本發(fā)明是基于申請日為2013年3月27日，申請?zhí)枮椤?01380018064.8”(國際申請?zhí)枮閜ct/jp2013/059124)，發(fā)明名稱為“經(jīng)修飾的亮氨酸脫氫酶”的專利申請的分案申請。本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的亮氨酸脫氫酶，以及利用所述經(jīng)修飾的亮氨酸脫氫酶分析總分支氨基酸的方法，等等。
背景技術(shù)：
：已知有些氨基酸可成為健康狀況的指標(biāo)。尤其是，支鏈氨基酸(bcaa:l-亮氨酸,l-異亮氨酸和l-纈氨酸)是在各種生物樣品或食品或飲料中大量存在重要氨基酸。所述支鏈氨基酸在活體肌肉中大量存在，已知作為蛋白質(zhì)營養(yǎng)物的標(biāo)記。已知在患有肝硬化和肝性腦病的患者中，血液中支鏈氨基酸的濃度降低，fisher比值和btr值之類的指標(biāo)用作肝臟健康狀況的指標(biāo)以及隨后觀察的指標(biāo)。利用分析儀器的方法，包括高效液相層析(hplc)和lc-ms方法,被廣泛地用作氨基酸分析方法。在總支鏈氨基酸的測定中，應(yīng)用了利用亮氨酸脫氫酶測定btr值的酶試劑盒(例如專利文獻(xiàn)1)，以及利用亮氨酸脫氫酶通過電化學(xué)法測定總支鏈氨基酸的生物傳感器(例如專利文獻(xiàn)2)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:japanesepatentapplicationlaid-openpublicationno.jp2007-289096-a專利文獻(xiàn)2:internationalpublicationno.wo2005/075970技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在利用亮氨酸脫氫酶對總支鏈氨基酸的濃度的測定中，有幾個方面有待改善。例如,總支鏈氨基酸的濃度是利用酶試劑盒中的亮氨酸脫氫酶測定的。但是，在該方法中，應(yīng)用的是直到全部的底物反應(yīng)了才進(jìn)行測定的終點(diǎn)法(endpointmethod)。這是由于亮氨酸脫氫酶對l-亮氨酸,l-異亮氨酸和l-纈氨酸的底物特異性(反應(yīng)速度)不同。野生型的亮氨酸脫氫酶,對于l-異亮氨酸和l-纈氨酸的底物特異性比對l-亮氨酸的底物特異性低，并且對l-異亮氨酸和l-纈氨酸的反應(yīng)速度比對l-亮氨酸的反應(yīng)速度慢。因此,以利用亮氨酸脫氫酶的酶試劑盒測定總支鏈氨基酸的濃度具有反應(yīng)時間長的缺點(diǎn)。此外，當(dāng)存在多種作為亮氨酸脫氫酶底物的氨基酸時，應(yīng)用所述的生物傳感器不能單獨(dú)測定每種支鏈氨基酸的濃度。這是因?yàn)榱涟彼崦摎涿覆粌H與l-亮氨酸反應(yīng)，其還與l-異亮氨酸和l-纈氨酸反應(yīng)。在上述情況下，一般也不能測定出幾種支鏈氨基酸的總的濃度，這是因?yàn)榱涟彼崦摎涿笇-亮氨酸、l-異亮氨酸和l-纈氨酸的底物特異性(反應(yīng)速度)不同。解決技術(shù)問題的手段作為本發(fā)明銳意研究的結(jié)果,本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)想，為了快速地測定總支鏈氨基酸的濃度,通過提高亮氨酸脫氫酶對支鏈氨基酸中的每種氨基酸,特別是l-異亮氨酸和l-纈氨酸，的活性等，來改善亮氨酸脫氫酶對支鏈氨基酸的底物特異性，利用速度法(初始速度法(initialratemethod))測定總支鏈氨基酸的濃度，由此，為改善亮氨酸脫氫酶對支鏈氨基酸的底物特異性，成功地開發(fā)出了經(jīng)修飾的亮氨酸脫氫酶。本發(fā)明的發(fā)明人還成功地改善了與總支鏈氨基酸的濃度測定相關(guān)的亮氨酸脫氫酶的其他特性,并由此完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明如下：[1]經(jīng)修飾的酶，其中的至少一個氨基酸殘基被突變，以改善選自下述的、亮氨酸脫氫酶一種或多種特性:(a)亮氨酸脫氫酶對總支鏈氨基酸的底物特異性；(b)亮氨酸脫氫酶對任意支鏈氨基酸的活性；和(c)亮氨酸脫氫酶的熱穩(wěn)定性。[2][1]的經(jīng)修飾的酶,其中所述的突變是，亮氨酸脫氫酶氨基酸序列中的tgi基序中的異亮氨酸的取代。[3][2]的經(jīng)修飾的酶,其中所述的tgi基序中的異亮氨酸被甲硫氨酸,精氨酸,組氨酸,苯丙氨酸,亮氨酸,賴氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,丙氨酸,甘氨酸,絲氨酸,天冬酰胺,或色氨酸取代。[4][1]-[3]中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶,其中所述的突變是亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列中的gvi基序中的異亮氨酸的取代。[5][4]的經(jīng)修飾的酶,其中所述的gvi基序中的異亮氨酸被苯丙氨酸,組氨酸,天冬酰胺,酪氨酸,亮氨酸,賴氨酸,谷胺酰胺,精氨酸,天冬氨酸,蘇氨酸,谷氨酸,絲氨酸,半胱氨酸,丙氨酸,甘氨酸,纈氨酸,色氨酸,或甲硫氨酸取代。[6][1]-[5]中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶,其中所述的亮氨酸脫氫酶來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌(geobacillusstearothermophilus)。[7][1]-[6]中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶,其是以下(1)或(2)的蛋白質(zhì):(1)蛋白質(zhì)，其包含在seqidno:2的氨基酸序列的tgi基序中的異亮氨酸和/或gvi基序中的異亮氨酸被下述(i)和/或(ii)的氨基酸殘基取代的氨基酸序列：(i)tgi基序中的異亮氨酸被甲硫氨酸,精氨酸,組氨酸,苯丙氨酸,亮氨酸,賴氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,丙氨酸,甘氨酸,絲氨酸,天冬酰胺,或色氨酸取代；和/或(ii)gvi基序中的異亮氨酸被苯丙氨酸,組氨酸,天冬酰胺,酪氨酸,亮氨酸,賴氨酸,谷胺酰胺,精氨酸,天冬氨酸,蘇氨酸,谷氨酸,絲氨酸,半胱氨酸,丙氨酸,甘氨酸,纈氨酸,色氨酸,或甲硫氨酸取代；或(2)蛋白質(zhì)，其包含在seqidno:2的氨基酸序列的tgi基序中的異亮氨酸和/或gvi基序中的異亮氨酸被上述(i)和/或(ii)的氨基酸殘基取代的氨基酸序列中，具有一個或數(shù)個附加的氨基酸殘基突變的氨基酸序列,并具有選自下述的、一個或以上被改善的特性:(a)亮氨酸脫氫酶對總支鏈氨基酸的底物特異性；(b)亮氨酸脫氫酶對任意支鏈氨基酸的活性；和(c)亮氨酸脫氫酶的熱穩(wěn)定性。[8]總支鏈氨基酸的分析方法,其包括利用[1]-[7]中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶測定試驗(yàn)樣品中所包含的總支鏈氨基酸。[9][8]的方法,其包括將試驗(yàn)樣品與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)混合，并檢測在所述的經(jīng)修飾的酶的作用下由nad+形成的nadh。[10]支鏈氨基酸衍生物的生產(chǎn)方法,其包括利用[1]-[7]中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶形成來自支鏈氨基酸的衍生物。[11]編碼[1]-[7]中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶的多核苷酸。[12]包含[11]的多核苷酸的表達(dá)載體。[13]包含[12]的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。[14]經(jīng)修飾的酶的生產(chǎn)方法，該經(jīng)修飾的酶中至少一個氨基酸殘基被突變以改善與總支鏈氨基酸測定相關(guān)的亮氨酸脫氫酶的特性，所述方法包括利用[13]的轉(zhuǎn)化體形成該經(jīng)修飾的酶。[15]分析總支鏈氨基酸的試劑盒,其包含[1]-[7]中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶。[16][15]的分析總支鏈氨基酸的試劑盒,其還包含反應(yīng)緩沖液和緩沖鹽、緩沖液和緩沖鹽、以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)中的至少一種。[17]用于分析總支鏈氨基酸的酶傳感器,其包括(a)檢測用電極，和(b)固定于或保持在所述檢測用電極上的、[1]-[7]中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶。發(fā)明效果由于本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶的底物特異性得到改善，其不僅可通過終點(diǎn)法還可以通過速度法(初始速度法)用于快速測定總支鏈氨基酸的濃度。鑒于本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶對支鏈氨基酸的活性被增強(qiáng)，其也可用于任意支鏈氨基酸的測定和/或生產(chǎn)任意支鏈氨基酸的衍生物(例如2-氧代-衍生物)。由于本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶在水溶液中具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，其穩(wěn)定性極佳。因此，本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶尤其適合用作液體試劑。本發(fā)明的分析方法可用于，諸如肝硬化，肝性腦病之類的疾病診斷。