本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及檢測試劑和試劑盒，具體涉及一種用于人皰疹病毒各亞型的快速檢測與定量的試劑和試劑盒。

背景技術(shù)：

人皰疹病毒(HHV)是一類雙鏈DNA病毒，根據(jù)其保守結(jié)構(gòu)蛋白序列可分為α、β、γ三個亞科，根據(jù)其基因組特性可分為8種亞型，即單純皰疹病毒1，2型(HSV-1/2)，水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)，EB病毒(EBV)，人巨細胞病毒(HCMV)，皰疹病毒6，7(HHV-6A/6B/7)和卡波氏肉瘤病毒(KSHV)。已知人皰疹病毒在人群中感染率高，可入侵人體多種組織細胞，進而引起皮膚、粘膜、淋巴、肝、肺、生殖或神經(jīng)系統(tǒng)等臟器感染，其特點為潛伏性強，常形成隱性或急慢性局部或全身感染。HHV初次感染后持續(xù)存在于宿主體內(nèi)，形成潛伏感染，當(dāng)受到各種非特異性刺激、抵抗力減弱、免疫功能下降時，易發(fā)生病毒的再激活，從而導(dǎo)致多種疾病。1型單純皰疹主要通過性病感染，當(dāng)感染皮膚及粘膜表面時會形成丘疹、膿皰和潰瘍等；2型皰疹病毒與1型類似，是性傳染病的病原體，最近的研究還發(fā)現(xiàn)，HSV-1主要造成口腔損傷而HSV-2主要引起生殖道感染；水痘-帶狀皰疹病毒是水痘的病原體，傳染力極強，容易造成皮膚損傷；EB病毒與腫瘤發(fā)生相關(guān)，主要通過感染免疫細胞導(dǎo)致一些惡性疾，比如鼻咽癌，霍奇金淋巴瘤，伯基特淋巴瘤等；巨細胞病毒不僅可以感染生殖道、尿道，還可造成神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，尤其在新生兒人群中，存在一個較高的感染率；6型皰疹病毒在幼兒急診普遍存在，感染后可導(dǎo)致肺炎、心肌炎，自身免疫系統(tǒng)疾??；HHV7也是一種嗜神經(jīng)性病毒，在人群中存在較高的感染率；8型皰疹病毒即KSHV作為卡波氏肉瘤的病原體，與原發(fā)性滲透性淋巴瘤及等多種腫瘤發(fā)生相關(guān)，KSHV可以感染免疫細胞和上皮細胞，并通過母嬰傳播感染下一代。

近年來，鑒于HHV在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用引起了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注，因此對于HHV相關(guān)腫瘤的病毒學(xué)監(jiān)測顯得尤為重要。發(fā)明專利CN 103773898 A公開一種人皰疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV三聯(lián)檢測試劑盒；發(fā)明專利CN 103820573 A公開一種同時檢測四種常見人皰疹病毒HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV的實時熒光定量PCR試劑盒；發(fā)明專利CN 103820574 B公開一種人皰疹病毒6型實時熒光定量PCR分型檢測試劑盒；發(fā)明專利CN 103866046 A公開一種人皰疹病毒EBV和VZV檢測試劑盒。但截止目前，臨床上尚無高效、特異地可用于HHV各亞型病毒的快速檢測和定量標(biāo)準(zhǔn)方案，大大影響了HHV的流行病學(xué)調(diào)查和早期臨床診斷需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有HHV檢測與定量技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的之一在于提供一種人皰疹病毒各亞型快速檢測試劑，所述各亞型包括HSV-1，HSV-2，VZV，EBV，HCMV，HHV-6A，HHV-6B，HHV-7，HSHV，所述檢測試劑包括：

用于擴增所述HSV-1RL2靶基因片段的如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的正反向引物；

用于擴增所述HSV-2UL28靶基因片段的如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列的正反向引物；

用于擴增所述VZV ORF26靶基因片段的如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列的正反向引物；

用于擴增所述EBV EBNA1靶基因片段的如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列的正反向引物；

用于擴增所述HCMVIE靶基因片段的如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列的正反向引物；

用于擴增所述HHV-6A或HHV-6B U22靶基因片段的如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示序列的正反向引物；

用于擴增所述HHV-6A或HHV-6B IE靶基因片段的如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示序列的正反向引物；

用于擴增所述HHV-7U95靶基因片段的如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列的正反向引物；

