本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種木麻黃青枯菌溢出分離的方法。

背景技術(shù)：

目前木麻黃(Casuarina)青枯菌(Ralstonia solanacearum)的分離一般采用植物細(xì)菌分離常規(guī)方法——稀釋分離法。稀釋分離法是植物細(xì)菌分離常規(guī)方法，長期以來應(yīng)用于木麻黃青枯病菌的分離。其技術(shù)原理：自然條件下，木麻黃青枯菌從根系的根冠部位侵入，經(jīng)細(xì)胞間隙侵入根系木質(zhì)部的維管束，在根系維管束中大量繁殖、擴(kuò)散，最終堵塞維管束中的液流運(yùn)輸造成植株死亡，稀釋分離法取病根后，在無菌條件下清洗、剝?nèi)ネ馄ぞ菫榱吮苊怆s菌污染，再將病根垂直于維管束將其切碎浸于水中，這時(shí)候生長于維管束中的青枯菌就會被釋放出來。TTC培養(yǎng)基由于含有2,2,3-三苯基四唑氯，能與青枯菌發(fā)生顯色反應(yīng)，成為植物青枯病菌的選擇性培養(yǎng)基，即利用TTC培養(yǎng)基特異性區(qū)分青枯菌和其他細(xì)菌，并根據(jù)菌落生長形態(tài)來判斷其致病性的強(qiáng)弱。

木麻黃青枯病菌稀釋分離法具體的操作是：挖取10～12cm木麻黃新鮮病根，在流水下刷洗，去除病根表面泥垢。在超凈工作臺上將病根剪成2～3cm長，75％的酒精浸泡30s，無菌水沖洗3次，剝?nèi)ネ馄ぃ谐齼啥?，最后垂直維管束將其切碎，放入含有5～10ml無菌水的培養(yǎng)皿內(nèi)30min，病菌從病根中釋放擴(kuò)散到水中，形成懸浮液。用移植環(huán)蘸取菌液劃線培養(yǎng)于TTC培養(yǎng)基上，利用青枯菌對TTC培養(yǎng)基的顯色反應(yīng)進(jìn)行木麻黃青枯菌株的鑒定及毒性鑒別。

上述稀釋分離法雖然長期運(yùn)用于木麻黃青枯病菌的分離，但仍存在以下缺點(diǎn)：

1.操作復(fù)雜。需要對病根表面進(jìn)行清洗、消毒、剝皮、切碎、浸泡等一系列步驟程序才能完成。

2.操作難度大。由于青枯菌生長繁殖于維管束組織中，需要橫切根系才能稀釋分離出病菌，但木麻黃根系木材密度大，細(xì)胞致密，切斷切碎根系費(fèi)勁、費(fèi)時(shí)；其次，根系外層樹皮含雜菌多，為保證分離效果需要將根系外皮剝除，外皮與根系木質(zhì)部緊密連結(jié)，剝除過程操作難度大。

3.雜菌含量較高，通常需要二次分離。有些病根維管束中含有較多腐生性菌或者分離過程操作不當(dāng)，均會造成分離出的青枯菌中雜菌含量多，這時(shí)不能直接擴(kuò)大培養(yǎng)，還應(yīng)挑取典型菌落進(jìn)行二次分離。

4.利用TTC培養(yǎng)基傳統(tǒng)肉眼觀察判斷毒性菌株的方法可靠性較差。由于木麻黃青枯菌株混雜，菌系變異快，致病性分化嚴(yán)重，TTC培養(yǎng)基作為一種半選擇性培養(yǎng)基用于特異性區(qū)分青枯菌和其他細(xì)菌，并根據(jù)菌落生長形態(tài)來判斷其致病性的強(qiáng)弱存在誤差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種木麻黃青枯菌溢出分離的方法，該方法具有操作簡單，分離成功率高，雜菌含量低的優(yōu)點(diǎn)。

其技術(shù)方案如下：

一種木麻黃青枯菌溢出分離的方法，包括以下步驟，(1)挖取8～15cm長的木麻黃病根，洗凈，兩端切成平整的新鮮斷面；

(2)然后把其中一端的3～5cm浸泡于無菌水中，4～12h后，在木麻黃病根的另一端斷面流出乳白色的菌膿；

(3)用接種針挑取菌膿劃線培養(yǎng)于細(xì)菌培養(yǎng)基上，選擇分離出的典型單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

