本發(fā)明涉及一種制備重組人IL-12親和純化層析柱的工藝、由該工藝制得的重組人IL-12親和純化層析柱、及用該親和純化層析柱純化重組人IL-12的方法。具體地說，本發(fā)明涉及用抗人IL-12的雜交瘤細胞株制備抗人IL-12單克隆抗體，并用該抗體制備重組人IL-12親和純化層析柱，然后用該親和純化層析柱純化重組人IL-12的工藝流程。

背景技術(shù)：
重組人白細胞介素12(IL-12)最初稱作自然殺傷細胞刺激因子(naturalkillercellstimulatoryfactor，NKSF)或細胞毒性淋巴細胞成熟因子(cytotoxiclymphocytematurationfactor，CLMF)，主要是由激活的單核細胞和其他類型的細胞(樹突狀細胞、B細胞、中性粒細胞以及角質(zhì)細胞)產(chǎn)生。IL-12所具備的增加NK細胞和活化T細胞的細胞毒活性、誘生IFN-γ、調(diào)節(jié)Th1細胞的發(fā)育等免疫學(xué)活性是IL-12抗腫瘤、抗病毒效應(yīng)的理論基礎(chǔ)，動物實驗亦充分證實其藥用價值。以此為基礎(chǔ)，重組人IL-12(rhIL-12)作為一種藥物已經(jīng)進入抗腫瘤、抗病毒性疾病的II/III期臨床試驗階段。人IL-12是由p40和p35兩個亞基通過二硫鍵共價連接而成異二聚體糖蛋白，其分子量約為70-75kDa，等電點為4.5-5.5，其中p35亞單位有197個氨基酸殘基，含7個半胱氨酸(cys)和3個N糖基化位點，p40亞單位306個氨基酸殘基，有10個半胱氨酸，4個N-糖基化位點。p35有3個分子內(nèi)二硫鍵，p40有4個分子內(nèi)二硫鍵，同時p35和p40之間存在一對分子間二硫鍵在。單獨p40或p35均無生物學(xué)活性，而且游離p40可以競爭IL-12p70與IL-12受體的結(jié)合位點，從而抑制IL-12的活性。由于 人IL-12的分子的特殊性和復(fù)雜性，用原核表達系統(tǒng)或酵母系統(tǒng)進行表達時，其產(chǎn)品無生物學(xué)活性，通常采用昆蟲或哺乳動物細胞進行表達。本課題組采用中國倉鼠卵巢細胞(CHO)表達人IL-12(見專利ZL03131567.4)。重組人IL-12的純化工藝是人IL-12工業(yè)生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，國內(nèi)外多個研究組或公司均有相關(guān)專利或文獻報道，例如在本研究組已公開的專利申請200410080518.7(純化重組人白細胞介素12的方法田志剛等2004年)中采用了超濾、陰離子、陽離子、疏水、分子篩的五步工藝法進行純化。在國內(nèi)專利CN101033254(一種純化重組人白細胞介素12的方法浦勤等2007年)中采用了超濾、陰離子/陽離子、硫胺沉淀、陽離子/陰離子、疏水、分子篩的六步工藝法進行純化，這兩種方法相對繁瑣，步驟較多。雖然國內(nèi)專利ZL01133658.7(人白細胞介素-12在銀紋夜蛾中的表達及其純化的方法孟小林等2004年)中采用親和法純化人IL-12，但是該過程為親和層析一步法純化，無樣品預(yù)處理，容易污染親和柱，而且無人IL-12聚體去除過程。此外，由于重組人IL-12純化的困難性，目前生物公司所提供的商業(yè)重組人IL-12產(chǎn)品，售價往往很高，非常不利于涉及人IL-12的研究及其大規(guī)模藥用生產(chǎn)的開展。本發(fā)明中采用抗人IL-12的雜交瘤細胞株制備單克隆抗體，并用該抗體制備重組人IL-12親和純化層析柱，然后用該親和純化層析柱純化重組人IL-12的工藝流程。該流程只需4步即可得到純度超過95％的rhIL-12樣品，可以大大縮短工作流程及時間，并提高回收率和產(chǎn)物的純度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明提供一種制備重組人IL-12親和純化層析柱的工藝，以及由該工藝制得的重組人IL-12親和純化層析柱。具體地說，本發(fā)明涉及用抗人IL-12的雜交瘤細胞株制備單克隆抗體，并用該抗體制備重組人IL-12親和純化層析柱。