本發(fā)明涉及一種半抗原，具體的說是一種戊唑醇新型半抗原及其合成方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

戊唑醇，英文名為Tebuconazole，是一種羥乙基三唑衍生物，屬低毒、高效、廣譜的三唑類內(nèi)吸殺菌劑，是甾醇脫甲基化抑制劑，通過破壞和阻止病菌的細(xì)胞膜中麥角甾醇的生物合成，使病原菌因不能形成細(xì)胞膜而致死，能有效防治禾谷類作物的銹病和白粉??；蘋果和香蕉的葉斑病、輪紋病和黑星病等病害。然而，長期大量地將戊唑醇用于田間病害防治時(shí)，由于其持效期長，造成了嚴(yán)重的“3R”（抗性Resistance、再增猖獗Resurgence和殘留Residue）問題；另外，研究還發(fā)現(xiàn)戊唑醇對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育具有一定的致死和致畸效應(yīng)，對(duì)老鼠具有毒性蓄積和遺傳效應(yīng)，美國環(huán)境保護(hù)署（Enviroment Protection Agency, EPA）把戊唑醇列為“人類可能致癌物質(zhì)”，因此，亟需建立快速、高靈敏地檢測戊唑醇?xì)⒕鷦┑姆椒ā?/p>

目前，檢測戊唑醇?xì)埩舻姆椒ㄖ饕懈咝б合嗌V法、氣相色譜法和氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法。雖然儀器分析方法靈敏、準(zhǔn)確和重現(xiàn)性好，但樣品的預(yù)處理步驟繁瑣，儀器設(shè)備昂貴，需要專業(yè)人員操作，檢測費(fèi)用高，需要消耗大量有毒的有機(jī)溶劑，尤其不適合大量樣品的快速篩選。近年來，研究者還采用熒光光譜法和分子印跡電化學(xué)傳感器對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中戊唑醇?xì)埩暨M(jìn)行檢測，具有快速靈敏的優(yōu)點(diǎn)，但這兩種方法的檢測成本較高，穩(wěn)定性差。而酶聯(lián)免疫分析法具有高通量、檢測成本低和快速簡便的優(yōu)點(diǎn)，正好可以彌補(bǔ)上述方法的不足。到目前為止，國內(nèi)尚沒有關(guān)于戊唑醇?xì)埩魴z測的酶聯(lián)免疫分析法報(bào)道。而建立戊唑醇酶聯(lián)免疫分析方法的關(guān)鍵在于其半抗原的設(shè)計(jì)和合成。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是為解決上述技術(shù)問題的不足，提供一種戊唑醇新型半抗原及其合成方法和應(yīng)用，該合成方法簡單，采用所合成的戊唑醇新型半抗原制備戊唑醇抗體，所得抗體靈敏度高，半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）為1.46±0.32 ng/mL；特異性強(qiáng)，與其類似物的交叉反應(yīng)率均低于10%，

一種戊唑醇新型半抗原，其結(jié)構(gòu)式為：。

所述戊唑醇新型半抗原，通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和核磁共振的氫譜和碳譜進(jìn)行表征，結(jié)果為:

所述戊唑醇新型半抗原以戊唑醇為原料，經(jīng)過2步化學(xué)反應(yīng)獲得，其合成路線如下：

其中DCM代表二氯甲烷；Et₃N代表三乙胺；LiOH-H₂O代表一水氫氧化鋰；MeOH代表甲醇；THF代表四氫呋喃。

所述戊唑醇新型半抗原的合成方法，包括以下步驟：

（1）中間產(chǎn)物的合成

先將戊唑醇 (184 mg, 0.6 mmol) 溶于無水二氯甲烷 (CH₂Cl₂，15 mL) 中，溶解后，再加入三乙胺（C₆H₁₅N，730 mg, 7.2 mmol），冰浴下攪拌5分鐘后，再加入琥珀酸單乙酯單酰氯（C₆H₉ClO₃，988 mg, 6 mmol），室溫下攪拌過夜，然后依次用水、飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥二氯甲烷過濾，減壓蒸發(fā)濃縮至干，得中間產(chǎn)物約400 mg，直接用于下一步水解。該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)得到證實(shí)。

