本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種人類皰疹病毒4型檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：人類皰疹病毒第四型即EB病毒(EBV)，EBV是一種普遍存在于人體的皰疹類病毒，人一旦感染后，就可能終身攜帶。EBV感染主要會(huì)引起兒童傳染性單核細(xì)胞增多癥及與許多腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，嚴(yán)重威脅著人類特別是兒童的健康，因而一直倍受關(guān)注。目前，血液中EB病毒DNA檢測(cè)主要采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)。熒光定量PCR又稱實(shí)時(shí)定量PCR，是近年開發(fā)出來(lái)的全新PCR技術(shù)，可以全程、動(dòng)態(tài)、不間斷地光學(xué)監(jiān)控被熒光標(biāo)記的PCR反應(yīng)，以此來(lái)評(píng)價(jià)被檢測(cè)標(biāo)本中的DNA含量，能反映PCR擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)變化，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，具有快速、準(zhǔn)確、不易被污染等優(yōu)點(diǎn)。如中國(guó)專利申請(qǐng)CN103866046A公開了一種人皰疹病毒EBV和VZV檢測(cè)試劑盒，由定量PCR反應(yīng)液、EBV標(biāo)準(zhǔn)品、VZV標(biāo)準(zhǔn)品、EBV陽(yáng)性對(duì)照品、VZV陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、說(shuō)明書和盒體組成。該發(fā)明試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和雙色熒光探針，能一步法檢測(cè)人皰疹病毒EBV和VZV，實(shí)現(xiàn)了EBV和VZV感染的同步診斷，對(duì)陽(yáng)性病毒能實(shí)時(shí)準(zhǔn)確定量，可滿足臨床早期、準(zhǔn)確診斷EBV和VZV感染的迫切需要，為EBV和VZV感染的及時(shí)針對(duì)性治療提供依據(jù)。運(yùn)用PCR技術(shù)檢測(cè)EB病毒DNA主要包括EB病毒核酸的提取和核酸的PCR擴(kuò)增，但是該試劑盒并未涉及EB病毒核酸提取方面，而在實(shí)際運(yùn)用中，除PCR本身外，核酸提取效率和抗干擾能力對(duì)PCR準(zhǔn)確檢測(cè)EB病毒核酸含量有很大影響。目前，國(guó)內(nèi)臨床上主要采用直接煮沸法、酚-氯仿抽提法對(duì)血漿或血清樣本中的EB病毒核酸進(jìn)行提取，直接煮沸法提取過(guò)程較復(fù)雜，且在處理樣本時(shí)經(jīng)過(guò)煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個(gè)步驟，樣本中的DNA存在損耗，同時(shí)直接加熱法提取的核酸模板中含有較多的雜質(zhì)，這些存在的雜質(zhì)會(huì)干擾檢測(cè)的進(jìn)行，如蛋白質(zhì)、肝素等，所以往往需要將核酸提取液進(jìn)一步純化，純化工序冗長(zhǎng)且往往達(dá)不到預(yù)期效果。而國(guó)外臨床上主要采用DNA提取試劑盒來(lái)提取EB病毒核酸，其提取效果較好，但是由于價(jià)格昂貴，難以在國(guó)內(nèi)應(yīng)用。針對(duì)上述問(wèn)題，中國(guó)專利申請(qǐng)CN103060473A公開了一種皰疹類病毒EBV檢測(cè)試劑盒，其包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷0.01～0.5mM/L，氯化鉀20～300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01～2％和乙醇0.05～1％。該核酸釋放劑提取核酸時(shí)采用強(qiáng)烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結(jié)構(gòu)，釋放出病原體核酸，無(wú)需加熱即可完成DNA的釋放和提取。雖然用核酸釋放劑提取核酸具有快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但是核酸樣品含雜質(zhì)較多，且整體的提取效率不高，影響了試劑盒的檢測(cè)準(zhǔn)確度。因此，有必要在此基礎(chǔ)上改進(jìn)，進(jìn)而提供一種能夠?qū)颖局械腅BV準(zhǔn)確定量的試劑盒。