附圖簡述圖1顯示每種野生型的亮氨酸脫氫酶對每種支鏈氨基酸(l-亮氨酸,l-異亮氨酸和l-纈氨酸)的底物特異性；圖2顯示每種支鏈氨基酸(l-亮氨酸,l-異亮氨酸和l-纈氨酸)與野生型的酶或經(jīng)修飾的酶i136r反應(yīng)時，吸光度隨時間的變化(n＝3的平均值)；圖3顯示在吸光度變化(n＝3的平均值)過程中，野生型的酶或經(jīng)修飾的酶i136r對不同濃度下的每種支鏈氨基酸(l-亮氨酸,l-異亮氨酸和l-纈氨酸)的活性，并顯示出由這些值制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線；和圖4顯示通過酶法和氨基酸分析儀測定的大鼠血漿樣品中總bcaa的濃度(n＝3的平均值)。實(shí)施本發(fā)明的具體方案本發(fā)明提供經(jīng)修飾的酶。本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶可以是，為改善與總支鏈氨基酸測定相關(guān)的亮氨酸脫氫酶的特性，其中的至少一個氨基酸殘基被突變的亮氨酸脫氫酶。氨基酸殘基突變的示例可包括取代,缺失,添加和插入,優(yōu)選取代。被突變的氨基酸殘基是l-丙氨酸(a),l-天冬酰胺(n),l-半胱氨酸(c),l-谷胺酰胺(q),甘氨酸(g),l-異亮氨酸(i),l-亮氨酸(l),l-甲硫氨酸(m),l-苯丙氨酸(f),l-脯氨酸(p),l-絲氨酸(s),l-蘇氨酸(t),l-色氨酸(w),l-酪氨酸(y),l-纈氨酸(v),l-天冬氨酸(d),l-谷氨酸(e),l-精氨酸(r),l-組氨酸(h)或l-賴氨酸(k)，其是天然的l-α-氨基酸。當(dāng)所述的突變是取代,添加或插入時,被取代，添加或插入的氨基酸殘基和上述被突變的氨基酸殘基相同。所述的支鏈氨基酸(bcaa)指l-亮氨酸,l-異亮氨酸或l-纈氨酸，其是天然的l-α-氨基酸中具有支鏈作為側(cè)鏈的l-α-氨基酸。在總支鏈氨基酸的測定中，全部的支鏈氨基酸(即,l-亮氨酸,l-異亮氨酸和l-纈氨酸)被測定。所述的亮氨酸脫氫酶是催化下述反應(yīng)的氧化還原酶(ec1.4.1.9)。l-亮氨酸+h2o+nad+→4-甲基-2-羥戊酸(oxopentanoicacid)+nh3+nadh+h+已知，盡管野生型的亮氨酸脫氫酶不僅作用于l-亮氨酸，也作用于l-異亮氨酸和l-纈氨酸,其對l-異亮氨酸和l-纈氨酸的活性比對l-亮氨酸的活性低。圖1中顯示，來自芽孢桿菌(bacillussp.)和嗜熱脂肪土芽孢桿菌的野生型的亮氨酸脫氫酶對l-亮氨酸,l-異亮氨酸和l-纈氨酸的底物特異性，其以對l-亮氨酸的相對活性為100的相對活性表示。如圖1所示,野生型的亮氨酸脫氫酶的活性對l-亮氨酸之外的支鏈氨基酸相對低，特別是相對于對l-亮氨酸的活性，其對l-異亮氨酸的相對活性為75以下。作為本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶的來源的亮氨酸脫氫酶可以是來源于任意生物(例如微生物，如細(xì)菌,放線菌和真菌,以及昆蟲,魚類,動物和植物)的酶。所述的亮氨酸脫氫酶的示例包括來自屬于芽孢桿菌屬以及相關(guān)的屬的生物的酶。與芽孢桿菌屬相關(guān)的屬的示例可包括土芽孢桿菌屬(geobacillus),類芽孢桿菌屬(paenibacillus)和海洋芽孢桿菌屬(oceanobacillus)。所述與芽孢桿菌屬相關(guān)的屬，是與芽孢桿菌屬同屬于芽孢桿菌科的屬。屬于芽孢桿菌屬及與之相關(guān)的屬的微生物可包括球形芽孢桿菌(bacillussphaericus),蠟狀芽孢桿菌(bacilluscereus),地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis),芽孢桿菌(bacillussp.),以及嗜熱脂肪土芽孢桿菌(geobacillusstearothermophilus)。向亮氨酸脫氫酶中導(dǎo)入突變的位點(diǎn)，優(yōu)選地是位于亮氨酸脫氫酶活性中心附近的氨基酸殘基。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠?qū)碜允葻嶂就裂挎邨U菌的亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列與另一種亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列比對(align)，由此容易地確定來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌之外的生物的亮氨酸脫氫酶中位于活性中心附近的氨基酸殘基。此外，有關(guān)亮氨酸脫氫酶的三維結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果已有報道(參見,例如bakeretal.,structure3:693-705(1995))。因此,基于所述三維結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員也可以容易地確定來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌之外的生物的亮氨酸脫氫酶中位于活性中心附近的氨基酸殘基。在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中,與總支鏈氨基酸測定相關(guān)的、以改善亮氨酸脫氫酶的特性的突變是野生型亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列中tgi基序中的異亮氨酸(i)的取代。所述的tgi基序由三個連續(xù)的氨基酸殘基，蘇氨酸(t)-甘氨酸(g)-異亮氨酸(i)組成。根據(jù)酶來源的不同，所述野生型亮氨酸脫氫酶氨基酸序列中的tgi基序的位置可能不同。但是，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)卮_定所述野生型亮氨酸脫氫酶氨基酸序列中的tgi基序的位置，由此確定待被取代的異亮氨酸(i)的位置。通常,在所述野生型亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列中,所述的tgi基序位于第134-138位氨基酸的區(qū)域內(nèi)，所述的異亮氨酸(i)位于第136-138位(參見,例如表1)。表1.亮氨酸脫氫酶中tgi基序的位置在另一個優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，與總支鏈氨基酸測定相關(guān)的、以改善所述亮氨酸脫氫酶的特性的突變是，所述野生型亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列的中g(shù)vi基序中異亮氨酸(i)的取代。所述的gvi基序由三個連續(xù)的氨基酸殘基，甘氨酸(g)-纈氨酸(v)-異亮氨酸(i)組成。根據(jù)酶來源的不同，所述野生型亮氨酸脫氫酶氨基酸序列中的gvi基序的位置可能不同。但是，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)卮_定所述野生型亮氨酸脫氫酶氨基酸序列中的gvi基序的位置，由此確定待被取代的異亮氨酸(i)的位置。通常,在所述野生型亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列中,所述gvi基序位于第290–294位的氨基酸區(qū)域,異亮氨酸(i)位于第292–294位(參見,例如表2)。作為與總支鏈氨基酸測定相關(guān)的、以改善所述亮氨酸脫氫酶的特性的突變，本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶在gvi基序中的異亮氨酸(i)取代以外，還可以包含上述tgi基序中的異亮氨酸(i)取代。表2.亮氨酸脫氫酶中g(shù)vi基序的位置與總支鏈氨基酸測定相關(guān)的亮氨酸脫氫酶的特性可包括:(a)亮氨酸脫氫酶對總支鏈氨基酸的底物特異性；(b)亮氨酸脫氫酶對任意支鏈氨基酸的活性；和(c)亮氨酸脫氫酶的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶可以僅具有一種前面所提到的特性,或者可以具有兩種或三種前面所提到的特性的組合。對于tgi基序中的異亮氨酸(i),用以改善選自(a)-(c)中至少一種特性的突變可包括，被取代為例如，甲硫氨酸(m),精氨酸(r),組氨酸(h),苯丙氨酸(f),亮氨酸(l),賴氨酸(k),半胱氨酸(c),酪氨酸(y),丙氨酸(a),甘氨酸(g),絲氨酸(s),天冬酰胺(n)和色氨酸(w)。對于gvi基序中的異亮氨酸(i),用以改善選自(a)-(c)中至少一種特性的突變可包括，被取代為例如，苯丙氨酸(f),組氨酸(h),天冬酰胺(n),酪氨酸(y),亮氨酸(l),賴氨酸(k),谷胺酰胺(q),精氨酸(r),天冬氨酸(d),蘇氨酸(t),谷氨酸(e),絲氨酸(s),半胱氨酸(c),丙氨酸(a),甘氨酸(g),纈氨酸(v),色氨酸(w)和甲硫氨酸(m)。本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶可以在任何ph條件下使用，并適宜在中性條件和/或堿性條件下使用。適于應(yīng)用本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶的中性條件指ph6.0以上、ph8.0以下范圍內(nèi)的任意ph條件。優(yōu)選地,所述中性條件是ph7.0以上、ph8.0以下(例如ph7.0,ph7.5或ph8.0)的任意ph條件。適于應(yīng)用本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶的堿性條件指ph8.0以上、ph11.0以下范圍內(nèi)的任意ph條件。優(yōu)選地,所述堿性條件ph范圍的上限優(yōu)選地是10.5以下，更優(yōu)選地10.0以下。特別優(yōu)選地,所述堿性條件ph8.5以上、ph9.5以下(例如ph9.0)范圍內(nèi)的任意ph條件。