的結果圖，其中：

Ctrl為空白對照；1是以偽狂犬病毒野毒株GZ-WH基因組DNA為模板的檢測結果；2是以偽狂犬病毒疫苗株Bartha-K61基因組DNA為模板的檢測結果；3是以豬腎細胞PK-15傳代系基因組DNA為模板的檢測結果；4是以豬圓環(huán)病毒2型基因組DNA為模板的檢測結果；5是以豬細小病毒基因組DNA為模板的檢測結果；6是以血清5型副豬嗜血桿菌基因組DNA為模板的檢測結果；7是以血清2型豬鏈球菌基因組DNA為模板的檢測結果。

圖4是本發(fā)明提供的交叉等溫擴增試劑盒敏感性試驗結果圖；其中，1為2×10⁴TCID₅₀的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH基因組DNA；2×10³TCID₅₀的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH基因組DNA；3為2×10²TCID₅₀的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH基因組DNA；4為2×10¹TCID₅₀的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH基因組DNA；5為2×10⁰TCID₅₀的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH基因組DNA；6為2×10^-1TCID50的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH基因組DNA；7為2×10^-2TCID50的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH基因組DNA；8為空白對照。

圖5是本發(fā)明利用PCR方法得到的產物進行瓊脂糖凝膠電泳得到的圖；其中，1為2×10⁴TCID₅₀的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH基因組DNA；2×10³TCID₅₀的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH基因組DNA；3為2×10²TCID₅₀的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH基因組DNA；4為2×10¹TCID₅₀的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH基因組DNA；5為2×10⁰TCID₅₀的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH基因組DNA；6為2×10^-1TCID50的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH基因組DNA；7為2×10^-2TCID50的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH基因組DNA；8為空白對照。

具體實施方式

以下將配合實施例來詳細說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應用技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據以實施。

本發(fā)明的研究思路是：針對PCR技術在診斷應用中不足，有關恒溫擴增技術的研究不斷深入，為快速診斷方法的形成帶來了新的契機。本發(fā)明技術研制了偽狂犬病毒野毒株的交叉等溫擴增檢測方法，并將該方法與核酸試紙條檢測相結合，使得偽狂犬病毒野毒株的檢測過程更加方便、快速。本發(fā)明技術提供的檢測試劑盒在整個使用過程不需要復雜儀器，核酸樣品制備與擴增程序簡便，容易在獸醫(yī)基層建立與開展。另外，本發(fā)明技術提供的檢測試劑盒在樣品擴增與結果判定過程中可保證環(huán)境的密閉，有效杜絕了因核酸污染造成的假陽性的發(fā)生。

實施例中所涉及的材料：

a)引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；Bst WarmStart^TM DNA聚合酶購自New England公司；MgSO₄(100mM)購自New England公司；甜菜堿(Betaine)購自Sigma公司；全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置購自杭州優(yōu)思達生物技術有限公司(貨號：0001-03)；病毒核酸提取試劑盒購自Magen(美基)生物(R4410-03)；偽狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)、豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(LG株)、豬細小病毒油乳劑滅活疫苗購自上海海利生物技術有限公司；PK-15細胞購自上海拜力生物技術有限公司。

b)偽狂犬病毒野毒GZ-WH株由臨床病料接種PK-15細胞分離，病毒基因序列已提交至交至GenBank(No.KT948051)。

c)以下生物材料均已在文獻“副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌雙重PCR方法的建立與應用.中國獸醫(yī)學報,2009(9):第1155-1157頁.”中公開：血清5型副豬嗜血桿菌、血清2型豬鏈球菌。

實施例1交叉引物恒溫擴增引物的設計和合成

根據引物設計原則，針對偽狂犬病毒野毒株gE基因的保守區(qū)域序列，應用Priemer5軟件進行引物設計，按照我們的經驗保證引物的GC含量在40％～60％之間，各引物Tm值在50～60℃左右。接著我們應用Larsergene7.0生物軟件的PrimerSelect工具對引物進行初步篩選，篩選原則為保證各引物對之間dG值較小。引物序列如表1所示(此時B2和B1引物未進行生物標記)，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，合成后的引物用滅菌三蒸水稀釋成濃度為10μM，-20℃保存。

實施例2交叉引物恒溫擴增引物在檢測待測病毒中的應用

一、病毒核酸的提取

取樣品200μL，按照病毒RNA/DNA提取試劑盒的操作說明進行病毒的核酸提取。

二、交叉等溫擴增方法的建立

以偽狂犬病毒野毒株GZ-WH的基因組DNA為模板，應用初步篩選理論值較優(yōu)的1套引物(如表1所示)進行交叉引物擴增，并對得到產物進行瓊脂糖凝膠(質量體積比2％)電泳檢測。