優(yōu)選地，步驟(1)中，挖取的木麻黃病根10～12cm長，洗凈，兩端切成平整的新鮮斷面；步驟(2)中，浸泡6～8h。

優(yōu)選地，還包括對擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行16s rRNA測序鑒定。更進(jìn)一步地，所述6s rRNA測序鑒定的擴(kuò)增引物為：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

優(yōu)選地，所述木麻黃病根為新近發(fā)病病株的病根，進(jìn)一步地，其根系木質(zhì)部呈透明水漬狀，淺褐色，植株地上部50～70％小枝黃化，稀疏、凋落的。

本發(fā)明所述木麻黃青枯菌溢出分離方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.為木麻黃青枯菌的分離提供了一種新方法。

2.操作步驟簡化：只需把病根一端浸泡于無菌水中就可以挑取菌膿，無需消毒，切根、剝皮等操作，提高工作效率。

3.操作容易：只要將病根洗凈、兩端切出新鮮斷面，一端浸泡后就可得到新鮮菌膿。利用植物維管束毛細(xì)現(xiàn)象，病根浸泡時(shí)不用區(qū)分生理下端和生理上端，均能在另一端溢出乳白色至黃褐色的細(xì)菌膿液，簡單容易。

4.對操作人員技術(shù)要求低：除了挑取菌膿，分離全過程無需在超凈工作臺上進(jìn)行，無需具備熟練的無菌操作能力。

5.雜菌含量低，通常無需二次培養(yǎng)，直接用于擴(kuò)大培養(yǎng)。溢出的菌膿多為新鮮病菌，直接挑取，病菌活力強(qiáng)，分離成功率高，雜菌含量低。

6.進(jìn)一步地，利用16S rRNA基因檢測技術(shù)對分離出的青枯菌進(jìn)行測序鑒定，大大提高了對分離出的青枯菌檢測和鑒定的可靠性。

綜上所述，本發(fā)明利用木麻黃青枯菌入侵、繁殖及擴(kuò)張?zhí)攸c(diǎn)，經(jīng)過發(fā)明人長期的研究，在傳統(tǒng)木麻黃青枯菌稀釋分離法基礎(chǔ)上進(jìn)行獨(dú)特的技術(shù)創(chuàng)新，發(fā)明了木麻黃青枯菌溢出分離法。與傳統(tǒng)稀釋分離方法相比，本專利所述的分離方法具有操作容易，簡便快速，可靠性強(qiáng)，雜菌含量低的優(yōu)點(diǎn)，從而為木麻黃青枯菌的分離提出了一種新的有效方法。

附圖說明

圖1為部分菌株16S rRNA序列擴(kuò)增電泳檢測結(jié)果；

圖2為M-16S rRNA序列與GenBank中一種青枯菌16S rRNA序列的比較。

具體實(shí)施方式

自然條件下，木麻黃青枯菌從根系的根冠部位侵入，經(jīng)細(xì)胞間隙侵入根系木質(zhì)部的維管束并大量繁殖，在植株蒸騰作用下侵入的青枯菌隨著液流在導(dǎo)管及其鄰近組織內(nèi)擴(kuò)散，最終堵塞維管束中的液流運(yùn)輸造成植株死亡。本發(fā)明利用溢出法能成功分離出青枯菌的原理在于：挖取的新近發(fā)病植株的病根，其維管束中不僅含有大量青枯菌，且維管束結(jié)構(gòu)未遭徹底破壞，這些維管束就是植物體內(nèi)的極細(xì)的毛細(xì)管，在毛細(xì)管作用下(毛細(xì)現(xiàn)象)它能把水分吸上來。將病根一端浸泡于水中后，維管束吸收水分，生長在維管束里面的青枯菌隨著液流向上運(yùn)輸，最終會在病根另一端溢出青枯菌膿。

所述木麻黃青枯菌溢出分離方法，包括挖取10～12cm長的木麻黃病根，洗凈，兩端切成平整的新鮮斷面，然后把其中一端3～5cm浸泡于無菌水中，6～8h后，在病根的另一端斷面會流出乳白色的菌膿。用接種針挑取菌膿劃線培養(yǎng)于細(xì)菌培養(yǎng)基上。選擇分離出的典型單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行16s rRNA測序鑒定。具體操作過程需要注意以下幾點(diǎn)：