在一個具體實(shí)施方案中,所述亮氨酸脫氫酶對總支鏈氨基酸的底物特異性，作為與總支鏈氨基酸測定相關(guān)的亮氨酸脫氫酶的特性被改善。所述亮氨酸脫氫酶對總支鏈氨基酸的底物特異性的改善，并非旨在增強(qiáng)亮氨酸脫氫酶對某種支鏈氨基酸的底物特異性,而是對全部支鏈氨基酸(即,l-亮氨酸,l-異亮氨酸和l-纈氨酸)的底物特異性(反應(yīng)速度)更均衡。具體而言,亮氨酸脫氫酶對總支鏈氨基酸的底物特異性的改善可通過下述方式實(shí)現(xiàn)，即，當(dāng)以亮氨酸脫氫酶對亮氨酸的相對活性為100時，相比于野生型的酶對異亮氨酸和纈氨酸各自的相對活性，經(jīng)修飾的酶對異亮氨酸和纈氨酸各自的相對活性更接近100。關(guān)于亮氨酸脫氫酶對總支鏈氨基酸的底物特異性,當(dāng)以亮氨酸脫氫酶對亮氨酸的相對活性為100時，亮氨酸脫氫酶對異亮氨酸和纈氨酸的相對活性優(yōu)選地為80以上、120以下,更優(yōu)選地為85以上、115以下,更加優(yōu)選地為90以上、110以下,特別優(yōu)選地為95以上、105以下。當(dāng)以亮氨酸脫氫酶對亮氨酸的相對活性為100時，亮氨酸脫氫酶對異亮氨酸和纈氨酸的相對活性為80以上、120以下的本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶中的修飾的示例可包括1)適合于改善堿性條件下的底物特異性的、以下述的氨基酸殘基對tgi基序中的異亮氨酸(i)的取代和/或以下述的氨基酸殘基對gvi基序中的異亮氨酸(i)的取代,以及2)適合于改善中性條件下的所述特性的、以下述的氨基酸殘基對tgi基序中的異亮氨酸(i)的取代和/或以下述的氨基酸殘基對gvi基序中的異亮氨酸(i)的取代。1)適合于改善堿性條件下的底物特異性的取代(a)第136位被取代后的氨基酸殘基(堿性條件)甲硫氨酸(m),精氨酸(r),苯丙氨酸(f),賴氨酸(k),半胱氨酸(c),酪氨酸(y),丙氨酸(a),甘氨酸(g)或絲氨酸(s)。(b)第292位被取代后的氨基酸殘基(堿性條件)苯丙氨酸(f),組氨酸(h),天冬酰胺(n),酪氨酸(y),賴氨酸(k),谷胺酰胺(q),谷氨酸(e)或甘氨酸(g)。2)適合于改善中性條件下的底物特異性的取代(c)第136位被取代后的氨基酸殘基(中性條件)丙氨酸(a),甘氨酸(g),組氨酸(h),賴氨酸(k),亮氨酸(l),絲氨酸(s)或酪氨酸(y)。(d)第292位被取代后的氨基酸殘基(中性條件)丙氨酸(a),半胱氨酸(c),天冬氨酸(d),甘氨酸(g),賴氨酸(k),亮氨酸(l),甲硫氨酸(m),精氨酸(r),絲氨酸(s),蘇氨酸(t)或纈氨酸(v)。在另一具體實(shí)施方案中,作為與總支鏈氨基酸測定相關(guān)的亮氨酸脫氫酶的特性，亮氨酸脫氫酶對任意支鏈氨基酸的活性被改善。所述亮氨酸脫氫酶對任意支鏈氨基酸的活性的改善指，相比于野生型的酶，所述經(jīng)修飾的酶對選自l-亮氨酸,l-異亮氨酸和l-纈氨酸的一個或以上的氨基酸的活性提高了。具體而言,所述亮氨酸脫氫酶對任意支鏈氨基酸的活性的改善可通過下述方式實(shí)現(xiàn)，即，當(dāng)以野生型的亮氨酸脫氫酶對選自l-亮氨酸,l-異亮氨酸和l-纈氨酸的一個或以上的氨基酸的活性為100時，所述經(jīng)修飾的酶對所述氨基酸的活性高于100。此種經(jīng)修飾的酶可以快速地測定單個的支鏈氨基酸,并因此對測定總支鏈氨基酸有用。經(jīng)修飾的酶活性的增強(qiáng)水平，優(yōu)選地是野生型的酶的1.3倍以上,更優(yōu)選地是1.5倍以上,更加優(yōu)選地是1.7倍以上,特別優(yōu)選地是2.0倍以上。相比于野生型的酶，活性增強(qiáng)1.3倍以上的本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶中的修飾的示例包括1)適合于改善堿性條件下的活性的、以下述的氨基酸殘基對tgi基序中的異亮氨酸(i)的取代，和/或以下述的氨基酸殘基對gvi基序中的異亮氨酸(i)的取代,以及2)適合于改善中性條件下的活性的、以下述的氨基酸殘基對tgi基序中的異亮氨酸(i)的取代，和/或以下述的氨基酸殘基對gvi基序中的異亮氨酸(i)的取代。1)適合于改善中性條件下的活性的取代1-1)第136位被取代后的氨基酸殘基(堿性條件)(i)對l-亮氨酸的活性的增強(qiáng)(堿性條件)甲硫氨酸(m),精氨酸(r),組氨酸(h),苯丙氨酸(f),亮氨酸(l),賴氨酸(k),半胱氨酸(c),酪氨酸(y),丙氨酸(a),甘氨酸(g),絲氨酸(s),天冬酰胺(n),或色氨酸(w)。(ii)對l-異亮氨酸的活性的增強(qiáng)(堿性條件)甲硫氨酸(m),精氨酸(r),組氨酸(h),苯丙氨酸(f),亮氨酸(l),賴氨酸(k),半胱氨酸(c),酪氨酸(y),丙氨酸(a),甘氨酸(g),絲氨酸(s),天冬酰胺(n),或色氨酸(w)。(iii)對l-纈氨酸的活性的增強(qiáng)(堿性條件)甲硫氨酸(m),精氨酸(r),組氨酸(h),苯丙氨酸(f),亮氨酸(l),賴氨酸(k),半胱氨酸(c),酪氨酸(y),丙氨酸(a),甘氨酸(g),絲氨酸(s),天冬酰胺(n),或色氨酸(w)。1-2)第292位被取代后的氨基酸殘基(堿性條件)(iv)對l-亮氨酸活性的增強(qiáng)(堿性條件)苯丙氨酸(f),組氨酸(h),天冬酰胺(n),酪氨酸(y),亮氨酸(l),賴氨酸(k),谷胺酰胺(q),精氨酸(r),天冬氨酸(d),蘇氨酸(t),谷氨酸(e),絲氨酸(s),半胱氨酸(c),丙氨酸(a),或甘氨酸(g)。(v)對l-異亮氨酸的活性的增強(qiáng)(堿性條件)苯丙氨酸(f),組氨酸(h),天冬酰胺(n),酪氨酸(y),亮氨酸(l),賴氨酸(k),谷胺酰胺(q),精氨酸(r),天冬氨酸(d),蘇氨酸(t),谷氨酸(e),絲氨酸(s),半胱氨酸(c),丙氨酸(a),甘氨酸(g),纈氨酸(v),或色氨酸(w)。(vi)對l-纈氨酸的活性的增強(qiáng)(堿性條件)苯丙氨酸(f),組氨酸(h),天冬酰胺(n),酪氨酸(y),亮氨酸(l),賴氨酸(k),谷胺酰胺(q),精氨酸(r),天冬氨酸(d),蘇氨酸(t),谷氨酸(e),絲氨酸(s),半胱氨酸(c),丙氨酸(a),甘氨酸(g),或纈氨酸(v)。2)適合于改善中性條件下活性的取代2-1)第136位被取代后的氨基酸殘基(中性條件)(i')對l-亮氨酸的活性的增強(qiáng)(中性條件)丙氨酸(a),半胱氨酸(c),苯丙氨酸(f),甘氨酸(g),組氨酸(h),賴氨酸(k),亮氨酸(l),甲硫氨酸(m),天冬酰胺(n),精氨酸(r),絲氨酸(s),色氨酸(w),或酪氨酸(y)。(ii')對l-異亮氨酸的活性的增強(qiáng)(中性條件)丙氨酸(a),半胱氨酸(c),苯丙氨酸(f),甘氨酸(g),組氨酸(h),賴氨酸(k),亮氨酸(l),甲硫氨酸(m),天冬酰胺(n),精氨酸(r),絲氨酸(s),色氨酸(w),或酪氨酸(y)。(iii')對l-纈氨酸的活性的增強(qiáng)(中性條件)丙氨酸(a),半胱氨酸(c),苯丙氨酸(f),甘氨酸(g),組氨酸(h),賴氨酸(k),亮氨酸(l),甲硫氨酸(m),天冬酰胺(n),谷胺酰胺(q),精氨酸(r),絲氨酸(s),色氨酸(w),或酪氨酸(y)。2-2)第292位被取代后的氨基酸殘基(中性條件)(iv')對l-亮氨酸的活性的增強(qiáng)(中性條件)丙氨酸(a),半胱氨酸(c),天冬氨酸(d),谷氨酸(e),苯丙氨酸(f),甘氨酸(g),組氨酸(h),賴氨酸(k),亮氨酸(l),甲硫氨酸(m),天冬酰胺(n),谷胺酰胺(q),精氨酸(r),絲氨酸(s),蘇氨酸(t),纈氨酸(v),色氨酸(w),或酪氨酸(y)。(v')對l-異亮氨酸的活性的增強(qiáng)(中性條件)丙氨酸(a),半胱氨酸(c),天冬氨酸(d),谷氨酸(e),苯丙氨酸(f),甘氨酸(g),組氨酸(h),賴氨酸(k),亮氨酸(l),甲硫氨酸(m),天冬酰胺(n),谷胺酰胺(q),精氨酸(r),絲氨酸(s),蘇氨酸(t),色氨酸(w),或酪氨酸(y)。(vi')對l-纈氨酸的活性的增強(qiáng)(中性條件)丙氨酸(a),半胱氨酸(c),天冬氨酸(d),谷氨酸(e),苯丙氨酸(f),甘氨酸(g),組氨酸(h),賴氨酸(k),亮氨酸(l),甲硫氨酸(m),天冬酰胺(n),谷胺酰胺(q),精氨酸(r),絲氨酸(s),蘇氨酸(t),纈氨酸(v),色氨酸(w),或酪氨酸(y)。在又一具體實(shí)施方案中,作為與總支鏈氨基酸測定相關(guān)的亮氨酸脫氫酶的特性，亮氨酸脫氫酶的熱穩(wěn)定性被改善。所述亮氨酸脫氫酶的熱穩(wěn)定性的改善的意思是相對于野生型的酶，所述經(jīng)修飾的酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)一步增強(qiáng)。具體而言,所述亮氨酸脫氫酶的熱穩(wěn)定性的增強(qiáng)可通過下述方式實(shí)現(xiàn)，即，當(dāng)將所述的酶在60℃的水溶液中處理1小時，所述的經(jīng)修飾的酶的殘留活性高于野生型的酶的殘留活性。水溶液中的亮氨酸脫氫酶熱穩(wěn)定性(特別是液態(tài)穩(wěn)定性)試驗(yàn)作為評價所述經(jīng)修飾酶的熱穩(wěn)定性的加速試驗(yàn)具有重要意義。因此,當(dāng)所述的經(jīng)修飾的酶在水溶液中的熱穩(wěn)定性高時，所述經(jīng)修飾的酶的穩(wěn)定性(特別是液態(tài)穩(wěn)定性)也傾向于較高。表現(xiàn)出高液態(tài)穩(wěn)定性的酶可以液態(tài)形式長時間保存，因此，這種經(jīng)修飾的酶，作為液體試劑可用于測定總支鏈氨基酸。所述的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的程度，優(yōu)選地是野生型的酶的熱穩(wěn)定性的1.1倍以上，更優(yōu)選地1.2倍以上。相對于野生型的酶熱穩(wěn)定性增強(qiáng)1.1倍以上的、本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶的修飾，可包括以下述的氨基酸殘基對tgi基序中的異亮氨酸(i)的取代，和/或以下述的氨基酸殘基對gvi基序中的異亮氨酸(i)的取代。