本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)提取純化領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種高效且可維持蛋白活性的毒素蛋白的純化方法。

背景技術(shù)：

毒素-抗毒素系統(tǒng)廣泛存在于環(huán)境微生物和病原微生物的基因組中，在腸道益生菌中也有發(fā)現(xiàn)，且毒素-抗毒素系統(tǒng)在可移動遺傳元件中出現(xiàn)的頻率高于基因組的其它位置，這引起了國際微生物學(xué)界的高度關(guān)注。毒素-抗毒素系統(tǒng)是由一個穩(wěn)定的毒素蛋白和一個不穩(wěn)定的抗毒素組成。毒素-抗毒素系統(tǒng)最早發(fā)現(xiàn)存在于低拷貝的質(zhì)粒上，并在維持質(zhì)粒穩(wěn)定性中起著關(guān)鍵作用，目前已有實驗結(jié)果證實成對存在可以有效調(diào)控質(zhì)粒的穩(wěn)定性。此外，近年的研究還發(fā)現(xiàn)毒素-抗毒素系統(tǒng)還具有重要的生理學(xué)功能如基因組的穩(wěn)定，細菌生物被膜的形成，細菌持續(xù)性感染(persistedcellformation)，控制生長以及細胞的程序性死亡等相關(guān)聯(lián)，因此毒素-抗毒素的研究越來越被重視，越來越被關(guān)注。特別是在不同的抗生素、高溫和營養(yǎng)匱乏等壓力條件刺激下，毒素-抗毒素系統(tǒng)會被激活，而毒素-抗毒素系統(tǒng)被激活的機制是抗毒素蛋白很不穩(wěn)定并且很容易在壓力條件被激活的各種蛋白酶所降解，從而釋放出毒素蛋白，游離的毒素蛋白再行使它的功能。毒素蛋白在體內(nèi)的作用靶點是多樣的，包括dna復(fù)制，mrna的穩(wěn)定性，蛋白的合成，細胞壁的合成及atp的合成，然而毒素蛋白的生化功能研究一直滯后其他蛋白的研究進展，歸因于毒素蛋白的純化的確存在很大的困難，這些毒素都是小分子蛋白(<100個氨基酸)，且在大量表達時可導(dǎo)致宿主菌死亡，難以得到一定數(shù)量的毒素蛋白。

目前文獻中毒素蛋白的純化可以通過以下這些方法得到：1.可直接通過構(gòu)建誘導(dǎo)型質(zhì)粒異源表達毒素蛋白，然后通過親和層析柱直接純化毒素蛋白。但這種純化方法局限性很大，只能用于小部分的毒性較低的毒素蛋白的純化；2.通過構(gòu)建誘導(dǎo)型質(zhì)?？梢酝瑫r表達毒素蛋白與抗毒素蛋白，毒素與抗毒素蛋白形成復(fù)合物，再用強的變性劑處理蛋白復(fù)合物，使抗毒素-毒素蛋白復(fù)合物失活從而游離出毒素蛋白，再通過復(fù)性的方法使毒素蛋白的活性恢復(fù)，但是這種蛋白純化方法的缺點很明顯，復(fù)性后蛋白活性大部分很難得到恢復(fù)，有活性的毒素蛋白純度低；3.通過篩選減毒宿主菌，再在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)型質(zhì)粒異源表達毒素蛋白、進行純化，但是這種蛋白純化的方法很難實現(xiàn)，篩選減毒宿主菌的困難很大，耗時太長，成功率低，經(jīng)濟價值不高。