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種人類皰疹病毒4型檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，以解決以上缺陷。本發(fā)明提供了一種人類皰疹病毒4型檢測(cè)試劑盒，包括核酸釋放劑、含磁珠的核酸提取液和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包括0.1～0.3mg/ml表面活性肽、0.01～0.05mg/ml醋酸氯己定、2～6％氯化鉀(w/v)和0.1～2％的親水石墨烯(w/v)；所述含磁珠的核酸提取液包括100～300mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸、100～300mmol/L氯化鈉和100～400μg/ml磁珠；所述PCR反應(yīng)液包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針。進(jìn)一步地，所述核酸釋放劑包括0.2mg/ml表面活性肽、0.03mg/ml醋酸氯己定、4.5％氯化鉀(w/v)和1.2％的親水石墨烯(w/v)，所述含磁珠的核酸提取液包括200mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸、200mmol/L氯化鈉和250μg/ml磁珠。需要值得說(shuō)明的是，本發(fā)明先用核酸釋放劑釋放核酸，然后通過(guò)磁珠吸附核酸，從而達(dá)到對(duì)核酸的高提取。其中，本發(fā)明中核酸釋放劑的溶劑可以是無(wú)菌水或TE緩沖液。本發(fā)明核酸釋放劑中親水石墨烯與樣本中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等具有強(qiáng)親和力，能夠與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)結(jié)合，使得蛋白質(zhì)等雜質(zhì)沒(méi)有多余的結(jié)合位點(diǎn)與磁珠結(jié)合，從而提高了核酸的提取率，進(jìn)而提高了試劑盒的檢測(cè)準(zhǔn)確度。另一方面，親水石墨烯對(duì)核酸具有強(qiáng)保護(hù)作用。本發(fā)明核酸釋放劑與現(xiàn)有技術(shù)中直接煮沸法的檢測(cè)結(jié)果具有高度的一致性，利用本發(fā)明核酸釋放劑提取核酸加熱即可使核酸快速釋放出來(lái)。再利用磁珠捕捉核酸，經(jīng)過(guò)磁分離清洗后即得核酸樣品，由于親水石墨烯吸附了絕大部分的雜質(zhì)，經(jīng)磁分離后清洗得到的核酸樣品雜質(zhì)含量較少，其無(wú)需再純化，節(jié)省了程序，降低了生產(chǎn)成本。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物、探針、內(nèi)標(biāo)、用于內(nèi)標(biāo)檢測(cè)的上游引物、下游引物和探針均引用自中國(guó)專利申請(qǐng)CN103060473A一種皰疹類病毒EBV檢測(cè)試劑盒，其中，用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物序列為5’-TGCAGCTTTGACGATGGAGTAG-3’，下游引物序列為5’-TCACTCCTGCCCTTCCTCAC-3，探針序列為5’-FAM-TTTGCCTCCCTGGTTTCCACCTATG-BHQ1-3’，所述內(nèi)標(biāo)的序列為5-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACCTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3，所述PCR反應(yīng)液還包括用于內(nèi)標(biāo)檢測(cè)的上游引物、下游引物和探針；所述內(nèi)標(biāo)上游引物序列為5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’，所述內(nèi)標(biāo)下游引物序列為5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’，所述內(nèi)標(biāo)探針的序列為5’-HEX-TTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA–BHQl-3’。進(jìn)一步地，所述親水石墨烯由以下步驟制得：取經(jīng)過(guò)透析處理，已除去殘留離子的Hummers法制備的氧化石墨，配制成0.2～0.8mg/ml的水溶液，按氧化石墨：六次甲基四胺為2∶1～1∶2的質(zhì)量比加入六次甲基四胺，100℃攪拌回流反應(yīng)8～12h，得到分散均勻的親水石墨烯分散系。進(jìn)一步地，所述試劑盒終還包括內(nèi)標(biāo)、核酸洗脫液、磁珠洗滌液、EBV陰性對(duì)照、EBV陽(yáng)性對(duì)照、EBV定量參考品、磁珠分散劑和酶混合液。