第136位被取代后的氨基酸殘基甲硫氨酸(m),精氨酸(r),苯丙氨酸(f),或賴氨酸(k)。第292位被取代后的氨基酸殘基苯丙氨酸(f)本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶還可以在c-末端或n-末端具有另外的肽組分(例如標(biāo)簽部分)所述可以添加到本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶的另外的肽組分的示例可以包括，可使得目標(biāo)蛋白更易于純化的肽組分(例如標(biāo)簽部分，如組氨酸標(biāo)簽和strep-標(biāo)簽ii；如谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶和麥芽糖結(jié)合蛋白等用于純化目標(biāo)蛋白的蛋白),增強(qiáng)所述目標(biāo)蛋白質(zhì)可溶性的肽組分(例如nus-標(biāo)簽),起伴侶蛋白作用的肽組分(例如觸發(fā)因子),以具有其他功能的蛋白質(zhì)或其結(jié)構(gòu)域，或是作為接頭將它們連接起來的肽組分。本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶，在保有前面所提到的特性的條件下，在具有上述突變的亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列中還可以具有一個或數(shù)個氨基酸殘基的附加突變(例如取代,缺失,插入和添加)。被導(dǎo)入所述附加突變的氨基酸殘基的數(shù)目,例如,1–100個,優(yōu)選地1–50個,更優(yōu)選地1–40個,更加優(yōu)選地1–30個，最優(yōu)選地1–20個和1–10個(例如1,2,3,4或5個)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)刂苽浔Ｓ星懊嫠岬降奶匦缘倪@種經(jīng)修飾的酶。因此,本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶可能是下述的(i)或(ii):(i)蛋白質(zhì)，其包含在亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列的tgi基序中和/或gvi基序中的異亮氨酸(i)突變(例如取代)的氨基酸序列,并具有與總支鏈氨基酸測定相關(guān)的亮氨酸脫氫酶的特性的改善；或(ii)蛋白質(zhì)，其包含，在具有亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列的tgi基序中的和/或gvi基序中的異亮氨酸(i)突變(例如取代)的氨基酸序列中，具有一個或數(shù)個氨基酸殘基的附加突變的氨基酸序列,并具有與總支鏈氨基酸測定相關(guān)的亮氨酸脫氫酶的特性的改善。本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶還可以，由于前面提到的突變和附加突變，包含與其突變前的(野生型)亮氨酸脫氫酶具有至少90％以上序列同一性的氨基酸序列。氨基酸序列同一性的百分比優(yōu)選地可以是92％以上,更優(yōu)選95％以上,更加優(yōu)選97％以上,最優(yōu)選98％以上或99％以上。氨基酸序列之間的同一性可以通過，例如,利用karlin和altschul的算法blast(pro.natl.acad.sci.usa,90,5873(1993))和pearson的fasta(methodsenzymol.,183,63(1990))確定。已基于算法blast開發(fā)出了稱作blastp的程序(參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。因此，氨基酸序列之間的同一性可利用這些程序在默認(rèn)設(shè)置下計(jì)算出來。也可以使用，例如,采用lipman-pearson方法的、genetyx公司的軟件genetyxver.7.09，以unitsizetocompare＝2的設(shè)定，利用在orf中編碼的全長多肽部分，計(jì)算出百分比形式的同一性，以由此所獲得的數(shù)值用作氨基酸序列之間的同一性。可將來自這些計(jì)算方法的值中的最低值用作所述氨基酸序列間的同一性。在氨基酸序列中，可以被導(dǎo)入附加突變的氨基酸殘基的位置，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。例如,可以參照所述氨基酸序列的比對引入所述的附加突變。具體而言,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以(1)比較多個同系物(homologs)(例如seqidno:2所示的氨基酸序列和其他同系物的氨基酸序列)的氨基酸序列,(2)證明相對保守的區(qū)域和相對不保守的區(qū)域，而后(3)由相對保守的區(qū)域和相對不保守的區(qū)域，分別地預(yù)測出能對功能起重要作用的區(qū)域，以及不能對功能起重要作用的區(qū)域，由此認(rèn)識結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性。如上所述，亮氨酸脫氫酶的三維結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果已有報道。由此，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠基于所述的三維結(jié)構(gòu)分析結(jié)果在保持前面所提到的特性的前體下引入所述的附加突變。當(dāng)所述氨基酸殘基的附加突變是取代時,所述氨基酸殘基的取代可以是保守取代。術(shù)語"保守取代"指用具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代給定的氨基酸殘基。具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族是本領(lǐng)域已知的。此類家族的示例可包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸,精氨酸,組氨酸),具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸,谷氨酸),具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如精氨酸,谷胺酰胺,絲氨酸,蘇氨酸,酪氨酸,半胱氨酸),具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸,丙氨酸,纈氨酸,亮氨酸,異亮氨酸,脯氨酸,苯丙氨酸,甲硫氨酸,色氨酸),在β位具有分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸,纈氨酸,異亮氨酸),具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸,苯丙氨酸,色氨酸,組氨酸),具有含羥基(例如醇式的和酚式的)側(cè)鏈的氨基酸(例如絲氨酸,蘇氨酸,酪氨酸),和具有含硫側(cè)鏈的氨基酸(例如半胱氨酸,甲硫氨酸)。優(yōu)選地,所述氨基酸的保守取代可以是天冬氨酸和谷氨酸之間的取代,精氨酸,賴氨酸和組氨酸之間的取代,色氨酸和苯丙氨酸之間的取代,苯丙氨酸和纈氨酸之間的取代,亮氨酸,異亮氨酸和丙氨酸之間的取代,以及甘氨酸和丙氨酸之間的取代。可以利用表達(dá)本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶的、本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，或者利用無細(xì)胞系統(tǒng)，制備本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可通過下述方式制備,例如通過制備本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶的表達(dá)載體,并將所述表達(dá)載體引入到宿主細(xì)胞中。例如,通過制備已引入了本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體，并將所述表達(dá)載體引入到合適的宿主細(xì)胞中，由此來獲得本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。多種原核細(xì)胞，包括屬于埃希氏桿菌屬(escherichia)(例如大腸桿菌(escherichiacoli)),棒桿菌屬(corynebacterium)(例如谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum))和芽孢桿菌屬(bacillus)(例如枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis))的細(xì)菌,和多種真核細(xì)胞，包括來自屬于酵母屬(saccharomyces)(例如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)),畢赤氏酵母屬(pichia)(例如具柄畢赤氏酵母(pichiastipitis)和曲霉屬(aspergillus)(例如米曲霉(aspergillusoryzae)的真菌的細(xì)胞，可用作表達(dá)本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶的宿主。缺失了特定基因的菌株可用作所述的宿主。所述轉(zhuǎn)化體的示例可包括，在其細(xì)胞質(zhì)中保留有所述載體的轉(zhuǎn)化體，以及在其基因組中整合了目的基因的轉(zhuǎn)化體?？衫媒o定的培養(yǎng)設(shè)備(例如試管，燒瓶和搖瓶發(fā)酵器)，在具有下述組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。