本發(fā)明還涉及利用該親和純化層析柱純化重組人IL-12的方法。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種采用親和層析柱純化重 組人IL-12的方法，其特征在于用抗人IL-12單克隆抗體的雜交瘤細胞株制備抗體，用該抗體制備人IL-12親和純化層析柱，然后以該親和純化層析柱為基礎(chǔ)進行純化重組人IL-12的方法。本發(fā)明的一個目的是提供利用人IL-12親和層析柱純化重組的人IL-12的方法。具體地，所述方法包括超濾、陰離子交換層析、親和層析和分子篩四個純化步驟：a.超濾：獲得含重組人IL-12(rhIL-12)的培養(yǎng)上清，選用10-30kD的超濾膜，將上清液超濾濃縮約10-15倍，0.22-0.45μm濾膜過濾除去不溶性微粒；b.陰離子交換層析：采用陰離子交換層析柱，20mMTris-HCl平衡液平衡，40mM組氨酸緩沖液洗脫雜蛋白，0.25MNaCl20mMTris-HCl洗脫目的蛋白；c.親和層析：采用按照本發(fā)明的工藝制得的人IL-12親和層析柱(這構(gòu)成本發(fā)明的另一個方面，見下)純化rhIL-12，用20mMTris-HCl平衡液平衡，用20mMGly-HCl緩沖液洗脫，用1MTris將洗脫蛋白的pH調(diào)為7.0左右；d.分子篩：利用分子篩去除聚體蛋白，得到純化的重組人IL-12單體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，其中，獲得含重組人IL-12(rhIL-12)的培養(yǎng)上清可以通過按國內(nèi)專利ZL03131567.4中公開的培養(yǎng)方法培養(yǎng)表達重組人IL-12的CHO細胞而獲得。在ZL03131567.4中，發(fā)明人構(gòu)建分別表達人IL-12的p40亞單位和p35亞單位的真核表達載體pcDNA3/p40和pEF13/p35，共轉(zhuǎn)染CHO細胞，利用G418和甲硫氨酸亞砜篩選獲得高表達重組人IL-12的工程細胞株。所述方法簡單的利用人IL-12P40和P35天然表達不平衡的特性，采用兩種表達效率不同的載體，以使兩條鏈的表達盡量平衡。該專利的內(nèi)容通過引用完全結(jié)合在本申請中。當(dāng)然，本發(fā)明對如何獲得包含重組人IL-12(rhIL-12)的培養(yǎng)上清沒有任何限制，只要所述培養(yǎng)上清中包含有活性的重組人IL-12即可用于本發(fā)明的純化方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，所述陰離子交換層析柱包括，但不限于，Sepharose，Capto，Sephadex，Sephacel等為骨架，Q，QAE，DEAE為活性基團的凝膠，例如：Q-SepharoseFF，CaptoQ，Q-SepharoseHP，CaptoDEAE，QAESephadex，DEAE-SepharoseFF，DEAESephadex等；可用的分子篩包括，但不限于，Sephacryl，Superdex，Sephadex，Superose，Sepharose等為骨架的凝膠，例如：SephacrylS-200HR，Superdex200，SephadexG-100等。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，本發(fā)明提供的利用重組人IL-12親和層析柱純化重組的人IL-12的方法所包含的超濾、陰離子交換層析、親和層析和分子篩四個純化步驟之間的順序不是固定不變的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際需要進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，例如，可以在進行超濾步驟之后，進行親和層析，然后再進行陰離子交換層析，等等。本發(fā)明的再一個目的是提供利用抗人IL-12的單克隆抗體制備親和純化層析柱的方法，所述方法包括下述步驟：a.