有鑒于此，確有必要提供一種高效且可維持蛋白活性的毒素蛋白的純化方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：克服現(xiàn)有毒素蛋白分離純化時容易出現(xiàn)的蛋白純度低、活性差、耗時長等問題，提供一種高效且可維持蛋白活性的毒素蛋白的純化方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，首先要解決的問題是毒素蛋白在宿主體內(nèi)的積累，因為毒素蛋白的純化首先需要蛋白的積累達到一定的數(shù)量，但是毒素蛋白的積累對宿主又是致死的，因此是很矛盾的技術(shù)問題；毒素蛋白之所以能在體內(nèi)表達并存在是因為抗毒素蛋白的存在可以中和毒素蛋白的毒性，因此，我們通過將毒素蛋白和抗毒素蛋白在同一宿主體內(nèi)進行共同表達，這樣就既可以積累毒素蛋白又可以中和毒素蛋白的毒性。在得到毒素蛋白和抗毒素蛋白的復(fù)合物之后，怎么得到有活性的毒素蛋白才是最關(guān)鍵的技術(shù)問題，通過強化學(xué)試劑去破壞毒素蛋白與抗毒素蛋白的相互作用，雖然可以將毒素蛋白與抗毒素蛋白分離開，但是毒素蛋白的活性得不到保證，復(fù)性后的毒素蛋白的活性也不高，因此，我們希望能找到一種方法可以在溫和的實驗條件既能將毒素蛋白與抗毒素蛋白之間的相互作用消除，又能不破壞毒素蛋白的活性。通過大量的菌株篩選發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌scsio6842的全細胞裂解液可以特異性水解毒素-抗毒素復(fù)合物中的抗毒素組分，而不降解毒素蛋白，再通過親和層析柱純化出毒素蛋白。

因此，本發(fā)明提供一種假交替單胞菌scsio6842，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為中國.北京，保藏號為cgmcc1.15540，保藏日為2016年2月23日。

一種毒素蛋白的純化方法，其是利用上述假交替單胞菌scsio6842完成的，包括如下步驟：

(1)將含有能特異性降解抗毒素蛋白的蛋白酶的假交替單胞菌scsio6842的菌體破碎得到全細胞裂解液；

(2)將毒素基因和抗毒素基因擴增并克隆到表達載體中，誘導(dǎo)表達載體同時表達毒素蛋白和抗毒素蛋白，得到毒素蛋白和抗毒素蛋白的復(fù)合物；

(3)對毒素蛋白和抗毒素蛋白復(fù)合物進行純化；

(4)將步驟(1)所得全細胞裂解液與步驟(3)所得復(fù)合物混合靜置反應(yīng)，使毒素蛋白分離出來并進行純化、脫鹽，得到毒素蛋白。

作為本發(fā)明毒素蛋白的純化方法的一種改進，步驟(1)中，所述菌體破碎是采用高壓細胞破碎法。

作為本發(fā)明毒素蛋白的純化方法的一種改進，步驟(3)中，所述純化是蛋白親和層析純化。

作為本發(fā)明毒素蛋白的純化方法的一種改進，步驟(4)中，所述細胞裂解液與復(fù)合物的體積比為5:3。

作為本發(fā)明毒素蛋白的純化方法的一種改進，步驟(4)中，所述靜置反應(yīng)的時間為1～2h。

作為本發(fā)明毒素蛋白的純化方法的一種改進，步驟(4)中，所述混合靜置反應(yīng)的溫度為25℃。

作為本發(fā)明毒素蛋白的純化方法的一種改進，步驟(4)中，所述純化是蛋白親和層析純化。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明篩選出能特異性降解抗毒素蛋白的蛋白酶的菌株假交替單胞菌scsio6842，還建立了基于蛋白酶能特異性降解抗毒素蛋白而純化出高活性毒素蛋白的新方法，并具有如下特點：

1)本發(fā)明純化方法周期短，不需要花費大量時間去篩選減毒菌株(即使篩選到減毒菌株也不一定適用于毒素蛋白的純化，成功率低)；

2)本發(fā)明純化方法步驟簡單容易操作，只需利用全細胞裂解液中的蛋白酶直接降解抗毒素蛋白即可達到去除抗毒素蛋白的目的，不需要進行變性再復(fù)性等繁雜步驟以去除抗毒素蛋白；

3)本發(fā)明純化方法避免使用強化學(xué)試劑以消除毒素蛋白與抗毒素蛋白之間的相互作用，因此本發(fā)明方法具有高效性，所得的毒素蛋白純度高，活性好；

4)本發(fā)明純化方法屬于經(jīng)濟型技術(shù)，只需收集菌體進行裂解即可得到全細胞裂解液，無需使用昂貴的化學(xué)試劑，也不需要對蛋白進行提純處理，成本較低。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實施方式，對本發(fā)明毒素蛋白的純化方法及其有益效果進行詳細說明。