可適當(dāng)?shù)卮_定培養(yǎng)條件。具體而言,培養(yǎng)溫度可以是25-37℃,ph值可以是6.5-7.5,培養(yǎng)時間可以在1-100小時。也可以在控制溶氧濃度的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。在該種情況下，溶氧濃度(do值)可用作控制指標(biāo)?？煽刂仆L(fēng)/攪拌條件以使得，在空氣中的氧濃度為21％時，相對溶氧濃度,do值不低于1-10％例如,優(yōu)選不低于3-8％。所述的培養(yǎng)可以是分批培養(yǎng)或補(bǔ)料-分批培養(yǎng)。在補(bǔ)料-分批培養(yǎng)的情況下,可隨后向培養(yǎng)液中連續(xù)地或非連續(xù)地添加糖原和含磷酸的溶液，以使得所述的培養(yǎng)連續(xù)進(jìn)行。以上描述了待轉(zhuǎn)化的宿主,下面對大腸桿菌進(jìn)行詳細(xì)描述,所述的宿主可以選自大腸桿菌k12亞種的，大腸桿菌jm109菌株,dh5α菌株,hb101菌株,bl21(de3)菌株,等等。實(shí)施轉(zhuǎn)化的方法和選擇轉(zhuǎn)化體的方法已在molecularcloning:alaboratorymanual,3rdedition,coldspringharborpress(2001/01/15),等文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述。以下，制備經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的方法以及用其生產(chǎn)預(yù)定的酶的方法將作為一個實(shí)施例進(jìn)行具體描述。用于在大腸桿菌中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的啟動子一般可以作為表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的啟動子。例如，phoa,phoc,t7啟動子,lac啟動子,trp啟動子,trc啟動子,tac啟動子,λ噬菌體的pr和pl啟動子,和t5啟動子等強(qiáng)力啟動子(potentpromoter),優(yōu)選phoa,phoc和lac啟動子?？捎米鬏d體的例如,puc(例如puc19,puc18),pstv,pbr(例如pbr322),phsg(例如phsg299,phsg298,phsg399,phsg398),rsf(例如rsf1010),pacyc(例如pacyc177,pacyc184),pmw(例如pmw119,pmw118,pmw219,pmw218),pqe(例如pqe30)及其衍生物。其他的載體，可以使用來自噬菌體dna的載體。此外，還可以使用包含啟動子，并能表達(dá)插入的dna序列的表達(dá)載體。優(yōu)選地,所述的載體可以是puc,pstv,或pmw。再有，作為轉(zhuǎn)錄終止序列的終止子可以連接到本發(fā)明的多核苷酸的下游。此類終止子的示例可包括t7終止子,fd噬菌體終止子,t4終止子,四環(huán)素抗性基因的終止子，以及大腸桿菌trpa基因的終止子。用于將本發(fā)明的多核苷酸引入到大腸桿菌中的載體，優(yōu)選地是所謂的多拷貝型(multicopytype)載體,其示例可包括具有來自cole1的復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒，如puc-系質(zhì)粒,pbr322-系質(zhì)粒，及其衍生物。此處的"衍生物"指那些通過堿基的取代，缺失，插入和/或添加對給定的質(zhì)粒進(jìn)行修飾的那些。此處所指的"修飾"還包括利用誘變劑,uv輻射等通過誘變，以及天然存在的突變進(jìn)行的修飾。為了選擇轉(zhuǎn)化體,所述載體優(yōu)選地具有標(biāo)記，例如氨芐青霉素抗性基因。具有強(qiáng)力啟動子的表達(dá)載體可通過商業(yè)途徑獲得，如質(zhì)粒(例如puc-系(可由takarabioinc.獲得),pprok-系(可由clontech獲得),pkk233-2-系(可由clontech獲得))。利用所得的本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌并培養(yǎng)所述的大腸桿菌，由此可獲得本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶。作為培養(yǎng)基，可以使用通常用于培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基，例如m9/水解酪蛋白氨基酸培養(yǎng)基和lb培養(yǎng)基。所述的培養(yǎng)基可包含預(yù)定的碳源,氮源,和輔酶(例如鹽酸吡哆醇)。具體而言,可以使用蛋白胨,酵母提取物,nacl,葡萄糖,mgso4,硫酸銨,磷酸二氫鉀,硫酸鐵,硫酸錳,等等。培養(yǎng)條件和生產(chǎn)誘導(dǎo)條件，根據(jù)載體中的標(biāo)記和啟動子的類型以及所使用的宿主適當(dāng)?shù)剡x擇。本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶可通過下述方法回收。通過收集并隨后粉碎(例如超聲或勻漿)或裂解(例如通過溶菌酶處理)微生物細(xì)胞，以粉碎物或經(jīng)裂物的形式獲得本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶。通過抽提，沉淀，過濾和柱層析等技術(shù)，由所述粉碎物或經(jīng)裂物獲得本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶。本發(fā)明還提供分析總支鏈氨基酸的方法。本發(fā)明的所述分析方法可包括利用本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶測定試驗(yàn)樣品中所包含的總支鏈氨基酸。所述的試驗(yàn)樣品并沒有特別的限定，只要所述樣品被懷疑含有任意支鏈氨基酸(優(yōu)選總支鏈氨基酸)即可,所述樣品的示例可包括生物樣品(例如血液,尿,唾液,淚液,等等)以及食品和飲料(例如營養(yǎng)飲料和氨基酸飲料)。本發(fā)明的分析方法沒有特別的限定，只要能利用本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶測定總支鏈氨基酸即可。例如,通過在堿性條件或中性條件下,優(yōu)選堿性緩沖液中將試驗(yàn)樣品與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)混合，然后使所述的混合樣品與本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶進(jìn)行酶反應(yīng)，最后檢測在本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶的作用下由nad+形成的nadh，由此測定總支鏈氨基酸。具體而言,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)存在下,使經(jīng)修飾的酶作用于堿性緩沖液中的試驗(yàn)樣品，由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)形成還原形式(nadh)，同時生物樣品中所含底物的氨基被氧化脫氨。由此，通過吸光度(340nm)等檢測nadh，來定量所述的總支鏈氨基酸?；诖祟惙椒ㄕ摰陌被釡y定方法是本領(lǐng)域已知的(參見例如ueatrongchitt,asanoy,analbiochem.,2011mar1；410(1):44-56)。也可以通過所生成的nadh對染料的還原，由吸光度等檢測還原性染料的顯色來定量總支鏈氨基酸。此外,還可以通過電化學(xué)技術(shù)檢測nadh。例如,使所述經(jīng)修飾的酶在堿性或中性條件下作用于試驗(yàn)樣品，通過電化學(xué)氧化所形成的nadh，測定其氧化電流，或者用所生成的nadh還原與之共存的電子介質(zhì)，測定所述還原型電子介質(zhì)的電化學(xué)氧化電流，由此可以測定總支鏈氨基酸。nadh和所述電子介質(zhì)之間的電子轉(zhuǎn)移可由催化劑介導(dǎo)。優(yōu)選地，通過速度法(初始速度法)測定總支鏈氨基酸。本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶不與支鏈氨基酸之外的氨基酸反應(yīng)，或與支鏈氨基酸之外的氨基酸反應(yīng)性低。因此,即使不僅支鏈氨基酸，還有其他氨基酸包含于試驗(yàn)樣品中，也可以利用本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶測定試驗(yàn)樣品中支鏈氨基酸的量。再有，本發(fā)明還包括用于分析總支鏈氨基酸的試劑盒，其包含本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶。本發(fā)明的試劑盒還可以包含反應(yīng)用緩沖溶液或緩沖鹽，以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)中的至少一種。使用反應(yīng)用緩沖溶液或緩沖鹽來維持適合于目的酶反應(yīng)的反應(yīng)溶液中的ph值。所述反應(yīng)用緩沖溶液或緩沖鹽是堿性的或中性的,優(yōu)選堿性。當(dāng)本發(fā)明的試劑盒包含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)時,本發(fā)明的所述試劑盒還可以包含有待被nadh還原的染料。在這種情況下，通過本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶的作用由nad+形成的nadh還原所述染料，可通過吸光度等檢測由被還原的染料的顯色。所述染料的還原可能涉及起電子介質(zhì)作用的物質(zhì)。