本發(fā)明涉及一種金屬β-內(nèi)酰胺酶的三肽抑制劑，尤其涉及該肽在制備抗菌藥物及預(yù)防、治療耐藥菌感染中的用途。

背景技術(shù)：

產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是導(dǎo)致細(xì)菌尤其是革蘭氏陰性菌耐藥的重要機(jī)制之一，它們能水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)，導(dǎo)致抗生素失活。β-內(nèi)酰胺酶可以分為絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBLs)。根據(jù)氨基酸序列的同源性以及對金屬Zn離子的依賴性，MBLs又進(jìn)一步分為B1，B2和B3亞類。目前發(fā)現(xiàn)B1類有18個(gè)同源家族，B2類有3個(gè)同源家族，B3類有9個(gè)同源家族。由于金屬β-內(nèi)酰胺酶能夠水解包括碳青霉稀類抗生素在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素，而且目前沒有有效的抑制劑上市，因此MBLs是目前臨床上抗感染治療的重大挑戰(zhàn)，受到了廣泛關(guān)注。

B1類MBLs中的IMP、VIM以及近幾年流行的NDM型金屬β-內(nèi)酰胺酶臨床檢出率最高。2010年8月《柳葉刀-傳染病》雜志上報(bào)道了在印度、巴基斯坦和英國共分離得到180株含有blaNDM-1質(zhì)粒基因的細(xì)菌，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，它們除了替加環(huán)素和多黏菌素以外，對其他所有抗生素都具有高度耐藥性。不斷進(jìn)化的突變株使得臨床治療更加艱難，因此開發(fā)廣譜MBLs抑制劑成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明以多藥耐藥細(xì)菌所產(chǎn)生的金屬β-內(nèi)酰胺酶為靶標(biāo)，并針對該類酶催化水解抗生素的活性中心設(shè)計(jì)合成了一個(gè)三肽，本發(fā)明的三肽可聯(lián)合抗生素治療多藥耐藥細(xì)菌感染。

本發(fā)明的金屬β-內(nèi)酰胺酶三肽抑制劑為廣譜金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制肽，其特征在于長度為3個(gè)氨基酸，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線性，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明所涉及的金屬β-內(nèi)酰胺酶三肽抑制劑用固相合成法制備，方法簡單，技術(shù)成熟，產(chǎn)物質(zhì)量容易控制，能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

藥效學(xué)試驗(yàn)證明本發(fā)明的三肽對典型的金屬β-內(nèi)酰胺酶，如NDM-1、IMP-1和VIM-2等，具有明顯的抑制作用。

藥效學(xué)試驗(yàn)證明本發(fā)明的三肽與β-內(nèi)酰胺類抗生素具有良好的協(xié)同作用，能明顯抑制耐藥菌生產(chǎn)并且大幅度降低β-內(nèi)酰胺類抗生素的最小抑菌濃度(MIC)。所述的β-內(nèi)酰胺類抗生素優(yōu)選頭孢呋辛鈉。

本發(fā)明的三肽也可以和藥學(xué)上可接受的鹽結(jié)合，同樣具有其藥效。這些鹽包括(但不局限于)與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽。其他鹽包括與如下無機(jī)酸形成的鹽：如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸，以及與有機(jī)酸形成的鹽，而有機(jī)酸則指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和馬來酸。藥學(xué)上可接受的鹽優(yōu)選鈉鹽。

本發(fā)明公開了一種抗菌藥物組合物，其中含有該三肽或其藥學(xué)上可接受的鹽及藥學(xué)上可接受的載體。

上述藥物組合物可以制成注射劑、片劑、注射用無菌粉末、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、膏劑、霜?jiǎng)┑榷喾N劑型。上述各種劑型均可以根據(jù)藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備?？梢酝ㄟ^注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入肌肉、內(nèi)皮、皮下、靜脈、粘膜組織，或是被其他物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入肌體。

一般地，本發(fā)明的三肽使用劑量在0.001～10克/天，也可以根據(jù)疾病的情況偏離這個(gè)劑量范圍。

下面是本發(fā)明的三肽的部分藥效學(xué)試驗(yàn)及結(jié)果：

一、三肽對NDM-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制活性(IC₅₀)的測定：

以頭孢呋辛鈉為報(bào)告底物，在274nm波長下測定NDM-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶水解底物后吸光度的變化。測定緩沖液為50mM HEPES，250mM NaCl，2μM ZnCl₂，pH＝7.25，溫度30℃。