圖1為體內(nèi)的毒素蛋白(copt)與抗毒素蛋白(copg)之間的相互作用的檢測結(jié)果圖。

圖2為抗毒素蛋白降解的檢測結(jié)果圖，其中，a表示抗毒素蛋白以單一成分或與毒素蛋白的復(fù)合物形式存在，抗毒素蛋白極易被scsio6842的全細胞裂解液降解；b表示抗毒素蛋白的降解；c標識抗毒素蛋白的降解是從c端開始。

圖3為scsio6842全細胞裂解液中的蛋白類降解抗毒素蛋白，其中，泳道1～4分別表示scsio6842全細胞裂解液處理抗毒素蛋白的時間為0、20、30和60min，泳道5為沸水浴10min后的scsio6842全細胞裂解液處理抗毒素蛋白的結(jié)果。

圖4為毒素蛋白的純度及活性檢測結(jié)果示意圖，其中，a表示通過tricine-sds-page檢測純化后的毒素蛋白copgt，b表示dna促旋酶抑制實驗結(jié)果。

具體實施方式

假交替單胞菌scsio6842全細胞裂解液的準備

(1)-80℃保存的菌株scsio6842，劃線2216e平板，25℃培養(yǎng)箱靜置過夜；

(2)挑取單菌落于含25ml新鮮2216e培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，25℃培養(yǎng)箱，220rpm震蕩培養(yǎng)12小時；

(3)以1:100轉(zhuǎn)接于含300ml新鮮的2216e培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中，220rpm震蕩培養(yǎng)5-6小時(至對數(shù)期)。這么做是因為對數(shù)期菌體的酶活力最高。

(4)12,000rpm低溫離心10min，收集菌體，去除上清。低溫收集的目的是盡量維持酶的活性；

(5)加入10ml細胞裂解液(50mmkh2po4buffer(ph8.0),300mmnacl,5mm咪唑)，小型渦旋器中充分重懸菌體；

(6)超聲波破碎或高壓細胞破碎細胞，高壓細胞破碎的時間短，優(yōu)選考慮；

(7)將破碎完的全細胞裂解液離心，10,000rpm低溫離心60min，取上清，置于冰上或4℃冰箱備用。長時間離心可充分去除菌體，防止菌株影響后續(xù)的蛋白純化。

毒素蛋白與抗毒素蛋白復(fù)合物的純化

(1)pcr將毒素基因和抗毒素基因一起擴增，一起克隆到同一個蛋白誘導(dǎo)表達載體pet28b，再轉(zhuǎn)化宿主細胞e.colibl21(de3)。毒素表達基因與抗毒素表達基因一般是共轉(zhuǎn)錄的，只需一輪pcr就可以將其克隆到，為了毒素蛋白的純化，將組氨酸標簽與毒素蛋白的c端進行了融合。

(2)挑取轉(zhuǎn)化子置于25ml新鮮lb培養(yǎng)基的250ml三角瓶(含25μg/ml卡那霉素，維持質(zhì)粒的存在)中，37℃培養(yǎng)箱，220rpm震蕩培養(yǎng)12小時；

(3)以1:100轉(zhuǎn)接于含300ml新鮮的lb培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中(含25μg/ml卡那霉素),220rpm震蕩培養(yǎng)od600＝0.8時，加入300μliptg(終濃度為1mm)進行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)5-6小時。

(4)12,000rpm低溫離心10min，收集菌體，去除上清。

(5)加入10ml細胞裂解液(50mmkh2po4buffer(ph8.0),300mmnacl,5mm咪唑)，小型渦旋器中充分重懸菌體，并加入蛋白酶抑制劑pmsf，防止蛋白被外來的蛋白酶降解。