本發(fā)明還提供用于分析支鏈氨基酸的酶傳感器，其包含(a)檢測用電極，和(b)固定于或保持在所述檢測用電極上的、本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶可直接或間接地固定于或保持在所述檢測用電極上。還可以使用直接或間接檢測通過本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶作為檢測用電極，由總支鏈氨基酸形成的產(chǎn)品或副產(chǎn)品(nh3+nadh+h+)的生物傳感器。更具體而言,檢測用電極的示例包括應(yīng)用本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)的檢測用電極。那些在internationalpublicationno.wo2005/075970和internationalpublicationno.wo00/57166等文獻(xiàn)中所描述的也可以用作所述檢測用電極。具體地，本發(fā)明涉及：1.經(jīng)修飾的酶，其中至少一個氨基酸殘基被突變，以改善亮氨酸脫氫酶的(選自下組的)一種或多種的特性:(a)所述亮氨酸脫氫酶對總支鏈氨基酸的底物特異性；(b)所述亮氨酸脫氫酶對任意支鏈氨基酸的活性；和(c)所述亮氨酸脫氫酶的熱穩(wěn)定性。2.項(xiàng)1的經(jīng)修飾的酶,其中所述的突變是亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列中的tgi基序中的異亮氨酸的取代。3.項(xiàng)2的經(jīng)修飾的酶,其中所述的tgi基序中的異亮氨酸被甲硫氨酸,精氨酸,組氨酸,苯丙氨酸,亮氨酸,賴氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,丙氨酸,甘氨酸,絲氨酸,天冬酰胺天冬酰胺,或色氨酸取代。4.項(xiàng)1-3中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶,其中所述的突變是亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列中的gvi基序中的異亮氨酸的取代。5.項(xiàng)4的經(jīng)修飾的酶,其中所述的gvi基序中的異亮氨酸被苯丙氨酸,組氨酸,天冬酰胺,酪氨酸,亮氨酸,賴氨酸,谷胺酰胺,精氨酸,天冬氨酸,蘇氨酸,谷氨酸,絲氨酸,半胱氨酸,丙氨酸,甘氨酸,纈氨酸,色氨酸,或甲硫氨酸取代。6.項(xiàng)1-5中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶,其中所述的亮氨酸脫氫酶來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌(geobacillusstearothermophilus)。7.項(xiàng)1-6中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶,其是以下(1)或(2)的蛋白質(zhì):(1)蛋白質(zhì)，其包含在seqidno:2的氨基酸序列的tgi基序中的異亮氨酸和/或gvi基序中的異亮氨酸被下述(i)和/或(ii)的氨基酸殘基取代的氨基酸序列：(i)tgi基序中的異亮氨酸被甲硫氨酸,精氨酸,組氨酸,苯丙氨酸,亮氨酸,賴氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,丙氨酸,甘氨酸,絲氨酸,天冬酰胺,或色氨酸取代；和/或(ii)gvi基序中的異亮氨酸被苯丙氨酸,組氨酸,天冬酰胺,酪氨酸,亮氨酸,賴氨酸,谷胺酰胺,精氨酸,天冬氨酸,蘇氨酸,谷氨酸,絲氨酸,半胱氨酸,丙氨酸,甘氨酸,纈氨酸,色氨酸,或甲硫氨酸取代；或(2)蛋白質(zhì)，其包含在seqidno:2的氨基酸序列的tgi基序中的異亮氨酸和/或gvi基序中的異亮氨酸被上述(i)和/或(ii)的氨基酸殘基取代的氨基酸序列中，具有一個或數(shù)個附加的氨基酸殘基突變的氨基酸序列,并具有選自下組的、一種或多種被改善的特性:(a)亮氨酸脫氫酶對總支鏈氨基酸的底物特異性；(b)亮氨酸脫氫酶對任意支鏈氨基酸的活性；和(c)亮氨酸脫氫酶的熱穩(wěn)定性。8.一種分析總支鏈氨基酸的方法,其包括利用項(xiàng)1-7中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶測定試驗(yàn)樣品中所包含的總支鏈氨基酸。9.項(xiàng)8的方法,其包括將試驗(yàn)樣品與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)混合，并檢測在所述經(jīng)修飾的酶的作用下由nad+形成的nadh。10.一種生產(chǎn)支鏈氨基酸衍生物的方法,其包括利用項(xiàng)1-7中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶形成來自支鏈氨基酸的衍生物。11.編碼項(xiàng)1-7中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶的多核苷酸。12.包含項(xiàng)11的多核苷酸的表達(dá)載體。13.包含項(xiàng)12的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。14.一種生產(chǎn)經(jīng)修飾的酶的方法，該經(jīng)修飾的酶中至少一個氨基酸殘基被突變以改善與總支鏈氨基酸測定相關(guān)的亮氨酸脫氫酶的特性，所述方法包括利用項(xiàng)13的轉(zhuǎn)化體形成該經(jīng)修飾的酶。15.一種分析總支鏈氨基酸的試劑盒,其包含1-7中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶。16.項(xiàng)15的分析總支鏈氨基酸的試劑盒,其還包含反應(yīng)緩沖液和緩沖鹽、以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)中的至少一種。17.一種用于分析總支鏈氨基酸的酶傳感器,其包括(a)檢測用電極，和(b)固定于或保持在所述檢測用電極上的、項(xiàng)1-7中任一項(xiàng)的經(jīng)修飾的酶。實(shí)施例參照下述實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于所述實(shí)施例。(酶定量法)在l-亮氨酸,l-異亮氨酸和l-纈氨酸的酶定量法中,使亮氨酸脫氫酶在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)存在下作用于堿性緩沖液中的生物樣品(例如血漿),生物樣品中包含的底物的氨基被氧化脫氨，由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)形成還原產(chǎn)物(nadh)。用微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(spectramaxm2e,moleculardevices制)測定nadh的生成量。實(shí)施例1:經(jīng)修飾的酶(i136r)的生產(chǎn)(1)ldh基因模板的制備(a)培養(yǎng)以及染色體dna的純化將由nationalinstituteoftechnologyandevaluation,biologicalresourcecenter(nbrc)獲得的嗜熱脂肪土芽孢桿菌nbrc12550的凍干顆粒(lyophilizedpellet)懸浮于生長培養(yǎng)基702中，然后將其涂布于生長培養(yǎng)基802的瓊脂培養(yǎng)基上，于50℃過夜培養(yǎng)。將所得的克隆接種于5ml生長培養(yǎng)基702中，于50℃下靜置培養(yǎng)30小時。由這5ml細(xì)胞培養(yǎng)物純化染色體dna，用于下述試驗(yàn)。培養(yǎng)基制備的詳細(xì)內(nèi)容如下述表3所示。表3.培養(yǎng)基組成生長培養(yǎng)基702生長培養(yǎng)基802(b)質(zhì)粒的制備利用invisorbspin質(zhì)粒minikit(invitek制)，依照制造商的建議，從帶有載體的重組大腸桿菌(e.colijm109/puc18his)的培養(yǎng)基中純化，根據(jù)biosci.biotechnol.biochem.2009；73:729-732中所描述的方法制備的puc18his質(zhì)粒。接下來,將7μl經(jīng)純化的質(zhì)粒puc18his的載體dna,2.5μl10×k緩沖液(takarabioinc.制)和各0.8μl的psti和bamhi混合,加入滅菌的超純水使得反應(yīng)液的總體積為25μl,然后于37℃下，用限制酶處理3小時。再然后,將2μl來自于蝦的堿性磷酸酶(roche制)和5μlof×10堿性磷酸酶緩沖液添加到所述25μl反應(yīng)液中,并加入滅菌的超純水使得反應(yīng)液的總體積為50μl,使所述混合物于37℃下反應(yīng)1小時。通過苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀純化所述反應(yīng)溶液，得到20μl溶于te溶液中的脫磷酸化的puc18his載體dna。(c)亮氨酸脫氫酶基因的擴(kuò)增以嗜熱脂肪土芽孢桿菌染色體dna用作模板,利用含bamhi識別位點(diǎn)序列的合成的寡核苷酸引物1:5’-ccggatccgatggaattgttcaaatatatggaaac-3’(seqidno:11)(hokkaidosystemscienceco.,ltd制)和含psti識別位點(diǎn)序列的合成的寡核苷酸引物2:5’-actgcagttatattgccgaagcacc-3’(seqidno:12)(hokkaidosystemscienceco.,ltd制),擴(kuò)增來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌ifo12550的亮氨酸脫氫酶基因，所述的寡核苷酸引物均是基于來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌ifo12550的亮氨酸脫氫酶基因(序列表1；biochemistry,27,9056(1988))制備的。