所述飽和鹽水為飽和NaCl水溶液。所述依次用水、飽和鹽水洗滌，即采用15 mL水洗滌3次，再采用飽和鹽水洗滌3次。

（2）戊唑醇新型半抗原的合成

將粗品 400 mg（約0.6 mmol）溶于無水甲醇-四氫呋喃 (9 mL-9 mL) 混合液中，加入一水合氫氧化鋰的水溶液 (LiOH·H₂O，252 mg, 6 mmol, 3 mL H₂O)，室溫?cái)嚢柽^夜，除去有機(jī)溶劑，冰浴下，采用1 mol/L鹽酸將溶液的pH調(diào)到2.0-3.0，采用反相柱純化，流動(dòng)相為體積濃度為40%乙腈水溶液，濃縮凍干，回收得到無色油狀固體( 70mg )，得率29%。

所述戊唑醇新型半抗原在制備免疫原中的應(yīng)用，包括以下步驟：

（1）稱取戊唑醇半抗原（4.1 mg，0.01 mmoL）加到N-N-二甲基甲酰胺（DMF，1 mL）中，攪拌溶解后，加入的1-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，4.5 mg）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，4.4 mg），室溫反應(yīng)6小時(shí)，得到A液；

（2）取血藍(lán)蛋白（KLH，20.92 mg/mL，0.3 mL）加到的硼酸鹽緩沖溶液中（0.2 mol/L，3.5 mL，pH 8.8），攪拌混勻，得到B液；在冰浴下，將A液逐滴加到B液中，在4℃下攪拌反應(yīng)8-10小時(shí)；

（3）采用磷酸鹽緩沖溶液（0.01mol/L, pH 7.2）對(duì)反應(yīng)液透析3天，每6小時(shí)更換一次透析液，更換8次；所得的戊唑醇免疫原分裝，凍存和備用。

所述戊唑醇新型半抗原可應(yīng)用于制備抗戊唑醇多克隆抗體。

所述戊唑醇新型半抗原可應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中戊唑醇?xì)埩魴z測的免疫分析。

所述戊唑醇新型半抗原可應(yīng)用于制備抗戊唑醇多克隆抗體。

所述戊唑醇新型半抗原可應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中戊唑醇?xì)埩魴z測的免疫分析。

有益效果是：

本發(fā)明方法戊唑醇新型半抗原合成方法簡單，合成了戊唑醇?xì)⒕鷦┑男滦桶肟乖?，采用該半抗原制備戊唑醇抗體，所得抗體靈敏度高，半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）為1.46±0.32 ng/mL；特異性強(qiáng)，與其類似物的交叉反應(yīng)率均低于10%，可用于建立戊唑醇?xì)埩魴z測的酶聯(lián)免疫分析法，為建立農(nóng)產(chǎn)品中戊唑醇?xì)埩魴z測的免疫分析方法提供原料。

附圖說明

圖1 是中間產(chǎn)物的液相色譜圖；

圖2是中間產(chǎn)物的質(zhì)譜圖；

圖3 戊唑醇半抗原的液相色譜圖；

圖4戊唑醇半抗原的質(zhì)譜圖；

圖5 戊唑醇半抗原的核磁氫譜圖；

圖6 戊唑醇半抗原的核磁碳譜圖；

圖7 不同濃度戊唑醇半抗原的紫外掃描圖；

圖8 戊唑醇免疫原的紫外表征圖；

圖9 戊唑醇包被原的紫外表征圖；

圖10測定戊唑醇的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線圖。

具體實(shí)施方式

一種戊唑醇新型半抗原的合成方法，以戊唑醇為原料，經(jīng)過2步化學(xué)反應(yīng)，獲得戊唑醇的新型半抗原。其合成路線如下：

說明：DCM代表二氯甲烷；Et₃N代表三乙胺；LiOH-H₂O代表一水氫氧化鋰；MeOH代表甲醇；THF代表四氫呋喃。

其合成步驟為：

（1）半抗原的合成

①、粗品的合成

先將戊唑醇 (184 mg, 0.6 mmol) 溶于無水二氯甲烷 (CH₂Cl₂，15 mL) 中，溶解后，再加入三乙胺（C₆H₁₅N，730 mg, 7.2 mmol），冰浴下攪拌5分鐘后，再加入琥珀酸單乙酯單酰氯（C₆H₉ClO₃, 988 mg, 6 mmol），室溫下攪拌過夜，然后依次用水、飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥二氯甲烷過濾，減壓蒸發(fā)濃縮至干，得中間產(chǎn)物（約400 mg），直接用于下一步水解。該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)得到證實(shí)。結(jié)果見圖1和圖2所示， LCMS (ESI) m/z = 564.8/566.8 ([M+H]⁺)。