用于擴增所述HSHV ORF72靶基因片段的如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示序列的正反向引物；

以及所述各亞型標(biāo)準(zhǔn)品，包括：

所述HSV-1RL2標(biāo)準(zhǔn)品，所述HSV-2UL28標(biāo)準(zhǔn)品，所述VZV ORF26標(biāo)準(zhǔn)品，所述EBV EBNA1標(biāo)準(zhǔn)品，所述HCMV IE標(biāo)準(zhǔn)品，所述HHV-6A或HHV-6B U22標(biāo)準(zhǔn)品，所述HHV-6A或HHV-6B IE標(biāo)準(zhǔn)品，所述HHV-7U95標(biāo)準(zhǔn)品，所述HSHV ORF72標(biāo)準(zhǔn)品。

優(yōu)選地，

所述HSV-1 RL2標(biāo)準(zhǔn)品序列如SEQ ID NO.19所示；

所述HSV-2 UL28標(biāo)準(zhǔn)品序列如SEQ ID NO.20所示；

所述VZV ORF26標(biāo)準(zhǔn)品序列如SEQ ID NO.21所示；

所述EBV EBNA1標(biāo)準(zhǔn)品序列如SEQ ID NO.22所示；

所述HCMV IE標(biāo)準(zhǔn)品序列如SEQ ID NO.23所示；

所述HHV-6A或HHV-6B U22標(biāo)準(zhǔn)品序列如SEQ ID NO.24所示；

所述HHV-6A IE標(biāo)準(zhǔn)品序列如SEQ ID NO.25所示；

所述HHV-7U95標(biāo)準(zhǔn)品序列如SEQ ID NO.26所示；

所述HSHV ORF72標(biāo)準(zhǔn)品序列如SEQ ID NO.27所示。

本發(fā)明的又一目的在于提供一種包括上述檢測試劑的人皰疹病毒各亞型快速檢測試劑盒，該檢測試劑盒還包括：用于進行各所述靶基因片段PCR擴增的反應(yīng)試劑，如PCR反應(yīng)液，ddH₂O等。

優(yōu)選地，所述PCR擴增反應(yīng)體系為12ul，其中每對所述檢測試劑中的引物對(20uM)0.2ul，DNA模板50ng，PCR mix(2×)6ul，其余為ddH₂O；所述PCR擴增反應(yīng)條件為：34個循環(huán)，95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s。

優(yōu)選地，該檢測試劑盒還包括用于提取樣本DNA的試劑，如蛋白酶K，Buffer等，還可包括DNA吸附柱。

本發(fā)明的第三個目的在于提供一種包括上述檢測試劑的人皰疹病毒各亞型快速定量試劑，所述定量試劑還包括：用于進行SYBRGreen熒光定量PCR擴增的試劑；所述SYBRGreen熒光定量PCR擴增反應(yīng)體系為20ul，其中每對所述檢測試劑中的引物對(10uM)0.5ul，DNA模板5u1；所述SYBRGreen熒光定量PCR擴增反應(yīng)條件為：40個循環(huán)，95℃，5s；55℃，30s；72℃，30s；各亞型病毒拷貝數(shù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線分別如下：

HSV-1： y＝-4.182x+43.865

HSV-2： y＝-3.4055x+41.128

VZV： y＝-2.874x+39.438

EBV： y＝-3.776x+46.351

HCMV： y＝-3.3564x+40.906

HHV-6A：y＝-3.5445x+43.155

HHV-6B：v＝-3.1004x+38.194

HHV-7：y＝-3.1009x+37.438

其中，y為Ct值，x為Log(拷貝數(shù))。

本發(fā)明的第四個目的在于提供一種包括上述定量試劑的人皰疹病毒各亞型快速檢測與定量試劑盒，該定量試劑盒還包括用于進行各所述靶基因片段PCR擴增的反應(yīng)試劑，如PCR反應(yīng)液，ddH₂O等。該試劑盒不僅可通過普通PCR進行人皰疹病毒各亞型的快速鑒別與診斷，還可結(jié)合熒光定量PCR進行各亞型病毒拷貝數(shù)的快速定量。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明分別選擇人皰疹病毒各亞型編碼潛伏期基因作為靶標(biāo)序列，研制并開發(fā)出一套高效、快速、準(zhǔn)確的人皰疹病毒各亞型檢測和病毒拷貝數(shù)定量試劑，以及配套檢測和定量試劑盒。針對不同來源的感染早期臨床樣本檢測實踐證明，本發(fā)明快速檢測定量試劑及試劑盒以及配套檢測和定量方案具有高特異性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，可同步高效區(qū)分人皰疹病毒各亞型并進一步進行拷貝數(shù)精確定量，填補了目前尚無人皰疹病毒全亞型檢測與定量的技術(shù)空白，可作為標(biāo)準(zhǔn)化檢測工具廣泛應(yīng)用人皰疹病毒感染早期快速確診，流行病學(xué)調(diào)查，并輔助臨床治療用藥，具有很高的臨床診斷使用價值。