(1)挖取的病根為新近發(fā)病病株的根系，肉眼判斷標(biāo)準(zhǔn)為根系木質(zhì)部呈透明水漬狀，淺褐色，植株地上部50～70％小枝黃化，稀疏、凋落。發(fā)病時(shí)間太長的病根木質(zhì)部呈深褐色或黑褐色，植株地上部完全黃化干枯，這時(shí)病根內(nèi)含腐生菌較多，分離時(shí)雜菌含量增多，有些病根甚至開始腐化，維管束結(jié)構(gòu)遭到破壞，維管束的毛細(xì)管作用遭到破壞，不利于青枯菌膿的溢出；發(fā)病時(shí)間太短的病根則因?yàn)榍嗫菥敝硵?shù)量不夠，也難于溢出青枯菌膿。

(2)試驗(yàn)室內(nèi)浸泡病根時(shí)不用區(qū)分生理下端和生理上端。在自然狀態(tài)下青枯菌侵入根系維管束后隨著蒸騰液流在導(dǎo)管及其鄰近組織內(nèi)繁殖擴(kuò)散，但本專利技術(shù)利用的是植物維管束毛細(xì)管作用原理，維管束吸收水分，通過樹液的流動將青枯菌膿送到病根的另一端，因此無論病根的生理下端還是生理上端浸泡于水中，均能發(fā)生毛細(xì)現(xiàn)象，均能在另一端溢出乳白色至黃褐色的細(xì)菌膿液。

(3)浸泡病根用無菌水，避免雜菌污染。本專利技術(shù)是利用維管束毛細(xì)管作用吸收水分，促進(jìn)樹液流動，使生長在維管束中的青枯菌溢出。由于普通自來水中含有各種微生物，為了保證溢出青枯菌的純度，使用無菌水來浸泡病根為最佳。

(4)及時(shí)挑取溢出的菌膿進(jìn)行劃線培養(yǎng)。由于不同病株根系組織材質(zhì)致密程度不同、感病時(shí)間長短不同或維管束中青枯菌含量不同等原因會造成病根溢出菌膿的速度不同，一旦溢出新鮮菌膿，應(yīng)及時(shí)挑取劃線培養(yǎng)，避免青枯菌膿受雜菌污染或失水、失活而造成分離失敗。

(5)利用16S rRNA基因檢測技術(shù)對分離出的木麻黃青枯菌進(jìn)行測序鑒定。青枯菌(R.solanacearum)的核糖體基因序列(即16S rRNA間隔區(qū))具有高度保守性和特異性，在同一物種的相似度可高達(dá)98％。提取待測病菌基因組DNA后，以青枯菌16s rRNA為靶基因的特異性引物序列進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定，最后將測序結(jié)果與GenBank的核酸序列庫中已知青枯菌16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較，同源性達(dá)99％以上即可認(rèn)為是同一個(gè)物種。

長期以來，木麻黃青枯菌株的鑒定及毒性鑒別采用的是簡單的TTC培養(yǎng)基法。研究表明木麻黃青枯菌在形態(tài)、種下分化、致病性、致病機(jī)理等方面表現(xiàn)出高度的復(fù)雜性，且具有與植物、環(huán)境相互作用、協(xié)同進(jìn)化，發(fā)生變異，因此利用TTC培養(yǎng)基傳統(tǒng)肉眼觀察區(qū)分青枯菌和其他細(xì)菌的可靠性較差，需要利用16S rRNA基因檢測技術(shù)對病原細(xì)菌檢測和鑒定。目前這種病原細(xì)菌檢測和鑒定技術(shù)已非常普通，但在木麻黃青枯菌檢測鑒定中尚未見報(bào)道。

為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。

除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。

下面對通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

1材料與方法

1.1病害標(biāo)本采集

選擇廣東電白、吳川、湛江南三島、湛江東海島及徐聞等有代表性的新發(fā)病區(qū)林分，采樣時(shí)選擇田間自然發(fā)病的新發(fā)病植株，挖取木質(zhì)部呈水漬狀或半透明狀根系2～3段，每段10～20cm，封口袋封裝，記錄采集時(shí)間、地點(diǎn)，帶回試驗(yàn)室分離病菌。具體病害標(biāo)本采集地點(diǎn)見表1。

表1菌株編號與來源

1.2病原菌不同分離方法的比較

采用兩種分離方法。稀釋分離法參考朱圣杰的方法并加以改進(jìn)：取10～12cm長病根，在流水下刷洗，去除病根表面泥垢。在超凈工作臺上將病根剪成2～3cm長，75％的酒精浸泡30s，無菌水沖洗3次，剝?nèi)ネ馄?，切除兩端，最后垂直維管束將其切碎放入含有5～10ml無菌水的培養(yǎng)皿內(nèi)30min，用移植環(huán)蘸取菌液劃線培養(yǎng)于TTC培養(yǎng)基上。本發(fā)明的溢出分離法：取10～12cm長的木麻黃病根，洗凈，兩端切成平整的新鮮斷面，然后把其中一端(3～5cm)浸泡于無菌水中，6～8h后，在病根的另一端斷面會流出乳白色的菌膿。用接種針挑取菌膿劃線培養(yǎng)于TTC培養(yǎng)基上。