進(jìn)一步地，所述磁珠分散劑包括氨基酸0.06～2份、乙酸0.5～2份和羧甲基葡聚糖2～5份。雖然利用核酸釋放劑和磁珠吸附能夠較好的吸附核酸，但是，在后期核酸洗脫過(guò)程中，由于磁珠黏附在離心管壁上，增加了洗脫程序的難度，需要反復(fù)多次進(jìn)行洗脫，反復(fù)的洗脫一方面增加了工序，另一方面容易使核酸丟失，從而影響了試劑盒的準(zhǔn)確度。于是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種磁珠分散劑，其可以分散磁珠，且其不會(huì)降低免疫反應(yīng)。值得說(shuō)明的是，分散劑可以以任何濃度加入，只要他們以這樣的濃度加入，可以發(fā)揮前面所述的效果即可。具體地說(shuō)，當(dāng)分散劑加入到樣本中時(shí)，按照0.01～5μg/μl的濃度加入，優(yōu)選是0.6～2μg/μl。其中，分散劑包括氨基酸0.06～2份、乙酸0.5～2份和羧甲基葡聚糖2～5份。更優(yōu)選地，所述分散劑包括氨基酸0.15份、乙酸0.8份和羧甲基葡聚糖3.5份。優(yōu)選地，所述氨基酸選自甘氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸中的一種。更優(yōu)選地，氨基酸選自甘氨酸。進(jìn)一步地，所述核酸洗脫液含有0.8～1.2mol/LTris-HCl、0.1～1.0mol/LEDTA；所述磁珠洗滌液包含0.1～1.0％曲拉通(v/v)、100～300mmol/L氯化鈉；所述酶混合液中包含Taq聚合酶和0.5～2U/μl的UNG酶。其中，UNG酶的功能是降解含有dU的PCR產(chǎn)物，利用UNG酶和PCR反應(yīng)液中的dUTP可以起到預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的作用，從而防止樣本檢測(cè)假陽(yáng)性。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了一種利用上述的試劑盒檢測(cè)人類皰疹病毒4型的方法，包括以下步驟：A)裂解病毒：取四個(gè)離心管，分別加入5～10μl核酸釋放劑和10～15μl待測(cè)樣本、5～10μl核酸釋放劑和6～10μlEBV陰性對(duì)照、5～10μl核酸釋放劑和6～10μlEBV陽(yáng)性對(duì)照以及5～10μl核酸釋放劑和6～10μlEBV定量參考品，做好標(biāo)記，充分混合均勻，于室溫下放置3～5min，備用；B)磁珠吸附：往上述4個(gè)離心管中均加入含磁珠的核酸提取液和內(nèi)標(biāo)，離心，用磁珠分離器進(jìn)行固液分離，此時(shí)離心管壁上的固體含磁珠和核酸，加入磁珠洗滌液，再次離心，用磁珠分離器進(jìn)行固液分離，此時(shí)離心管壁上的固體含磁珠和核酸；C)核酸洗脫：往上述離心管中加入核酸洗脫液和分散劑，使得磁珠和核酸分開，離心，分離磁珠，保留離心管中的液體；D)PCR熒光分析：按照待測(cè)樣本、EBV陰性對(duì)照、EBV陽(yáng)性對(duì)照、EBV定量參考品的數(shù)量配制PCR反應(yīng)液，將經(jīng)步驟C)處理后的待測(cè)樣本、EBV陰性對(duì)照、EBV陽(yáng)性對(duì)照和EBV定量參考品分別與PCR反應(yīng)液和酶混合液混合后加入到PCR反應(yīng)板的各孔中，去除氣泡后蓋好封膜，1000～3000rpm/min離心30s，用于熒光分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有以下優(yōu)勢(shì)：1)本發(fā)明試劑盒具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確度高，特異性好，檢測(cè)范圍寬的優(yōu)點(diǎn)，為臨床診斷EBV感染提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2)本發(fā)明試劑盒中核酸釋放劑能夠迅速破壞EBV病毒顆粒外殼蛋白結(jié)構(gòu)，釋放EBV核酸，進(jìn)一步通過(guò)磁珠捕捉核酸，兩者結(jié)合使核酸提取率明顯提高，提取過(guò)程變得簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，且后續(xù)無(wú)需再進(jìn)行純化，降低了生產(chǎn)成本，取得了積極的效果。具體實(shí)施方式：以下通過(guò)具體實(shí)施方式的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明表面活性肽購(gòu)自Sigma公司。實(shí)施例1、一種人類皰疹病毒4型檢測(cè)試劑盒本發(fā)明實(shí)施例1包括以下組分：①核酸釋放劑：在無(wú)菌水中加入表面活性肽使終濃度達(dá)到0.2mg/ml、加入醋酸氯己定使終濃度達(dá)到0.03mg/ml、加入氯化鉀使終濃度達(dá)到4.5％(w/v)以及加入親水石墨烯使終濃度達(dá)到1.2％的(w/v)。