附圖說明

圖1為實施例1中273例皮膚組織皰疹病毒各亞型感染情況的檢測結(jié)果示意圖(瓊脂糖凝膠電泳)。

圖2為實施例2中1例水痘患者皰疹病毒感染情況的檢測結(jié)果示意圖(瓊脂糖凝膠電泳)。

圖3為實施例3中10例樣品皰疹病毒感染情況的檢測結(jié)果示意圖(瓊脂糖凝膠電泳)。

圖4為HSV-1(RL2標(biāo)準(zhǔn)品)的病毒拷貝數(shù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖5為HSV-2(UL28標(biāo)準(zhǔn)品)的病毒拷貝數(shù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖6為VZV(ORF26標(biāo)準(zhǔn)品)的病毒拷貝數(shù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖7為EBV(EBNA1標(biāo)準(zhǔn)品)的病毒拷貝數(shù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖8為HCMV(IE標(biāo)準(zhǔn)品)的病毒拷貝數(shù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖9為HHV-6A或HHV-6B(U22標(biāo)準(zhǔn)品)的病毒拷貝數(shù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖10為HHV-6B(IE標(biāo)準(zhǔn)品)的病毒拷貝數(shù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖11為HHV-7(U95標(biāo)準(zhǔn)品)的病毒拷貝數(shù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖12為KSHV(ORF72標(biāo)準(zhǔn)品)的病毒拷貝數(shù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖，詳細說明本發(fā)明的具體實施例，但不對本發(fā)明的權(quán)利要求做任何限定。

以下實施例所采用實驗材料和試劑如無特殊說明，均為市售通用商品。

實施例1 273例皮膚組織皰疹病毒各亞型感染情況的檢測

樣本：273例皮膚組織來源于上海市皮膚病醫(yī)院患者，年齡在5～93歲之間，男女不限，收集每名患者不同器官或者組織(選擇具有典型特征的病變部位，如上肢，右足，右面等，切取皮膚全層，包括表皮，真皮)，主要病理診斷為皮膚腫瘤，痣細胞痣，脂溢性皮炎或角化，濕疹等。

1.DNA提取

收集上述皮膚組織樣本置于試管中，-80℃保存。使用DNA提取試劑盒(Tissue gDNA kit，Biomiga)提取DNA，并初步檢測DNA提取質(zhì)量(OD260/280)和濃度。

具體操作如下：

(1)樣品取出后先用PBS溶液沖洗，放在滅菌的吸水紙上將其揩干，于超凈工作臺內(nèi)用無菌剪刀將材料剪成50mg的小塊，樣品先用經(jīng)液氮研磨，研磨時待液氮蒸發(fā)，轉(zhuǎn)移組織粉末至一干凈的1.5mL離心管，加入500ul PBS緩沖液，12000g離心1分鐘，小心棄上清，保留沉淀，加入200ul Buffer TL重懸沉淀；

(2)加入25ul蛋白酶K，渦漩以混勻，置于50℃水浴振蕩培養(yǎng)以利于組織完全裂解，每20～30分鐘，渦漩樣品，一般情況下不超過3個小時；

(3)＞13000g離心5分鐘，沉淀組織碎片。小心吸取上清，轉(zhuǎn)移至離心管中；

(4)加入220ul Buffer BL，渦漩混勻，70℃中靜置10分鐘；

(5)加入220u1無水乙醇(室溫)，渦漩混勻；

(6)將一個ezBind^TM DNA吸附柱插入2mL收集管，將步驟6中得到的所有溶液包括少量沉淀至吸附柱中，10000g離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱重新插入收集管中；

(7)向吸附柱中加入500ul Buffer KB，10000g離心1分鐘，棄收集管與廢液；

(8)將吸附柱放入一個新的收集管中，加入650ul DNA Wash Buffer，10000g離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱重新插入收集管中；