活化凝膠預(yù)處理：取適量的活化凝膠(例如，CNBr或NHS活化的瓊脂糖凝膠，購自GE公司)，用1mMHCl進行完全溶解，并用1mMHCl沖洗膠體，然后再用0.1MNaHCO3，沖洗膠體；b.抗rhIL-12抗體的偶聯(lián)及親和層析柱的制備：通過超濾濃縮的方法將按本發(fā)明下文提供的方法制備的或購買的抗rhIL-12抗體濃縮至4-5mg/ml，然后將抗rhIL-12抗體加入活化凝膠中，置4℃過夜，然后用0.1MNaHCO3沖洗膠體，用0.1MTris-HCl緩沖液封閉未結(jié)合的活性基團，然后用0.1MTris-HCl緩沖液和0.1M醋酸-醋酸鈉緩沖液交替沖洗膠體，最后將共價結(jié)合抗rhIL-12抗體的凝膠裝柱，制備成純化rhIL-12的親和層析柱。其中，步驟a中的活化凝膠可以為CNBr(溴化氰)、NHS(N-羥基硫 代琥珀酰亞胺)、Epoxy(環(huán)氧樹脂)等活化的Sepharose為骨架的凝膠，例如：CNBr-activatedSepharose4FF、NHS-activatedSepharose4FF、CNBr活化的Sepharose4B、Epoxy-activatedSepharose6B、ActivatedCHSepharose4B、EAHSepharose4B、ECHSepharose4B、ThiopropylSepharose6B等。本發(fā)明的又一個目的是提供利用人IL-12雜交瘤制備抗人IL-12單克隆抗體的方法。通常，從產(chǎn)生抗人IL-12抗體的雜交瘤細胞(例如，ATCCCRL-2382，克隆號為20C2，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC))收集本發(fā)明的抗人IL-12單克隆抗體時，可以從雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中獲得抗體，具體來說，細胞傳代培養(yǎng)3-5天后收培養(yǎng)上清，上清中含有一定濃度的單克隆抗體?；蛘邔㈦s交瘤細胞注射到不完全弗氏佐劑預(yù)先處理的小鼠腹腔，通過抽取小鼠腹水中獲得單克隆抗體。通常，雜交瘤都采用BALB/c小鼠作為免疫動物進行抗體生產(chǎn)，常規(guī)做法為石蠟或降脂烷腹腔注射1周后，再腹腔注射1-2×106雜交瘤細胞，7-10天左右產(chǎn)生腹水。但是克隆號為20C2的雜交瘤用常規(guī)的石蠟預(yù)先處理無腹水產(chǎn)生。雖然用不完全弗氏佐劑預(yù)先處理可以在10-14天左右產(chǎn)生腹水，但是其效價比裸鼠低至少100倍(圖1)。因此，本發(fā)明提供利用人IL-12雜交瘤制備抗人IL-12單克隆抗體的方法，所述方法包括下述步驟：用不完全弗氏佐劑處理8-10周齡的裸鼠，每只小鼠腹腔注射500μl不完全弗氏佐劑；3天之后腹腔注射雜交瘤細胞，每只小鼠1×106細胞；7-10天左右產(chǎn)生腹水，收集小鼠腹水，離心收上清即腹水抗體。通過上述方法獲得的抗人IL-12抗體，可以ProteinG親和層析方法純化。有益效果：本發(fā)明提供了一種快速高效的rhIL-12的純化方法，通過采用hIL-12親和純化層析柱純化重組人IL-12的工藝流程，只需4步即可得到純度超過95％的rhIL-12樣品，可以大大縮短工作流程及時間，并提高回收率和產(chǎn)物的純度，特別適合工業(yè)生產(chǎn)。附圖說明從下面結(jié)合附圖的詳細描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯，其中：圖1，由BALB/c和裸鼠生成的抗人IL-12抗體的親和力比較。圖2，抗人IL-12抗體的ProteinG純化圖譜。圖3，抗人IL-12抗體純度鑒定結(jié)果。圖4，陰離子交換柱純化rhIL-12的結(jié)果。圖5，利用本發(fā)明的人IL-12親和柱純化rhIL-12的結(jié)果。圖6，分子篩純化rhIL-12結(jié)果。具體實施方式以下實施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實施例中的實驗方法，如無特別說明，均采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，實驗試劑均為市售分析純級別產(chǎn)品。