親水石墨烯的制備方法：取經(jīng)過(guò)透析處理，已除去殘留離子的Hummers法制備的氧化石墨，配制成0.5mg/ml的水溶液，按氧化石墨：六次甲基四胺為2∶1的質(zhì)量比加入六次甲基四胺，100℃攪拌回流反應(yīng)12h，得到分散均勻的親水石墨烯分散系。②含磁珠的核酸提取液：200mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸、200mmol/L氯化鈉和250μg/ml磁珠，用無(wú)菌水定容至1L。③內(nèi)標(biāo)：為插入pUC18T載體的一段長(zhǎng)為100堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體，即質(zhì)粒，濃度為2.00E+05copies/ml，100堿基對(duì)的序列為：5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。④PCR反應(yīng)液：包括10×PCR反應(yīng)緩沖液5μl，0.2mmol/L的脫氧核糖核苷三磷酸，0.3μmol/L用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上、下游引物，0.3μmol/L用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，0.3μmol/L用于內(nèi)標(biāo)片段擴(kuò)增的上下游引物，0.1μmol/L用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針為。其中，所述10×PCR反應(yīng)緩沖液為包括pH7.5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、30mmol/L氯化鎂溶液、500mmol/L氯化鉀溶液、0.2％的曲拉通溶液和10％的甲酰胺溶液；所述脫氧核糖核苷三磷酸包括dATP、dCTP、dUTP和dGTP；所述用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物及用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針是源于EB病毒核酸的保守區(qū)域的引物和探針，其堿基序列分別為：上游引物：5’-TGCAGCTTTGACGATGGAGTAG-3’；下游引物：5’-TCACTCCTGCCCTTCCTCAC-3’；探針：5’-FAM-TTTGCCTCCCTGGTTTCCACCTATG-BHQ1-3’；所述的用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的引物探針序列分別為：上游引物：5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’，下游引物：5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’，探針：5’-HEX-TTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA-BHQl-3’。⑤磁珠分散劑：含氨基酸0.15份、乙酸0.8份和羧甲基葡聚糖3.5份。⑥核酸洗脫液：含有1.2mol/LTris-HCl、0.5mol/LEDTA的無(wú)菌水。⑦磁珠洗滌液：包含0.5％曲拉通(v/v)、200mmol/L氯化鈉的無(wú)菌水。⑧酶混合液：包含Taq聚合酶和0.5～2U/μl的UNG酶。⑨EBV陰性對(duì)照：為陰性血清。⑩EBV陽(yáng)性對(duì)照：為陰性血清稀釋的B958細(xì)胞的培養(yǎng)的上清液，濃度為4.00E+05copies/ml。EBV定量參考品：將濃度為4.00E+08copies/ml標(biāo)準(zhǔn)品按照10倍倍比稀釋至4.00E+01copies/ml，稀釋八個(gè)梯度，并以此八個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品作為EBV定量參考品。實(shí)施例2、用實(shí)施例1所述試劑盒檢測(cè)EBV的方法一、制備待測(cè)樣本制備血清樣本：選用新抽取的靜脈血，常溫放置25～35min后，于2000rpm/min離心2～4min，吸取上清，并移至干凈的EP管中待用。