(9)加入450ul DNA Wash Buffer，10000g離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱重新插入收集管中；

(10)≥13000g開蓋離心2分鐘，徹底去除殘留乙醇；

(11)將DNA吸附柱插入1.5mL離心管，向吸附柱中加入100-200ul預(yù)熱(70℃)Elution Buffer(10mM Tris，pH 8.5)，室溫靜置1～3分鐘，≥13000g離心1分鐘，獲得DNA樣品。

2.PCR檢測

PCR反應(yīng)體系(12ul)：

采用的引物序列如表1所示：

表1 分型檢測引物序列

PCR反應(yīng)條件：共進行34個循環(huán)，95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s。

PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并用EB染色。

其中：2×Taq PCR Master Mix購買自易欣生物公司，引物由上海桑尼公司合成。

3.檢測結(jié)果與分析

部分檢測結(jié)果如圖1所示(M：標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量；+：各亞型標(biāo)準(zhǔn)品，1～8：待測DNA樣品)。

如圖1所示，8例樣品中單純皰疹病毒1、2型，水痘-帶狀皰疹，巨細胞病毒及卡波氏肉瘤病毒檢測為陰性，其中，6號樣品EB病毒檢測為陽性，3～8號樣品感染HHV-6，且3，4號樣品為HHV-6A和HHV-6B陽性，其余為HHV-6B陽性；8例樣品均未檢測HHV-7。

實施例2 1例水痘患者(血漿)皰疹病毒感染情況的檢測

樣本：來源于復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院，樣本取自女性水痘患者。

1.采用HMW法提取病人血漿DNA

(1)加入400ul HMW buffer重懸血漿(180ul)，同時加入40ul 10％SDS，20ul 10mg/ul蛋白酶K，60℃水浴孵育5h；

HMW buffer配制如下(充分混勻后4℃保存)：

(2)加入等體積苯酚氯仿(1∶1)，4℃12000rpm/5min，收集上清，重復(fù)操作一次；

(3)加入1/10體積的醋酸鈉，2倍體積的冰乙醇，-80℃1h，4℃12000rpm/5min；

(4)70冰乙醇洗一次，4℃12000rpm/5min；

(5)晾干(20min)，用ddH2O(20ul)溶解，放-20℃保存。

2.PCR檢測

PCR反應(yīng)體系(12ul)：

采用的引物同實施例1。

PCR反應(yīng)條件：共進行34個循環(huán)，95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s。

PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并用EB染色。

其中：2×Taq PCR Master Mix購買自易欣生物公司，引物由上海桑尼公司合成。

3.檢測結(jié)果與分析

檢測結(jié)果如圖2所示(M：標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量；+：各亞型標(biāo)準(zhǔn)品；-：無DNA模板陰性對照；T：待測DNA樣品)。

如圖2所示，該患者除VZV檢測為陽性外，其余各亞型(HHV-7未檢測)檢測均為陰性，推測為水痘帶狀皰疹病毒感染。

實施例3 10例樣品皰疹病毒感染情況的檢測

樣本：來源于上海市疾控中心，每例樣本來源患者均疑似感染麻疹病毒。

1.DNA提取

于-80℃取出樣品適量，使用DNA提取試劑盒(Tissue gDNA kit，Biomiga)提取DNA，并初步檢測DNA提取質(zhì)量和濃度，方法同實施例1。

2.PCR檢測

反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實施例1。

3.檢測結(jié)果與分析

檢測結(jié)果如圖3所示，對HSV-1：5例單純感染麻疹病毒的樣本均為陰性，5例混合感染的樣本均為陽性；對于HSV-2：5例單純感染麻疹病毒的樣本均為陰性，5例混合感染的樣本均為陽性；對于VZV：10例樣品均為陽性。其余EBV、HCMV、HHV-6A/B、KSHV在單純麻疹病毒感染及混合感染樣本中均為陰性。

實施例4各亞型人皰疹病毒定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

1.構(gòu)建標(biāo)樣質(zhì)粒

構(gòu)建各亞型人皰疹病毒標(biāo)樣質(zhì)粒的引物序列如表2所示：

表2 標(biāo)樣質(zhì)粒構(gòu)建引物序列

各亞型人皰疹病毒標(biāo)樣質(zhì)粒構(gòu)建過程如下：

(1)HSV-1基因組自KOS菌株(購自ATCC，Cat：VR-1493D)提取獲得，通過PCR得到RL2，插入到pET-28a載體上，重組質(zhì)粒大小：5369bp(pET-28a)+148bp(RL2)＝5517bp酶切位點：NdeI/BamHI