實施例1：單克隆抗體的制備1.培養(yǎng)上清或腹水制備：從產(chǎn)生抗人IL-12的雜交瘤細胞(ATCCCRL-2382，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC))收集本發(fā)明的抗人IL-12單克隆抗體時，可以從雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中獲得抗體，具體來說，細胞傳代培養(yǎng)2-3天后收培養(yǎng)上清，上清中含有一定濃度的單克隆抗體?；蛘邔㈦s交瘤細胞注射到不完全弗氏佐劑預(yù)先處理的小鼠腹腔，通過抽取小鼠腹水中獲得單克隆抗體，具體來說，用不完全弗氏佐劑處理8-10周齡的裸鼠，每只小鼠腹腔注射500μl不完全弗氏佐劑。一周之后腹腔注射雜交瘤細胞，每只小鼠1-2×106細胞，7-10天左右產(chǎn)生腹水，收集小鼠腹水，離心收上清，用PBS(pH7.0)稀釋3-5倍后用0.45μm濾膜過濾。2.抗人IL-12單克隆抗體的純化：通過上述方法獲得的培養(yǎng)上清/腹水，可以用ProteinG親和層析方法純化。用PBS緩沖液平衡ProteinG親和層析柱，將處理過的腹水或培養(yǎng)上清上樣，再用PBS緩沖液平衡ProteinG親和層析柱，用0.1M檸檬酸洗脫目的抗體，并立即用0.5MNa2CO3的調(diào)節(jié)目的抗體的pH為7左右，以免蛋白變性?？贵w的純度用SDS-PAGE鑒定。如圖2所示，經(jīng)過純化的單克隆抗體的純度達到95％以上，單克隆抗體分子量重鏈約50kDa，輕鏈約26kDa。實施例2：人IL-12親和層析柱的制備1.CNBr活化的Sepharose4B凝膠預(yù)處理稱取適量CNBr(溴化氰)活化的Sepharose4B凝膠(購自GE公司)，慢慢地加入1mMHCl中并且不斷的搖勻，待凝膠完全溶解，靜置至凝膠沉底，棄去上清，再加入適量的1mMHCl重新懸起凝膠，再靜置15min，棄去上清，反復(fù)操作5次。然后再用0.1MNaHCO3(pH＝8.3)，沖洗膠體，每毫升的膠體用至少5ml0.1MNaHCO3(pH＝8.3)沖洗。2.抗rhIL-12抗體的偶聯(lián)及親和層析柱的制備通過超濾濃縮的方法將按實施例1制備的或從BD公司購買的(貨號為555065，克隆號為20C2)抗rhIL-12的抗體濃縮至4-5mg/ml，然后將rhIL-12抗體加入經(jīng)步驟1處理的凝膠中，測上清蛋白濃度，置4℃過夜。然后用0.1MNaHCO3(pH＝8.3)沖洗膠體5次，用0.1MTris-HCl緩沖液(pH＝8.0)封閉未結(jié)合的活性基團3次，并靜置2h。然后用0.1MTris-HCl緩沖液(pH＝8.0)和0.1M醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH＝5.0)交替沖洗膠體，至少洗5個循環(huán)。將結(jié)合rhIL-12抗體的膠體裝柱，制備成純化rhIL-12抗體的親和層析柱。實施例3：利用實施例2制備的人IL-12親和層析柱純化rhIL-12的方法1.超濾：含rhIL-12的培養(yǎng)上清，選用10-30kD的超濾膜(購自Millipore)， 將上清液超濾濃縮至約10-15倍，用0.22-0.45μm濾膜(購自Millipore)過濾除去不溶性微粒。2.陰離子交換層析：采用Q-SepharoseFastFlow柱(購自GE公司)，20mMTris-HCl平衡液(pH＝8.0)平衡，40mM組氨酸緩沖液洗脫雜蛋白，0.25MNaCl20mMTris-HCl(pH＝8.0)洗脫目的蛋白。陰離子柱純化的rhIL-12樣品的純度達20％以上(結(jié)果見圖4)。3.親和層析：采用實施例2制備的人IL-12親和層析柱純化rhIL-12，用20mMPBS平衡液(pH＝7.2)平衡，用20mMGly-HCl緩沖液(pH＝2.5)洗脫，用1MTris(pH＝9.0)將洗脫蛋白的pH調(diào)為7.0左右。