二、核酸提取A)裂解病毒：取四個(gè)離心管，分別加入6μl核酸釋放劑和12μl步驟一)中制備的待測(cè)樣本、6μl核酸釋放劑和8μlEBV陰性對(duì)照、6μl核酸釋放劑和8μlEBV陽(yáng)性對(duì)照以及6μl核酸釋放劑和8μlEBV定量參考品，做好標(biāo)記，充分混合均勻，于室溫下放置3min，備用；B)磁珠吸附：往上述4個(gè)離心管中均加入100μl含磁珠的核酸提取液和4μl內(nèi)標(biāo)，離心，用磁珠分離器進(jìn)行固液分離，此時(shí)離心管壁上的固體含磁珠和核酸，加入100μl磁珠洗滌液，再次離心，用磁珠分離器進(jìn)行固液分離，此時(shí)離心管壁上的固體含磁珠和核酸；C)核酸洗脫：往上述離心管中加入50μl核酸洗脫液和25μg分散劑，使得磁珠和核酸分開，離心，分離磁珠，保留離心管中的液體；D)PCR熒光分析：按照待測(cè)樣本、EBV陰性對(duì)照、EBV陽(yáng)性對(duì)照、EBV定量參考品的數(shù)量配制PCR反應(yīng)液，將經(jīng)步驟C)處理后的待測(cè)樣本、EBV陰性對(duì)照、EBV陽(yáng)性對(duì)照和EBV定量參考品分別與PCR反應(yīng)液和酶混合液加入到PCR反應(yīng)板的各孔中，去除氣泡后蓋好封膜，1000～3000rpm/min離心30s，用于熒光分析。三、熒光PCR反應(yīng)與結(jié)果分析首先將上述PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽內(nèi)，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置定量參考品濃度；選擇FAM通道檢測(cè)EBV；選擇HEX或VIX通道檢測(cè)內(nèi)標(biāo)；參比熒光設(shè)置為none，熒光定量PCR反應(yīng)條件如下表1所示。表1熒光定量PCR反應(yīng)條件結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束后，利用儀器自帶的軟件進(jìn)行自動(dòng)分析，擴(kuò)增曲線與閾值線的交點(diǎn)為Ct值，軟件根據(jù)樣本的Ct值的大小，通過(guò)八個(gè)濃度梯度的定量參考品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以自動(dòng)求得樣本的定量檢測(cè)結(jié)果。只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始載量。如果測(cè)定Ct值≤39(Ct值＞0)且待測(cè)樣本的擴(kuò)增曲線呈S型，可以判斷EBV-DNA陽(yáng)性；如果無(wú)Ct值顯示，待測(cè)樣本擴(kuò)增曲線平直，且內(nèi)標(biāo)檢測(cè)為陽(yáng)性(Ct值≤39)，可以判斷EBV-DNA陰性；如果測(cè)定待測(cè)樣本Ct值＞39，同時(shí)內(nèi)標(biāo)檢測(cè)為陽(yáng)性(Ct值≤39)，可以判斷為低于檢測(cè)下限；如果內(nèi)標(biāo)Ct值＞39或內(nèi)標(biāo)顯示無(wú)Ct值，則判斷該待測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。試驗(yàn)例一、本發(fā)明試劑盒與中國(guó)專利申請(qǐng)CN103060473A試劑盒性能比較1.1準(zhǔn)確度測(cè)試取本發(fā)明實(shí)施例1所述試劑盒和對(duì)照組(中國(guó)專利申請(qǐng)CN103060473A試劑盒)分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品1和標(biāo)準(zhǔn)品2進(jìn)行測(cè)定，其中標(biāo)準(zhǔn)品1中濃度為4.00E+08copies/ml，標(biāo)準(zhǔn)品2中濃度為4.00E+01copies/ml標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)試劑盒重復(fù)測(cè)定三次，測(cè)定結(jié)果如表2和表3所示。表2本發(fā)明試劑盒對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品1的測(cè)定結(jié)果組別第1次(copies/ml)第2次(copies/ml)第3次(copies/ml)平均值(copies/ml)偏差(％)實(shí)施例14.05E+084.08E+083.97E+084.03E+080.75％對(duì)照組4.22E+084.08E+084.56E+084.28E+087％表3本發(fā)明試劑盒對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品2的測(cè)定結(jié)果組別第1次(copies/ml)第2次(copies/ml)第3次(copies/ml)平均值(copies/ml)偏差(％)實(shí)施例14.02E+014.01E+014.20E+014.07E+011.75％對(duì)照組4.24E+014.08E+014.32E+014.21E+015.25％由表2和表3可知，本發(fā)明試劑盒與對(duì)照組相比，具有更高的準(zhǔn)確度，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品1和標(biāo)準(zhǔn)品2的檢測(cè)偏差較小。