(1)首先將金屬β-內(nèi)酰胺酶(終濃度10μM)于緩沖液中孵育5min，使得Zn²⁺充分占據(jù)活性中心；

(2)加入10μL不同濃度的三肽抑制劑，30℃孵育5min，使抑制劑與酶充分結(jié)合；

(3)將體系轉(zhuǎn)入石英比色皿中，加入8μL頭孢呋辛鈉(終濃度160μM)的同時(shí)立即測定體系吸光度的變化，記錄數(shù)據(jù)。

由于底物頭孢呋辛鈉被酶水解后其吸光度下降，因而通過測定吸光度的變化可以表征底物的水解程度。計(jì)算不同濃度的三肽抑制劑對NDM-1水解底物的抑制率，以三肽抑制劑的濃度對抑制率擬合曲線，計(jì)算得到本發(fā)明的三肽分子對NDM-1型金屬酶的IC₅0值為86.46μM，表明其對NDM-1型金屬酶有較好的抑制作用。

二、三肽抑制劑對IMP-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制活性(IC₅₀)的測定：

以頭孢呋辛鈉為報(bào)告底物，在274nm波長下測定IMP-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶水解底物后吸光度的變化。測定緩沖液為50mM HEPES，250mM NaCl，2μM ZnCl₂，pH＝7.25，溫度30℃。具體操作步驟同實(shí)施例1。計(jì)算不同濃度的三肽抑制劑對IMP-1水解底物的抑制率，以三肽抑制劑的濃度對抑制率擬合曲線，計(jì)算得到三肽分子對IMP-1型金屬酶的IC₅₀值49.6μM，說明此三肽分子對IMP-1型金屬酶有較好的抑制作用。

三、三肽分子與β-內(nèi)酰胺類抗生素協(xié)同抗NDM-1型工程菌活性的測定：

為了能夠安全進(jìn)行協(xié)同抗菌實(shí)驗(yàn)，使用相對安全的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1菌株作為耐藥菌株，將E.coli BL21(DE3)/pET28a菌株作為陰性對照。采用二倍稀釋法測定最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)，通過MIC值的變化反映抑制肽與抗生素的協(xié)同抗菌作用。

具體方法如下：

將超低溫冰箱中保存的工程菌菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1以及對照菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a分別接種于滅菌的Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12小時(shí)。用接種環(huán)挑取單菌落分別轉(zhuǎn)接到滅菌的液體LB培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm條件下震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。用紫外分光光度計(jì)測定600nm波長處菌液的吸光度值(OD₆₀₀)，根據(jù)1OD＝1×10⁹CFU/mL的換算關(guān)系，分別將表達(dá)金屬β-內(nèi)酰胺酶的工程菌菌株以及對照菌株稀釋至終濃度1×10⁶CFU/mL。

對照組(1)：E.coli BL21(DE3)/pET28a菌。在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的終濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液，混合均勻。

對照組(2)：表達(dá)金屬β-內(nèi)酰胺酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1。在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的終濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液，混合均勻。

對照組(3)：表達(dá)金屬β-內(nèi)酰胺酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1。在無菌96孔板中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液和終濃度為200μM的三肽抑制劑，混合均勻。

實(shí)驗(yàn)組均使用能表達(dá)金屬β-內(nèi)酰胺酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1。

實(shí)驗(yàn)組(1)：在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液和終濃度為200μM的三肽抑制劑，混合均勻。

實(shí)驗(yàn)組(2)：在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液和終濃度為100μM的三肽抑制劑，混合均勻。

實(shí)驗(yàn)組(3)：在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液和終濃度為50μM的三肽抑制劑，混合均勻。

實(shí)驗(yàn)組(4)：在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液和終濃度為25μM的三肽抑制劑，混合均勻。

實(shí)驗(yàn)組(5)：在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液和終濃度為12.5μM的三肽抑制劑，混合均勻。

實(shí)驗(yàn)組(6)：在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液和終濃度為6.25μM的三肽抑制劑，混合均勻。

以上各組于37℃緩慢震蕩培養(yǎng)16小時(shí)，測定波長為600nm處的吸光度值。檢測不到細(xì)菌生長的孔中頭孢呋辛鈉的終濃度為最小抑菌濃度(MIC)，三肽分子Phe-Cys-Pro對含有NDM-1的耐藥菌株聯(lián)合抑菌效果如表1所示。