設(shè)計(jì)不同寄主無性系、不同分離方法的雙因素試驗(yàn)，每處理重復(fù)3次，每段病根做不少于3個(gè)平板，于30℃下恒溫培養(yǎng)48h。分離率(％)＝分離出典型菌落的病根數(shù)/參試總病根數(shù)×100。

1.3浸泡端對溢出分離法分離效果的影響

設(shè)計(jì)不同寄主無性系、不同浸泡端(生理上端及生理下端)的雙因素試驗(yàn)研究病根浸泡端對溢出分離方法的影響。具體試驗(yàn)方法如上(1.2)。每處理重復(fù)3次，每段病根做不少于3個(gè)平板，于30℃下恒溫培養(yǎng)48h。分離率(％)＝分離出典型菌落的病根數(shù)/參試總病根數(shù)×100。

1.4病原菌16s rRNA測序鑒定

青枯菌在TTC培養(yǎng)基上的典型特征為菌落呈不規(guī)則圓形，略隆起，中心部位粉紅色，周圍有白色暈圈，不透明，具有流動性的。選擇具有典型菌落特征的菌株進(jìn)行16s rRNA測序鑒定。

利用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽取試劑盒進(jìn)行待測病菌基因組DNA的提取，試劑盒購買自生工生物工程(上海)股份有限公司。以16s rRNA為靶基因的青枯菌特異性引物序列OL I1/Y2進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。以DL Marker2000為標(biāo)準(zhǔn)分子量，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0％瓊脂糖凝膠電泳，在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄結(jié)果。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，將獲得的序列經(jīng)BLAST與GenBank的核酸序列庫中已知青枯菌16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較，以判斷所分離得到的菌株是否為青枯菌。具體操作如下。

A)細(xì)菌DNA模板的制備：無菌操作下，將純化后的待測菌制成菌懸液，按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒方法提取基因組DNA，測定DNA濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

B)引物：OL I1：5-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3(SEQ ID NO.1)

Y2：5-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3(SEQ ID NO.2)。

C)PCR反應(yīng)體系：體系為25μL：1×PCR緩沖液(20mM Tris-HCl，pH8.4，20mM KCl，10mM(NH4)2SO4，1.5mM MgCl2)0.2mM，dNTP 0.2mM，引物各1μM，Taq酶1U，模版2μL，加ddH2O至25μL。

D)PCR反應(yīng)條件：變性96℃2min，三溫循環(huán)94℃20s，68℃20s，72℃30s，50個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。

E)PCR結(jié)果判定：2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，如能觀察到280bp左右的PCR產(chǎn)物條帶，則可判定為可疑木麻黃細(xì)菌性青枯病菌，進(jìn)一步測序鑒定，否則為陰性。

F)測序：將PCR產(chǎn)物回收后，進(jìn)行克隆、測序，或者直接測序(測序可由生物公司完成)，測序引物為OL I1、Y2。測序結(jié)果經(jīng)BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知Ralstonia solanacearun菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較，以判斷所分離得到的菌株是否為青枯菌。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，采用SAS V8.1統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，相關(guān)分析及Duncan多重比較檢驗(yàn)不同平均值間的差異等。

2.結(jié)果與分析

4.2.1兩種分離方法的比較分析

采用傳統(tǒng)的稀釋分離法及本發(fā)明所述溢出分離法均能較好地從木麻黃根系分離出青枯病菌。傳統(tǒng)的稀釋分離法分離率較高，90％以上的病根可以分離出青枯菌典型菌落，本發(fā)明所述溢出分離法可以分離80％以上的病根溢出菌膿并分離出典型菌落(表2)。方差分析表明，無性系及無性系與分離方法的交互作用對分離率影響不顯著，分離率的高低主要是由分離方法不同引起的(表3)。

表2兩種分離方法的比較

雖然溢出分離法青枯菌分離率低于常規(guī)稀釋分離法，但80％分離率已能滿足試驗(yàn)室需要，且能直接從溢出的菌膿上挑菌劃線培養(yǎng)，操作更加簡便，雜菌含量低，通常不需要二次分離即可獲得較純的菌株。其次，本次試驗(yàn)溢出分離法分離率較低可能還與所采病根感病時(shí)間較長有關(guān)，病根維管束組織遭到了不同程度的破壞，影響維管束發(fā)揮毛細(xì)管作用吸收水分，進(jìn)而影響菌膿的溢出。