1.2精密度測(cè)試取本發(fā)明實(shí)施例1所述試劑盒和對(duì)照組(中國(guó)專利申請(qǐng)CN103060473A試劑盒)對(duì)同一待測(cè)樣本進(jìn)行多次反復(fù)測(cè)定，對(duì)所得的結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差SD和變異系數(shù)CV計(jì)算。結(jié)果顯示，本發(fā)明試劑盒具有更高的精密度，其批內(nèi)變異系數(shù)為3.82％，批間變異系數(shù)為5.68％，對(duì)照組批內(nèi)變異系數(shù)為8.53％，批間變異系數(shù)為23.42％。1.3特異性測(cè)試1.3.1特異性：用本發(fā)明實(shí)施例1以及對(duì)照組(中國(guó)專利申請(qǐng)CN103060473A試劑盒)所述試劑盒分別檢測(cè)健康獻(xiàn)血員血清206份，檢測(cè)結(jié)果如表4所示。表4檢測(cè)結(jié)果由表4可知，用本發(fā)明實(shí)施例1所述試劑盒檢測(cè)健康血清206例，檢出陽(yáng)性0例，陽(yáng)性率為0％，結(jié)果差異無(wú)顯著性，試劑盒的特異性為100％。值得說(shuō)明的是，用對(duì)照組所述試劑盒檢測(cè)健康血清206例，檢出陽(yáng)性8例，陽(yáng)性率為2.9％，這說(shuō)明，與對(duì)照組相比，本發(fā)明試劑盒具有更好的特異性。試驗(yàn)例二、不同核酸核酸釋放劑對(duì)血清EBV核酸提取的影響1.1試驗(yàn)試劑盒：除核酸釋放劑的組成不同外，設(shè)置4種試劑盒，分別是：試劑盒①(核酸釋放劑為含表面活性肽0.2mg/ml、醋酸氯己定0.03mg/ml、氯化鉀4.5％(w/v)、親水石墨烯1.2％的(w/v)的無(wú)菌水)、試劑盒②(所述核酸釋放劑為含表面活性肽0.2mg/ml、氯化鉀4.5％(w/v)和親水石墨烯1.2％的(w/v的無(wú)菌水)、試劑盒③(所述核酸釋放劑為含表面活性肽0.2mg/ml、醋酸氯己定0.03mg/ml、氯化鉀4.5％(w/v)的無(wú)菌水)以及試劑盒④(中國(guó)專利申請(qǐng)CN103060473A所述核酸釋放劑，含莎梵婷0.1mM/L，氯化鉀100mM/L，十二烷基磺酸鈉0.1和乙醇0.1％的TE緩沖液)。1.2檢測(cè)：利用上述4種試劑盒按照本發(fā)明實(shí)施例2所述方法對(duì)5例EBV陽(yáng)性血清(標(biāo)記為A、BC、D、E)進(jìn)行核酸提取和檢測(cè)，4種試劑盒對(duì)5例EBV陽(yáng)性血清定量檢測(cè)結(jié)果如表5所示。表54種試劑盒對(duì)5例EBV陽(yáng)性血清的定量檢測(cè)結(jié)果結(jié)果分析：由表5可知，與中國(guó)專利CN103060473A所述核酸釋放劑相比，含有本發(fā)明核酸釋放劑的試劑盒能夠更準(zhǔn)確的定量；另外，改變了本發(fā)明核酸釋放劑的組成，其對(duì)試劑盒的定量結(jié)果影響較大，加入醋酸氯己定和親水石墨烯更有利于試劑盒的準(zhǔn)確定量。試驗(yàn)例三、不同分散劑組成對(duì)磁珠聚集現(xiàn)象的影響除分散劑組成不同外，設(shè)置4種試劑盒，利用各試劑盒按照實(shí)施例2所述檢測(cè)方法對(duì)血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，目測(cè)磁珠在離心管上的黏附和聚集現(xiàn)象，記錄結(jié)果如表6。表6不同分散劑組成對(duì)磁珠聚集現(xiàn)象的影響分散劑組成磁珠粒在離心管上黏附磁珠的聚集氨基酸0.15份、乙酸0.8份和羧甲基葡聚糖3.5份沒(méi)有沒(méi)有不含分散劑存在存在氨基酸0.15份和乙酸0.8份存在存在氨基酸0.2份和羧甲基葡聚糖3.5份存在沒(méi)有由上表可知，當(dāng)存在分散劑時(shí)，磁珠沒(méi)有出現(xiàn)在反應(yīng)容器內(nèi)壁上黏附和相互聚集現(xiàn)象，后續(xù)無(wú)需重復(fù)洗脫，節(jié)省了操作工序和成本。當(dāng)不加入分散劑時(shí)，磁珠在離心管的內(nèi)壁上有非常嚴(yán)重的黏附現(xiàn)象，且磁珠之間相互聚集，后續(xù)洗脫過(guò)程中無(wú)法順利的進(jìn)行，需要進(jìn)行多次重復(fù)洗脫。值得說(shuō)明的是，即使是改變分散劑的組成或者改變各組分的用量也會(huì)引起磁珠的聚集，如當(dāng)去掉羧甲基葡聚糖時(shí)，磁珠有明顯的黏附和聚集現(xiàn)象，當(dāng)去掉乙酸時(shí)，容易使得磁珠在離心管內(nèi)壁上黏附。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3