將50ng染色體dna,100pmol/μl合成的寡核苷酸引物各1μl,5μlextaq×10緩沖液(takarabioinc.制),5μl2.5mmdntp混合物(takarabioinc.制),和1μltakaraextaqdna聚合酶(takarabioinc.制)相混合,加入滅菌的超純水使得反應(yīng)液的總體積為滅菌的超純水50μl,由此制備反應(yīng)溶液。用ptc-200peltier熱循環(huán)儀(mjresearchjapan制)進(jìn)行pcr，所述的反應(yīng)于94℃30秒,55℃30秒,72℃下2分鐘，進(jìn)行30個反應(yīng)循環(huán)。電泳pcr產(chǎn)物,在紫外線照射下切出兩種擴(kuò)增產(chǎn)物(約1400bp和1900bp)，利用凝膠提取試劑盒g(shù)el-mtmgelextractionkit(viogene制)提取并純化，獲得50μl的純化產(chǎn)物。接下來,向4μl純化的產(chǎn)物中添加6μl10×k緩沖液(takarabioinc.制)和各1μl的psti和bamhi,加入滅菌的超純水使得反應(yīng)液的總體積為滅菌的超純水60μl。使反應(yīng)溶液于37℃下反應(yīng)3小時，對經(jīng)純化的pcr產(chǎn)物的兩端進(jìn)行處理。使所述反映溶液在60℃下溫育15分鐘，滅活所述限制酶。然后，通過乙醇沉淀純化插入片段。(d)連接和轉(zhuǎn)化將1μl的上述脫磷酸化的質(zhì)粒,5μl的純化插入片段,和6μl的連接混合物(takarabioinc.制)混合,使反應(yīng)溶液的總體積為12μl,在16℃下進(jìn)行連接反應(yīng)，過夜。然后，將用6μl連接反應(yīng)后的反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化的大腸桿菌jm109,涂布含50μg/ml氨芐青霉素的lb瓊脂培養(yǎng)基,于37℃培養(yǎng)10小時。將所得的克隆接種到主平板(masterplate)上，培養(yǎng)，將新形成的克隆接種到含50μg/ml氨芐青霉素的lb瓊脂培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。由培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒dna，用abiprism310遺傳分析儀(appliedbiosystems制)分析其核苷酸序列。經(jīng)確認(rèn)具有正確的來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌的亮氨酸脫氫酶基因的核苷酸序列的克隆被命名為大腸桿菌jm109/puchisldh。(2)制備來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌的亮氨酸脫氫酶的經(jīng)修飾的酶quikchangelightning定點(diǎn)誘變試劑盒(agilenttechnologies)，依照產(chǎn)品所附的說明書，通過向puchisldh中引入定點(diǎn)誘變，制備經(jīng)修飾的酶(i136r)的表達(dá)質(zhì)粒。屆時，序列:5’-gactatgtcaccggccgttcgcccgaattcgg-3’(seqidno:9)和序列:5’-ccgaattcgggcgaacggccggtgacatagtc-3’(seqidno:10)分別用作含突變密碼子的正義引物和反義引物，與轉(zhuǎn)化,培養(yǎng),質(zhì)粒提取,等相關(guān)的試驗(yàn)操作根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。經(jīng)鑒定具有目的核苷酸序列的克隆被命名為大腸桿菌jm109/puchisldh突變體，用于以下的試驗(yàn)。(3)經(jīng)修飾的酶的表達(dá)和純化如前述構(gòu)建的經(jīng)修飾的酶的表達(dá)和純化如下所示。用含編碼經(jīng)修飾的酶(大腸桿菌jm109/puchisldh突變體)的基因的質(zhì)粒puchisldh突變體轉(zhuǎn)化的重組的大腸桿菌克隆，于含50μg/ml氨芐青霉素鹽的5mllb培養(yǎng)基的試管中，在37℃下振蕩培養(yǎng)16小時。將這一培養(yǎng)物接種到裝有100ml含50μg/ml氨芐青霉素鹽的lb培養(yǎng)基的0.5升sakaguchi燒瓶中,于37℃下振蕩培養(yǎng)至o.d.達(dá)到1.0。然后,加入1m異丙基-β-d-半乳糖苷(iptg，nacalaitesqueinc.制)至終濃度1mm,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5小時。離心(8,000rpm,15分鐘,4℃；hitachi高速冷卻離心機(jī),himaccr21ghitachiltd.制)所得的培養(yǎng)液,沉淀所培養(yǎng)的菌體，棄上清。將所得的菌體重懸于含300mmnacl和10mm咪唑的50mmnah2po4緩沖液(ph8.0)中。然后,用超聲破碎裝置(kubotainsonatormodel201m,kubotacorporation制)在4℃下以180w處理15分鐘破碎菌體，提取酶。離心(8,000rpm,15分鐘,4℃；hitachi高速冷凍離心機(jī),himaccr21ghitachiltd.制)細(xì)胞裂解液，上清用作純化酶蛋白的無細(xì)胞提取溶液。所述無細(xì)胞提取溶液應(yīng)用于填充有1mlni-nta樹脂并經(jīng)緩沖液(含300mmnacl和10mm咪唑的50mmnah2po4緩沖液(ph8.0))平衡的柱子(qiagen制)。用5ml洗滌緩沖液(50mm含1mnacl和20mm咪唑的nah2po4緩沖液(ph6.5))洗所述的樹脂,接下來用5ml洗脫緩沖液(含300mmnacl和250mm咪唑的50mmnah2po4緩沖液(ph8.0))將結(jié)合的酶蛋白洗脫出來。用超濾膜(例如vivaspin6100kdamwco，gehealthcare制)濃縮所述洗脫組分。利用microbcaproteinassaykit(thermofisherscientific制)基于利用預(yù)定濃度的牛血清白蛋白制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定蛋白質(zhì)濃度。利用十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳確定經(jīng)純化的酶的純度。實(shí)施例2:底物特異性評價根據(jù)asano等的方法(eur.j.biochem.(1987)168(1),153-159)，用也可以應(yīng)用比色皿的微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(spectramaxm2e,moleculardevices制)，在具有1cm光通道長度的比色皿(bio-rad制)中測定亮氨酸脫氫酶的活性。反應(yīng)溶液的組分如下。0.5ml的0.2m甘氨酸-kcl-koh緩沖液(ph9.0),0.04ml的25mmnad+溶液(sigma制),和0.1ml的0.1ml-亮氨酸(sigma制)或l-異亮氨酸(sigma制)或l-纈氨酸(sigma制)溶液，添加適量的酶溶液使反應(yīng)溶液的體積為1.0ml。酶反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1分鐘，測定340nm下的吸光度變化。結(jié)果如圖2中所示。以野生型(wt)為模板導(dǎo)入了突變的經(jīng)修飾的酶(i136r)對各bcaa的相對活性均得以改善。下文中,野生型有時縮寫作wt。實(shí)施例3:經(jīng)修飾的酶(i136r)對bcaa的反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備0.5ml的0.2m甘氨酸-kcl-koh緩沖液(ph9.0),0.04ml的25mmnad+溶液(sigma制),與已知濃度的l-亮氨酸或l-異亮氨酸或l-纈氨酸水溶液混合,添加milliq水使總體積為0.96ml。將所述混合物添加到比色皿中。向所述溶液中添加0.04ml0.5mg/ml的酶溶液使總體達(dá)1ml,將所得的溶液顛倒混合。酶反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1分鐘。酶反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1分鐘，測定340nm下的吸光度變化。上述測定的結(jié)果如圖3中所示。當(dāng)bcaa濃度在140-560μm(在140,280,420和560μm四個點(diǎn)測定)時,leu,ile和val的標(biāo)準(zhǔn)曲線與wt的大不相同，這是由于wt對各bcaa的活性是不同的。另一方面leu,ile和val與所述經(jīng)修飾的酶i136r的反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線幾乎相同，這是由于所述經(jīng)修飾的酶對各bcaa的活性幾乎相同。以上結(jié)果揭示出，根據(jù)經(jīng)修飾的酶i136r,在含有混合了leu,ile和val中的任意兩種或其全部的樣品中的bcaa濃度，可視為leu,ile和val中任意一種的濃度。實(shí)施例4:用經(jīng)修飾的酶i136r定量試驗(yàn)樣品中的總bcaa大鼠血漿樣品(sd菌株,雌性,20周齡,charlesriverlaboratoriesjapan,inc.