表3不同分離方法方差分析

注：^*示0.05顯著水平。

本試驗(yàn)利用兩種分離方法共分離出了31個(gè)在TTC培養(yǎng)基上具有典型菌落特征的病原菌菌株。分離獲得的31個(gè)菌株具體情況見表1。

不同方法分離出的青枯菌株在形態(tài)、鑒定及致病性等方面沒有差異。與傳統(tǒng)稀釋分離法相比，采用溢出分離法也能較好地分離出木麻黃青枯菌菌株，大大減少實(shí)驗(yàn)操作，簡便快速，雜菌含量少，可作為傳統(tǒng)木麻黃青枯菌分離的一種新方法。溢出分離法的原理在于利用植物維管束的毛細(xì)管作用，吸收水分，通過液流運(yùn)動使生長在維管束中的青枯菌從病根的另一端溢出。

2.2浸泡端對溢出分離法分離效果的影響

選用不同木麻黃無性系的病根，分別將病根的生理上端和生理下端浸泡于水中，探討病根浸泡端對溢出分離法分離效果的影響。研究結(jié)果表明：生理上端浸泡于水中的平均分離率為82％，生理下端浸泡于水中的平均分離率為84％，A13無性系平均分離率為84％，A8無性系平均分離率為81％，方差分析結(jié)果表明寄主無性系及浸泡端對分離率影響均不顯著。

表4兩種分離方法的比較

試驗(yàn)結(jié)果研究表明，對于同一份試驗(yàn)材料，浸泡端對溢出分離法分離效果影響不大。無論是用病根的生理下端還是生理上端浸泡，均能分離成功。

2.3病原菌16s rRNA測序鑒定

以O(shè)LI1/Y2為特異性引物擴(kuò)增16S rRNA基因序列，分離出的31個(gè)菌株有22個(gè)可在2h內(nèi)擴(kuò)增出280bp左右的目標(biāo)條帶，且無雜帶出現(xiàn)，電泳結(jié)果如圖1。對這22個(gè)病原菌作進(jìn)一步測序鑒定，而A、C、E、G、J、L、T、W、AC等9個(gè)菌株未擴(kuò)增出特異性條帶，為陰性，不再做進(jìn)一步測序鑒定。

將22個(gè)菌株16S rRNA正反向測序結(jié)果進(jìn)行拼接后與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫的基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明：B、D、F、H、I、K、M、N、O、P、Q、R、S、U、V、X、Y、Z、AB、AD、GL-2及TC-1菌株與數(shù)據(jù)庫中Ralstonia solanacearum菌株(登錄號為CP012943.1、CP012939.1)16S rRNA的同源性高達(dá)100％，結(jié)合菌落培養(yǎng)特征，確認(rèn)這些致病菌為青枯菌(R.solanacearum)。利用稀釋分離法與溢出法分離法分離的青枯菌株在形態(tài)，特異性條帶及同源性比較中沒有差異。其中M菌株16S rRNA與GenBank中一種青枯菌16S rRNA序列的比較見圖2。

R.solanacearum的核糖體基因序列(即16S rRNA間隔區(qū))具有高度保守性和特異性，在同一物種的相似度可高達(dá)98％，已成為病原細(xì)菌檢測和鑒定的常用方法，本發(fā)明首次將這種技術(shù)應(yīng)用于木麻黃青枯菌的檢測鑒定。研究結(jié)果表明，利用傳統(tǒng)TTC半選擇性培養(yǎng)基分離出了具有典型青枯菌菌落特征的病株31個(gè)，其中只有22個(gè)擴(kuò)增出了特異性條帶，這22個(gè)病菌的16s RNA測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知Ralstonia solanacearun菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性達(dá)100％，因此這也表明傳統(tǒng)TTC培養(yǎng)基法通過菌落培養(yǎng)特征的觀察來鑒定青枯菌的方法存在著一定誤差。

以上僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍；在不違反本發(fā)明構(gòu)思的基礎(chǔ)上所作的任何替換與改進(jìn)，均屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省林業(yè)科學(xué)研究院

<120> 一種木麻黃青枯菌溢出分離的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggggtagct tgctacctgc c 21

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccactgctg cctcccgtag gagt 24