(2)HSV-2基因組自G菌株(購自ATCC，Cat：VR-734D)提取獲得，通過PCR得到UL28部分片段，插入到pET-28a載體上，重組質(zhì)粒大小：5369bp(pET-28a)+228bp(UL28)＝5597bp酶切位點：NdeI/BamHI

(3)VZV基因組自Ellen菌株(購自ATCC，Cat：VR-1367D)提取獲得，通過PCR得到ORF26部分片段，插入到pET-28a載體上，重組質(zhì)粒大?。?369bp(pET-28a)+506bp(ORF26)＝5875bp酶切位點：NdeI/BamHI

(4)EBV基因組自B95.8菌株(購自ATCC，Cat：VR-1492)提取獲得，通過PCR得到EBNA1部分片段，插入到pET-28a載體上，重組質(zhì)粒大?。?369bp(pET-28a)+387bp(EBNA1)＝5759bp酶切位點：NdeI/BamHI

(5)HCMV基因組自AD169株(購自ATCC，Cat：VR-538D)提取獲得，通過PCR得到IE部分片段，插入到pET-28a載體上，重組質(zhì)粒大小：5369bp(pET-28a)+395bp(IE)＝5764bp酶切位點：NdeI/BamHI

(6)HHV-6B基因組自Z-29株(購自ATCC，Cat：VR-1467)提取獲得，通過PCR得到U22，IE部分片段，插入到pET-28a載體上，重組質(zhì)粒大?。?/p>

A/B通用：5369bp(pET-28a)+190bp(U22)＝5559bp酶切位點：NdeI/BamHI

A/B分型：5369bp(pET-28a)+340bp(IE)＝5709bp酶切位點：NdeI/BamHI

(7)HHV-7基因組U95基因片段由上海金唯智公司基因合成，重組質(zhì)粒大?。?369bp(pET-28a)+290bp(U95)＝5659bp酶切位點：NdeI/BamHI

(8)KSHV基因組自BC3細胞系(購自ATCC，Cat：CRL-227)提取獲得，通過PCR得到ORF72部分片段，插入到PET-28a載體上，重組質(zhì)粒大?。?369bp(pET-28a)+609bp(ORF72)＝5978bp酶切位點：BamHI/EcoRI

2.計算標(biāo)樣質(zhì)?？截悢?shù)(以EBV為例)

(1)用Nanodrop檢測得EBV標(biāo)樣質(zhì)粒濃度(ng/ul)：149.9ng/ul

(2)計算單個質(zhì)粒的分子量，公式如下：m＝(n)(1.096e-21g/bp)其中，n＝質(zhì)粒大小(bp)，e-21＝×10^-21，則m＝6.31e-18。

將構(gòu)建所得上述標(biāo)樣質(zhì)粒儲存液按照表3所示進行稀釋：

表3 標(biāo)樣質(zhì)粒稀釋過程

3.定量PCR反應(yīng)(以EBV為例)

定量PCR反應(yīng)體系(20ul)：

采用的引物序列為：

F：CCTGTAGGGGAAGCCGAT

R：CAATGGTGTAAGACGACATT

定量PCR反應(yīng)條件：共進行40個循環(huán)，95℃，5s；55℃，30s；72℃，30s。

其中：SYGB 2×Mix購買自Takara生物公司，引物由上海桑尼公司合成。

4.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(以EBV為例)

EBV病毒拷貝數(shù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示，y＝-3.776x+46.351當(dāng)Ct值在12.02-27.405之間時可有效進行EBV拷貝數(shù)定量。

5.HHV其他分型病毒拷貝數(shù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建策略同EBV，HSV-1、HSV-2、VZV、HCMV、HHV-6A、HHV-6B、HHV-7、KSHV的病毒拷貝數(shù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線分別如圖4、圖5、圖6、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12所示。