提供)用作實(shí)際樣品,利用leudhwt和leudhi136r測定所述樣品中的總bcaa。通過將用酶法計(jì)算的總bcaa測定值與用氨基酸分析儀l-8900(hitachihightechnologiescorporation制)測定的總bcaa測定值相比較，對所述測定進(jìn)行評估。用酶法對總bcaa進(jìn)行定量通過以下程序進(jìn)行。將0.5ml的0.2m甘氨酸-kcl-koh緩沖液(ph9.0),0.04ml25mmnad+溶液(sigma制),和0.04ml或0.02ml已知濃度的l-纈氨酸水溶液或大鼠血漿相混合,加入milliq水使得總體積為0.96ml。將這一混合物加入比色皿中。向所述溶液中添加,0.04ml的0.5mg/ml酶溶液使得總體積為1ml,將所得的溶液顛倒混合。酶反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1分鐘，測定340nm下的吸光度變化。通過利用l-纈氨酸水溶液制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量血漿樣品中的總bcaa。氨基酸分析儀測定用大鼠血漿樣品，通過磺基水楊酸去蛋白處理。比較分別由酶法和氨基酸分析儀獲得的大鼠血漿中總bcaa濃度的測定值的圖標(biāo)如圖4中所示。結(jié)果，利用酶法獲得實(shí)際樣品中的總bcaa濃度測定值，與由氨基酸分析儀獲得的總bcaa測定值幾乎相同。已知野生型的亮氨酸脫氫酶對支鏈氨基酸以外的氨基酸幾乎沒有催化活性。在含多種氨基酸的血漿樣品中的bcaa可用這一試驗(yàn)進(jìn)行定量。因此,預(yù)計(jì)本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶保有對支鏈氨基酸以外的氨基酸幾乎沒有催化活性，這一野生型的酶的特性。以上證明了本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶可用于特異性地測定實(shí)際樣品中的總bcaa。實(shí)施例5:利用無細(xì)胞系合成經(jīng)修飾的酶以及經(jīng)修飾的酶的純化以野生型基因或目的突變體基因?yàn)槟０?，通過兩步pcr法將組氨酸親和標(biāo)簽和蛋白酶識別位點(diǎn)融合到n末端側(cè)，制備具有導(dǎo)入了目的突變的構(gòu)建體的線性dna。利用上述dna為模板，在來自大腸桿菌的無細(xì)胞合成反應(yīng)系統(tǒng)中合成蛋白質(zhì)。利用1ml反應(yīng)規(guī)模(reactionscale),以透析法合成6小時所得的產(chǎn)物離心后的上清組分用對ni親和性，進(jìn)行純化，收獲洗脫組分。接下來,通過sds-page以及syproorange蛋白質(zhì)凝膠染色(lifetechnologiesjapanltd.)確認(rèn)作為目的酶的蛋白質(zhì)的存在。以bsa作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過bradford法定量所得的洗脫組分中的蛋白質(zhì)濃度,根據(jù)需要調(diào)節(jié)目的蛋白質(zhì)的濃度，以備用于下述的評價。以上述相同的方式對于野生型的酶進(jìn)行,線性dna的制備,無細(xì)胞合成,以及酶的純化和分析。利用野生型的基因用作模板，通過pcr制備的酶如表4中所示。利用導(dǎo)入了目的突變的基因?yàn)槟０?，通過pcr制備的酶如表5和表6中所示。用于純化的樹脂和緩沖液如下。樹脂:nisepharosehighperformance(gehealthcarejapan)緩沖液:結(jié)合緩沖液(nacl750mm,napi20mm,ph8.0),洗滌緩沖液(nacl750mm,napi20mm,ph8.0)收集和測定緩沖液(nacl300mm,napi50mm,edta34mm,ph7.0,10％d2o,0.01％nan3)實(shí)施例6:活性和底物特異性的評價根據(jù)實(shí)施例2中的方法評估了野生型的酶和實(shí)施例5中合成的經(jīng)修飾的酶的活性和相對活性。結(jié)果如表4,5和6中所示。表4和5中，來自3個野生型樣品的結(jié)果的平均值用作野生型的值。表6中的結(jié)果是對相同的樣品進(jìn)行3次試驗(yàn)所計(jì)算出的平均值。對于被導(dǎo)入了多個突變的經(jīng)修飾的酶，每一個被導(dǎo)入的突變用”/”彼此分隔開、以連續(xù)的形式表示。例如,突變體i136r/i292f代表具有兩個突變i136r和i292f的經(jīng)修飾的酶。通過引入所述的突變,與wt相比，所述經(jīng)修飾的酶的活性進(jìn)一步增強(qiáng)和/或?qū)γ糠Nbcaa更加均衡。與引入一種突變的情況相比,引入與wt相比使得對每種bcaa的活性的相對值更均衡的兩種突變，使所述的相對值更加均衡。表4.相對于wt經(jīng)修飾的酶的活性的相對值(左)，以及酶對每種bcaa的活性的相對值(右)(1)。表5.相對于wt經(jīng)修飾的酶的活性的相對值(左)，以及酶對每種bcaa的活性的相對值(右)(2)。表6.相對于wt經(jīng)修飾的酶的活性的相對值(左)，以及酶對每種bcaa的活性的相對值(右)(3)。以96-孔微孔板替代具有1cm光通道長度的比色皿，在下述反應(yīng)溶液中，于30℃下進(jìn)行1分鐘酶反應(yīng)，測定340nm下的吸光度變化。所使用的酶是，如實(shí)施例5所述，以野生型的基因?yàn)槟０逯苽涞木€性dna合成并純化的。所述的反應(yīng)溶液是通過，混合150μl的緩沖液(0.2mhepes,0.28m氯化鈉,8.4mm磷酸氫二鈉,ph7.0或7.5或8.0),30μl25mmnad+水溶液,1.5μl1m氯化鉀水溶液,3μl10mml-亮氨酸或l-異亮氨酸或l-纈氨酸水溶液，以及100.5μl的milliq水，并另外添加15μl的1mg/ml酶溶液，制備的。所得結(jié)果如表7和8中所示。針對i136k和i136r的每個值是由一次試驗(yàn)獲得的，針對其他酶的其他值是對相同樣品的兩次試驗(yàn)計(jì)算所得的平均值。表7顯示，相對于wt，經(jīng)修飾的酶的活性的相對值，表8顯示所述的酶對于每種bcaa的活性的相對值。表7.相對于wt，經(jīng)修飾的酶的活性的相對值表8.酶對每種bcaa的活性的相對值實(shí)施例7:熱穩(wěn)定性的評估實(shí)施例5中合成的leudhwt和下述經(jīng)修飾的酶的5種酶溶液，以60,70和80℃熱處理1小時，隨后進(jìn)行活性測定。經(jīng)過熱處理后的每種酶溶液所保留的活性如表9中所示。經(jīng)60℃或70℃熱處理后的每種經(jīng)修飾酶的保留活性高于wt的保留酶活性。表9.以處理前的活性為100，以所示反應(yīng)溫度進(jìn)行熱處理后的相對活性wti292fi136ki136fi136ri136m60℃74928690919670℃58626774757480℃000001產(chǎn)業(yè)應(yīng)用本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶可用于快速地測定總的支鏈氨基酸的濃度。本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶還可以用于任意支鏈氨基酸的測定和/或用于制備任意支鏈氨基酸的衍生物。本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶還可以用作液體試劑。本發(fā)明的分析方法可用于肝硬化和肝性腦病之類的疾病的診斷。序列表<110>味之素株式會社<120>經(jīng)修飾的亮氨酸脫氫酶<130>pama-25042<150>jp2012-082777<151>2012-03-30<160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>1104<212>dna<213>嗜熱脂肪土芽孢桿菌<400>1atggaattgttcaaatatatggaaacttacgattatgagcaagtgctgttttgccaagat60aaagaatcgggtttgaaagcgatcattgccattcatgacacaacgctcggcccggcgctc120ggcgggacgcgcatgtggatgtacaattcggaagaagaagcgcttgaagacgccttgcgc180ctcgcccgcggcatgacgtacaaaaacgcggccgccggcctcaacttgggcgggggcaaa240acggtcatcatcggcgacccgcgcaaagataaaaacgaagcgatgttccgggcgttcggc300cgcttcattcaagggctgaacggccgctacatcacggcggaagacgtcggcacgaccgtc360gccgatatggatatcatctatcaagaaaccgactatgtcaccggcatttcgcccgaattc420ggctcatccggcaacccatcgccggcgaccgcctacggcgtataccgcggcatgaaggcg480gcggcaaaagaggcgttcggcagcgattcgctcgaaggaaaagtcgtcgccgtccaagga540gtcggcaatgtcgcgtatcatttgtgccgccatttgcacgaagaaggagcgaaactcatc600gtgactgacatcaacaaggaagtggtggcgcgcgcggtcgaggaattcggagcgaaagcg660gtcgacccgaacgacatttacggcgtggagtgcgacatttttgctccatgcgcgctcggc720ggcatcatcaacgatcaaacgattccgcaactgaaagcgaaagtgatcgccggatcggca780gacaaccagctgaaagagccgcgccatggcgacatcatccatgaaatgggcatcgtctat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