表1三肽Phe-Cys-Pro與頭孢呋辛鈉協(xié)同抗NDM-1工程菌的測定結(jié)果

^a-：三肽Phe-Cys-Pro本身無抗菌活性。

由表1結(jié)果可知，對照組(1)中頭孢呋辛鈉對敏感菌株E.coli BL21(DE3)具有良好的抑制作用(MIC＜2μg/mL)；對照組(2)為耐藥菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1，頭孢呋辛鈉幾乎不能抑制該菌株的生長(MIC＝256μg/mL)，同時(shí)也證明了該菌株為耐藥菌；對照組(3)中含有終濃度為200μM的Phe-Cys-Pro而不含抗生素，培養(yǎng)16小時(shí)后菌液十分渾濁，證明該三肽抑制劑本身無抗菌作用。

從實(shí)驗(yàn)組(1)～(6)的MIC可以看出，當(dāng)Phe-Cys-Pro與抗生素頭孢呋辛鈉聯(lián)合使用時(shí)，通過協(xié)同作用能明顯提高頭孢呋辛鈉的抗菌活性，當(dāng)三肽抑制劑濃度為200μM時(shí)，頭孢呋辛鈉的抗菌活性(MIC值)提高了16倍(256/16)；當(dāng)三肽抑制劑濃度為25μM時(shí)，頭孢呋辛鈉的抗菌活性(MIC值)提高了2倍(256/128)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

Phe-Cys-Pro的制備

1.稱取2.0g MBHA(4-甲苯氫胺)樹脂于潔凈干燥的反應(yīng)管中，加入適量DMF(二甲基甲酰胺)，活化30min左右，然后稱取Fmoc(芴甲氧羰?；?保護(hù)的Phe 1mmol，DMAP(4二甲氨基吡啶)150mg，加98％的DIC(N，N’-二異丙基碳二亞胺)1ml到反應(yīng)管中，DMF做溶劑反應(yīng)3h。反應(yīng)完畢用DMF洗4～6次，加入適量吡啶和乙酸酐，體積比為1∶1，反應(yīng)30min。反應(yīng)完畢用DMF洗4～6次。然后用20％的哌啶溶液脫掉氨基酸的Fmoc，脫兩次共15min，10min+5min。再用DMF洗4次，甲醇洗2次，取出少量樹脂用茚三酮檢測試劑檢測，檢測為藍(lán)色，即可進(jìn)行下一步反應(yīng)。

2.稱取Fmoc保護(hù)的Cys 3mmol，HBTU(苯并三氮唑N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)3mmol于反應(yīng)管中，加入DIEA(N，N-二異丙基乙胺)0.5mL，反應(yīng)40min，用DMF洗4～6次，取少量樹脂用茚三酮檢測試劑檢測，顯無色，然后加入20％的哌啶溶液脫Fmoc，10min+5min，然后用DMF洗4次，甲醇洗兩次，取出少量樹脂用茚三酮檢測試劑檢測，檢測為藍(lán)色，即可進(jìn)行下一步反應(yīng)。

3.稱取Fmoc保護(hù)的C端氨基酸Pro 3mmol，HBTU 3mmol于反應(yīng)管中，加入DIEA 0.5mL，反應(yīng)40min，用DMF洗4～6次，取少量樹脂用茚三酮檢測試劑檢測，顯無色，然后加入20％的哌啶溶液脫Fmoc，10min+5min，然后用DMF洗4次，甲醇洗兩次，取出少量樹脂用茚三酮檢測試劑檢測，檢測為藍(lán)色。

4.最后用三氟乙酸切割液切割2h，反應(yīng)液抽濾，得多肽的三氟乙酸溶液，用乙醚沉淀，離心，然后再用乙醚洗3～5次，得白色固體，經(jīng)C18反相制備柱脫鹽，凍干，取少量進(jìn)行MS分析。HPLC測定三肽的純度為95.56％，MS鑒定其分子量為365.10，與理論分子量365.45基本一致。

實(shí)施例2

含Phe-Cys-Pro抑制肽的抗菌藥物組合物的制備(膠囊)

按照100個(gè)膠囊的用量，稱取以上各輔料分別研細(xì)過篩后混合均勻，然后用等量遞加法加入頭孢呋辛鈉和Phe-Cys-Pro，充分研磨，使其分散均勻，再過80目篩，然后灌制成膠囊。