實施例5 4型皰疹病毒(EBV)拷貝數(shù)定量檢測

樣本：來自復(fù)旦大學(xué)華醫(yī)院

1.DNA提取

于-20℃取出樣品適量，使用HMW法提取血漿DNA，并初步檢測DNA提取質(zhì)量和濃度，方法同實施例1。

2.PCR及RT-PCR檢測

反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實施例1，實施例4。

3.檢測結(jié)果與分析

樣本熒光定量PCR檢測結(jié)果如表4所示：

表4 樣本熒光定量PCR檢測結(jié)果

根據(jù)EBV的病毒拷貝數(shù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線計算病毒拷貝數(shù)，結(jié)果為：該患者樣本Ct值平均值大于27.405，EBV拷貝數(shù)約為10⁴個。

綜上所述，通過臨床樣本檢測實踐證明，本發(fā)明檢測和定量試劑及配套檢測定量方案可針對不用來源的感染早期臨床樣本進行快速、有效的人皰疹病毒各亞型鑒別與診斷，還可方便、準(zhǔn)確地進行病毒拷貝數(shù)定量計算。

可以理解的是，以上關(guān)于本發(fā)明的具體描述，僅用于說明本發(fā)明而并非受限于本發(fā)明實施例所描述的技術(shù)方案。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，仍然可以對本發(fā)明進行修改或等同替換，以達到相同的技術(shù)效果；只要滿足使用需要，都在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 復(fù)旦大學(xué)

<120> 人皰疹病毒各亞型快速檢測與定量試劑和試劑盒

<160> 27

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgggacacat gccttcttgg 20

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acccttagtc agactctgtt acttaccc 28

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtacagacct tcggagg 17

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcttcatca tgggc 15

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcagctggct tttctaagaa ttcg 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tatttttggt atccgcaatg tc 22

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctgtagggg aagccgat 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caatggtgta agacgacatt 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gctgcggcat agaatcaagg agca 24

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggttggtggt cttagggaag gctgag 26

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgctcggaaa ggaaacatta 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aagtggaact gcttggtggc 20

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttctccagat gtgccaggga aatcc 25

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cacattgtta tcgctttcac tctc 24

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acgatgtgcg tttcggagaa gtgga 25

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tctagggact gttttgacaa atcttt 26

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gttccactgc cgcctgta 18

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tatttgggac ctttcaacaa tctctt 26

<210> 19

<211> 148

<212> DNA

<213> 人皰疹病毒1型（Simplex)

<400> 19

tgggacacat gccttcttgg agtacgtggg tcattggcgt ggggggttac agcgacaccg 60

gccgaccccc tggcggtctt ccagccggcc cttagataag ggggcagttg gtggtcggac 120

gggtaagtaa cagagtctga ctaagggt 148

<210> 20

<211> 228

<212> DNA

<213> 人皰疹病毒2型（Simplex)

<400> 20

gtacagacct tcggaggtcg ggcggctgca gtcggggcgg cgcaactcaa gctccccgca 60

ccggtagacc gacgcaaaga gtgtggtggc gataatgagc tcgcgaatat atcgccaggc 120

ggcgcgctgg gtgggcgtga ttccggaaac accgtcaaaa cagtagaact tttgaaactc 180

gctgacggcc caatcagcgc ccgaaccccc cgcgcccatg atgaagcg 228

<210> 21

<211> 506

<212> DNA

<213> 人皰疹病毒3型（Varicello)

<400> 21

tcagctggct tttctaagaa ttcgcaaatg ctgtgtaccg gcttttttaa ttctttttgg 60

tattctcacc cttactgctg tcgtggtcgc cattgttgcc gtttttcccg aggaacctcc 120

caactcaact acatgaaact actgtccgga aggggaaggt atttattctc gcttgcagct 180

tgtcgcgcgt gtatgcacaa caaaagctat atatgtcacc aaagccaacg tcgccatctg 240

gagtactaca cccagtacgt tgcataacct gtccatttgc attttcagtt gcgcggacgc 300

ctttctccgg gatcgtggcc ttgggacatc aaccagtgga ataagaaccg ccggtggtct 360

tgtttgaacg acgagtggcg acgcgttgtt ctgcataagc tctgtatgct gatacataaa 420

cacagagtct gtatcgctat cagattcccg aacaccttcc ggtaccccat actccgatac 480

cctggacatt gcggatccca aaaata 506

<210> 22

<211> 387

<212> DNA

<213> 人皰疹病毒4型（Lymphocrypto)