(6)高壓細胞破碎儀破碎細胞，10,000rpm低溫離心60min，收集上清；

(7)利用蛋白親和層析柱ni-ntaresin(qiagen)對上述的毒素蛋白和抗毒素蛋白的復(fù)合物進行蛋白純化。因為ii型的毒素蛋白可以與抗毒素蛋白直接相互作用，而且相互作用比較強(請參見圖1)；其相互作用的原理是抗毒素的c端與毒素蛋白直接進行相互作用，而抗毒素蛋白的c端又是scsio6842細胞裂解液降解的靶標位置(請參見圖2)；在只有毒素蛋白融合了組氨酸標簽的復(fù)合物中，親和層析柱會特異地將毒素蛋白截留，而毒素蛋白又可以通過蛋白-蛋白相互作用將抗毒素蛋白進行截留，因此，純化后的蛋白是毒素蛋白和抗毒素蛋白的混合物；

(8)tricine-sds-page蛋白膠檢測蛋白純化。

毒素蛋白的純化及檢測

(1)將scsio6842全細胞裂解液與純化后的毒素蛋白與抗毒素蛋白復(fù)合物以5:3比例混合均勻，置于25℃培養(yǎng)箱靜置1-2小時。我們通過實驗已經(jīng)驗證全細胞裂解中降解蛋白的主要成分是蛋白酶類(請參見圖3)；scsio6842細胞裂解液會特異性從抗毒素的c端進行逐級降解，而c端又是與毒素的結(jié)合位點，從而解除了毒素蛋白與抗毒素蛋白的相互作用，毒素蛋白被游離出來；又因為scsio6842的最適生長溫度是在25℃，為了保證反應(yīng)中酶活的存在，所以反應(yīng)溫度選擇在25℃；同時因為毒素-抗毒素系統(tǒng)的差異會導(dǎo)致蛋白的差異，可以適當?shù)恼{(diào)整反應(yīng)時間。

(2)后續(xù)的蛋白純化步驟同上毒素蛋白與抗毒素蛋白復(fù)合物的純化；

(3)tricine-sds-page蛋白膠檢測純化后的毒素蛋白。因為毒素蛋白和抗毒素蛋白都是小分子蛋白，因此用小分子蛋白分離膠檢測更為合適。

(4)純化后的蛋白利用脫鹽柱(sephadex-g-25-pre-packedpd-10columns)進行脫鹽處理；脫鹽后的蛋白用tricine-sds-page檢測。

(5)利用蛋白定量試劑盒(biyuntianbcaassaykit(haimen,china))對脫鹽的蛋白進行定量。

(6)利用蛋白活性檢測試劑盒進行活性檢測，得到活性好，純度高的毒素蛋白。

實施例1

以假交替單胞菌中的copga-copgt毒素-抗毒素系統(tǒng)為例：

copga-copgt毒素-抗毒素系統(tǒng)中的毒素蛋白copgt通過ncbi及多序列比對發(fā)現(xiàn)，其屬于pare家族蛋白，活性為dna促旋酶抑制劑。

1.假交替單胞菌scsio6842全細胞裂解液的準備：

(1)-80℃保存的菌株scsio6842，劃線2216e平板，25℃培養(yǎng)箱靜置過夜；

(2)挑取單菌落于含25ml新鮮2216e培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，25℃培養(yǎng)箱，220rpm震蕩培養(yǎng)12小時；

(3)以1:100轉(zhuǎn)接于含300ml新鮮的2216e培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中,220rpm震蕩培養(yǎng)6小時(至對數(shù)期)；

(4)12,000rpm低溫離心10min，收集菌體，去除上清；

(5)加入10ml細胞裂解液(50mmkh2po4buffer(ph8.0),300mmnacl,5mm咪唑)，小型渦旋器中充分重懸菌體；

(6)高壓破碎儀破碎細胞。

(7)10,000rpm，4℃離心60min，取上清，置于冰上或4℃冰箱備用。

2.毒素蛋白copgt與抗毒素蛋白copga復(fù)合物的純化：

(1)利用設(shè)計基因兩側(cè)的引物，pcr將毒素表達基因copgt和抗毒素表達基因copga一起擴增，通過酶切、連接，將其克隆到同一個蛋白誘導(dǎo)表達載體pet28b，再轉(zhuǎn)化宿主細胞e.colibl21(de3)。。