表1偽狂犬病毒野毒株的交叉等溫擴增反應引物

三、交叉引物擴增反應條件的優(yōu)化

1.反應溫度的優(yōu)化

為了得到最優(yōu)化的反應溫度，分別設置57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃進行交叉等溫擴增反應，反應時間是60min，反應體系如表2所示。反應產物通過2％瓊脂糖凝膠(質量體積比)電泳檢測，從多次重復試驗中確定最佳反應溫度，結果如圖1所示，說明最佳反應溫度為65℃。

2.反應體系的優(yōu)化

主要對交叉引物濃度進行優(yōu)化，反應產物通過2％瓊脂糖凝膠(質量體積比)電泳檢測。

通過設置不同終濃度的交叉引物CPF：0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、1.4μM、1.6μM、1.8μM、2.0μM，其他成分的用量如表2所示(結果如圖2所示)。檢測條件為65℃恒溫60min。根據所得的實驗結果，最終確定優(yōu)化的檢測體系(25μL)如表2所示。

表2優(yōu)化的偽狂犬病毒野毒株交叉引物擴增反應體系

四、交叉等溫擴增-測流層析檢測方法的建立

由上海生工生物工程技術服務有限公司對B2和B1引物的5’端分別進行Biotin(生物素)和FITC(異硫氰酸熒光素)標記。按照表2反應體系將B2和B1分別替換為Biotin(生物素)標記的B2和FITC(異硫氰酸熒光素)標記的B1，建立可用于核酸試紙條檢測的新交叉等溫擴增反應體系。以偽狂犬病毒野毒株GZ-WH的基因組DNA為模板進行交叉等溫擴增反應，反應條件為65℃恒溫60min，同時以水替代核酸模板設置空白對照。反應結束后，將產物用核酸試紙條進行檢測，核酸檢測試紙條為通用型核酸檢測試紙條，包括質控區(qū)(C)和檢測區(qū)(T)。

核酸試紙條的結果鑒定方法如下：

①陰性(－)：僅在質控區(qū)(C)出現(xiàn)一條條帶，在檢測區(qū)(T)內無紅色條帶出現(xiàn)。證明所檢測的樣本沒有偽狂犬病毒野毒株感染；

②陽性(+)：出現(xiàn)兩條條帶。一條位于檢測區(qū)(T)內，另一條位于質控區(qū)(C)內。證明所檢測的樣本為偽狂犬病毒野毒株感染。

③無效：質控區(qū)(C)和檢測區(qū)(T)內均無條帶出現(xiàn)，表明核酸試紙條失效。

五、交叉等溫擴增檢測方法的特異性、敏感性分析

1.特異性分析

使用偽狂犬病毒野毒株GZ-WH、偽狂犬病毒疫苗株Bartha-K61、豬腎細胞PK-15傳代系、豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒、血清5型副豬嗜血桿菌、血清2型豬鏈球菌的基因組DNA為模板檢測體系的特異性。反應體系如表2所示，反應條件為步驟3確定的優(yōu)化條件，使用核酸試紙條對產物進行檢測。使用全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置檢測(5min后看結果)，得到的結果如圖3所示：以偽狂犬病毒野毒株GZ-WH的基因組DNA為模板的交叉等溫擴增反應產物出現(xiàn)兩條條帶，一條位于檢測區(qū)(T)內，另一條位于質控區(qū)(C)內；以偽狂犬病毒疫苗株Bartha-K61、豬腎細胞PK-15傳代系、豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒、血清5型副豬嗜血桿菌、血清2型豬鏈球菌的基因組DNA分別為模板得到交叉引物擴增反應產物，僅在質控區(qū)(C)出現(xiàn)一條條帶，在檢測區(qū)(T)內無條帶出現(xiàn)。結果顯示檢測體系的特異性良好，可特異的檢測到偽狂犬病毒野毒株。

2.敏感性分析

取濃度為1×10⁵TCID₅₀/ml的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH病毒液200μL并進行DNA提取，吸取1μL DNA依次加入9μL的滅菌純水進行10倍梯度稀釋，各取1μL稀釋后樣品液進行交叉等溫擴增-測流層析檢測(反應體系如表2所示，除了模板有變化；反應條件為步驟3確定的優(yōu)化條件)與PCR檢測。PCR所使用的引物是F3與B3引物，反應體系如表3所示：

表3PCR反應體系

PCR程序如下：94℃預變性3min；94℃60s，56℃45s，72℃30s為一個循環(huán)，運行30個循環(huán)，最后72℃延伸8min，4℃保存。

比較交叉等溫擴增-測流層析檢測法與PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測方法的敏感性。結果如圖4和5所示，交叉等溫擴增-測流層析檢測法的敏感性與PCR瓊脂糖凝膠電泳方法相同，最低可以檢測到2TCID₅₀的偽狂犬病毒野毒株GZ-WH的DNA。相比之下，本發(fā)明提供的交叉等溫擴增-測流層析檢測方法敏感性高，操作更加簡單(等溫反應)，而且用時更短(只需60min)，結果比較直觀(肉眼判別)。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應當理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應在發(fā)明所附權利要求的保護范圍內。