<400> 22

cctgtagggg aagccgatta ttttgaatac caccaagaag gtggcccaga tggtgagcct 60

gacgtgcccc cgggagcgat agagcagggc cccgcagatg acccaggaga aggcccaagc 120

actggacccc ggggtcaggg tgatggaggc aggcgcaaaa aaggagggtg gtttggaaag 180

catcgtggtc aaggaggttc caacccgaaa tttgagaaca ttgcagaagg tttaagagct 240

ctcctggcta ggagtcacgt agaaaggact accgacgaag gaacttgggt cgccggtgtg 300

ttcgtatatg gaggtagtaa gacctccctt tacaacctaa ggcgaggaac tgcccttgct 360

attccacaat gtcgtcttac accattg 387

<210> 23

<211> 395

<212> DNA

<213> 人皰疹病毒5型（Cytomegalo)

<400> 23

gctgcggcat agaatcaagg agcacatgct gaaaaaatat acccagacgg aagagaaatt 60

cactggcgcc tttaatatga tgggaggatg tttgcagaat gccttagata tcttagataa 120

ggttcatgag cctttcgagg agatgaagtg tattgggcta actatgcaga gcatgtatga 180

gaactacatt gtacctgagg ataagcggga gatgtggatg gcttgtatta aggagctgca 240

tgatgtgagc aagggcgccg ctaacaagtt ggggggtgca ctgcaggcta aggcccgtgc 300

taaaaaggat gaacttagga gaaagatgat gtatatgtgc tacaggaata tagagttctt 360

taccaagaac tcagccttcc ctaagaccac caacc 395

<210> 24

<211> 190

<212> DNA

<213> 人皰疹病毒6型（Roseolo)

<400> 24

cgctcggaaa ggaaacatta cacttagtat cattgtccac gaacacaaca ccaatatttt 60

tattgtatcg acataatatc ttagacccca tggcggtctc gataacgcat cgagggttaa 120

acaaaaaggc tatatctctt tcgaaataag cattaatagg cacactagcc atccgccacc 180

aagcagttcc 190

<210> 25

<211> 340

<212> DNA

<213> 人皰疹病毒6型（Roseolo)

<400> 25

catatgttct ccagatgtgc cagggaaatc caaatatgta ggaacattca ctgaaaacag 60

cagacagtca ggggacgaac aaacaaaccc taactgtgta ggtacagcct cagtgacaga 120

tctgggcggc cctgataact tgaattccat cagcggcctc cagagttgta aaaacatgtt 180

gctagaaaga ctacttgaca ctcaatgtga ttcagtagtt gaagggacag aacaagatgg 240

ttccaatggc aaccctttaa tatcagaaat gttgatgttt ggttatgaaa ctgatcactc 300

ggcaccctat gagagtgaaa gcgataacaa tgtgggatcc 340

<210> 26

<211> 290

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

catatgacga tgtgcgtttc ggagaagtgg attatcaaac ctcttcggct cagacaaaaa 60

tttccaacca ccagttagcg ttgttgccaa caaattatca gcacatgata gggcaggaaa 120

cagacatttc atcgcgggat tatcacaatg acagtgctca aattatttac aattgctcat 180

ttcaacgaca gggaaaaagg cttcttgctg atattccata tagaccttgg ttaaaagaaa 240

atgttcccac aggggaatat ggaaaaagat ttgtcaaaac agtccctaga 290

<210> 27

<211> 609

<212> DNA

<213> 人皰疹病毒8型(Rhadino)

<400> 27

gttccactgc cgcctgtaga acggaaacat cgcatcccaa tatgcttgcc agctgaggaa 60

ctaccccacc cgagtgggta tcctgcggaa tgacgttggc aggaaccaac agcgcacagc 120

ctgcagcgct gataatagag gcgggcaatg agccagtctt tgggtcaact aaggcttttg 180

taatcagggt gttgacctcg tggtgccaaa agtccaggtg ttgggagccc cccagcaatt 240

taagtaacaa gaaggaagtg acgtccgtcg ctaagactgc ctctgttcgc cacgccaact 300

tctcaaggag ttctttctcc tggtctataa gttcttggcg ggaaaaggag tctgccgcgg 360

catagcaaag tgaactggta gaaataggcg tgaggcttct gagcttactg gccactaaca 420

ggcaggcgct ccctgtcttt tgaaagtgtt ctttggacac ctgctttata agtaggagtc 480

tgtccaaaag attaagggcc aacgcgacca cgttaggttc taggttgtat tcctggcaaa 540

ctgaaaacat ccatgtgccc agtaacttac gcatatgcga agtaagagat tgttgaaagg 600

tcccaaata 609