純化的rhIL-12樣品的純度達80％以上(結(jié)果見圖5)。4.分子排阻層析：利用SephacrylS-200HR(購自GE公司)去除聚體蛋白，最終rhIL-12蛋白純度超過95％(結(jié)果見圖6)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，本發(fā)明提供的利用重組人IL-12親和層析柱純化重組的人IL-12的方法所包含的超濾、陰離子交換層析、親和層析和分子篩四個純化步驟之間的順序不是固定不變的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際需要進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，例如，可以在進行超濾步驟之后，先進行親和層析，然后再進行陰離子交換層析，等等。實施例4：rhIL-12活性測定參考國內(nèi)專利201010134960.9(一種檢測重組人白細胞介素-12蛋白活性的方法，田志剛等)，采用IFN-γ誘生法，使用BenderSystems公司生產(chǎn)的HumanIFN-γELISA試劑盒檢測IFN-γ的含量。具體檢測步驟如下：1.標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣品的稀釋：IL-12標(biāo)準(zhǔn)品(購自NIBSC)用1640完全培養(yǎng)液(購自GIBCO公司)稀釋成以下11個稀釋度(ng/ml)：25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025，待檢樣品也稀釋成以下11個稀釋度(ng/ml)：25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025，備用；2.IFN-γ的誘生：收集37℃，5％CO2培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的NKG細胞(CGMCCNo.2901，購自中國微生物菌株保藏委員會普通微生物中心(CGMCC))于50ml無菌離心管中，800rpm，10min，離心，棄上清，PBS溶液洗滌兩遍后，懸于含1640完全培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度為5×105個/ml，按100μl/孔將細胞加入96孔板。向加有細胞的96孔板對應(yīng)孔中加入100μl不同稀釋度的IL-12標(biāo)準(zhǔn)品和待測上清(每個稀釋度做雙復(fù)孔)。37℃，5％CO2培養(yǎng)24小時后，每孔取50μl培養(yǎng)上清ELISA測定IFN-γ含量；3.IFN-γ的測定：參考BenderSystems公司HumanIFN-γELISA試劑盒的說明書，用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和對應(yīng)的A值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，輸入待檢樣品A值直接求出待檢樣品IFN-γ含量；4.IL-12活性計算：以IFN-γ含量對樣品稀釋度作曲線，計算各個實驗樣品的ED50(即IFN-γ含量為最大濃度的一半時的樣品濃度)，并按下式計算結(jié)果：效價＝Pr×ED50r/ED50s。Pr：標(biāo)準(zhǔn)品效價，IU/mg；ED50r：標(biāo)準(zhǔn)品ED50；ED50s：待檢樣品ED50。結(jié)果顯示，由本發(fā)明實施例3的親和法純化的rhIL-12其比活性超過5.0×106IU/mg，因此，按此方法純化的IL-12有較高的活性。應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實施方案，已經(jīng)對本發(fā)明進行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中進行各種形式和細節(jié)的變化，可以進行各種實施方案的任意組合。