(2)挑取轉(zhuǎn)化子置于25ml新鮮lb培養(yǎng)基的250ml三角瓶(含25μg/ml卡那霉素，維持質(zhì)粒的存在)中，37℃培養(yǎng)箱，220rpm震蕩培養(yǎng)12小時；

(3)以1:100轉(zhuǎn)接于含300ml新鮮的lb培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中(含25μg/ml卡那霉素),220rpm震蕩培養(yǎng)od600＝0.8時，加入300μliptg(終濃度為1mm)進行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)5-6小時；

(4)12,000rpm低溫離心10min，收集菌體，去除上清；

(5)加入10ml細胞裂解液(50mmkh2po4buffer(ph8.0),300mmnacl,5mm咪唑)，小型渦旋器中充分重懸菌體，并加入蛋白酶抑制劑pmsf；

(6)高壓細胞破碎儀破碎細胞，10,000rpm低溫離心60min，收集上清；

(7)利用蛋白親和層析柱ni-ntaresin(qiagen)對上述的毒素蛋白和抗毒素蛋白的復(fù)合物進行蛋白純化；

(8)tricine-sds-page蛋白膠檢測蛋白純化(請參見圖1)。

3.毒素蛋白copgt的純化及檢測

(1)將scsio6842全細胞裂解液與純化后的毒素蛋白與抗毒素蛋白復(fù)合物以5:3比例混合均勻，置于25℃培養(yǎng)箱靜置1小時。

(2)后續(xù)的蛋白純化步驟同上毒素蛋白與抗毒素蛋白復(fù)合物的純化；

(3)tricine-sds-page蛋白膠檢測純化后的毒素蛋白(請參見圖4a)；

(4)純化后的蛋白利用脫鹽柱(sephadex-g-25-pre-packedpd-10columns)進行脫鹽處理；脫鹽后的蛋白用tricine-sds-page檢測。

(5)利用蛋白定量試劑盒(biyuntianbcaassaykit(haimen,china))對脫鹽的蛋白進行定量。

(6)利用蛋白活性檢測試劑盒對毒素蛋白copgt進行活性檢測(體系：1.02nm超螺旋dnapuc19,35mmtris-hcl,24mmkcl,4mmmgcl2,2mmdtt,1.8mmspermidine,1mmatp,6.5％glycerol,and0.1mg/mlbsa,0.5mmciprofloxacin(簡稱cip),30nmdnagyrase(簡稱gry)(newenglandbiolabs)，其中copt為毒素蛋白copgt的簡稱、inactivedcopgt為沸水處理后的毒素蛋白copgt、copgt為copga-copgt的蛋白復(fù)合物。30℃反應(yīng)3.5小時，加入50μg/mlproteinasekand1％sds終止反應(yīng)。)，最終的得到有活性，純度高的毒素蛋白(請參見圖4b)。

本發(fā)明篩選出能特異性降解抗毒素蛋白的蛋白酶的菌株假交替單胞菌scsio6842，還建立了基于蛋白酶能特異性降解抗毒素蛋白而純化出高活性毒素蛋白的新方法，具有蛋白活性高、操作簡單、成本低等優(yōu)點，具有良好的應(yīng)用前景。

為了使本發(fā)明的發(fā)明目的、技術(shù)方案和有益技術(shù)效果更加清晰，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解的是，本說明書中描述的實施例僅僅是為了解釋本發(fā)明，并非為了限定本發(fā)明，實施例的配方、比例等可因地制宜做出選擇而對結(jié)果并無實質(zhì)性影響。

根據(jù)上述說明書的揭示和教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以對上述實施方式進行適當?shù)淖兏托薷?。因此，本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的具體實施方式，對本發(fā)明的一些修改和變更也應(yīng)當落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。此外，盡管本說明書中使用了一些特定的術(shù)語，但這些術(shù)語只是為了方便說明，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。