所述飽和鹽水為飽和NaCl水溶液。所述依次用水、飽和鹽水洗滌，即采用15 mL水洗滌3次，再采用飽和鹽水洗滌3次。

②戊唑醇新型半抗原的合成

粗品 (400 mg, 約0.6 mmol) 溶于無水甲醇-四氫呋喃 (9 mL-9 mL) 混合液中，加入一水合氫氧化鋰的水溶液 (LiOH·H₂O，252 mg, 6 mmol, 3 mL H₂O)，室溫?cái)嚢柽^夜，除去有機(jī)溶劑，冰浴下，采用1 mol/L鹽酸將溶液的pH調(diào)到2.0-3.0，采用反相柱純化，流動(dòng)相為體積濃度為40%的乙腈水溶液，濃縮凍干，回收得到無色油狀固體( 70mg )，得率29%。

該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和核磁共振的氫譜和碳譜進(jìn)行表征。結(jié)果見圖3-圖6所示:

（2）免疫原的制備

稱取戊唑醇半抗原（4.1 mg, 0.01 mmoL）加到N-N-二甲基甲酰胺（DMF，1 mL）中，攪拌溶解后，加入的1-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，4.5 mg）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，4.4 mg），室溫反應(yīng)6小時(shí)，得到A液。

取血藍(lán)蛋白（KLH，20.92 mg/mL，0.3 mL）加到的硼酸鹽緩沖溶液中（0.2 mol/L，3.5 mL，pH 8.8），攪拌混勻，得到B液。在冰浴下，將A液逐滴加到B液中，在4℃下攪拌反應(yīng)8-10小時(shí)。

采用磷酸鹽緩沖溶液（0.01mol/L, pH 7.2）對(duì)反應(yīng)液透析3天，每6小時(shí)更換一次透析液，更換8次。所得的戊唑醇免疫原分裝，凍存和備用。

（3）包被原的制備

稱取戊唑醇半抗原（4.1 mg，0.01 mmol）溶于N-N-二甲基甲酰胺（DMF，1 mL），再加入三丁胺（8μL）和氯甲酸異丁酯（5 μL），室溫反應(yīng)30分鐘，得到A液。

稱量牛血清白蛋白（20 mg）或雞卵清蛋白（15 mg）加到硼酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，5.0 mL，pH 8.8），攪拌混勻，得到B液。然后在攪拌狀態(tài)下將A液逐滴加入到B液中，4℃下反應(yīng)6小時(shí)。

采用磷酸鹽緩沖溶液（0.01mol/L, pH 7.2）對(duì)反應(yīng)液透析3天，每6小時(shí)更換一次透析液，更換8次。所得的戊唑醇包被原分裝，凍存和備用。

（2）人工抗原的鑒定

戊唑醇半抗原最大吸收波長的確定：先配制1 mg/mL的戊唑醇半抗原甲醇溶液，經(jīng)過稀釋，配制一系列的戊唑醇半抗原濃度（0，25，50，75μg/mL），掃描波長200-500 nm的紫外線。紫外測定結(jié)果見圖7，由結(jié)果可知，戊唑醇半抗原的最大吸收波長為247 nm，每個(gè)濃度做3個(gè)平行樣。

摩爾吸光系數(shù)(ε)的計(jì)算：摩爾吸光系數(shù)的計(jì)算公式ε=最大吸收波長下吸光值/摩爾濃度。本實(shí)驗(yàn)計(jì)算得戊唑醇抗原ε=4029.3 L/moL。

偶聯(lián)物蛋白濃度的測定：因?yàn)樗玫目乖芤簽樽攸S色的澄清溶液，故蛋白濃度的計(jì)算公式:

C=M/V

M為載體蛋白的質(zhì)量，g；V為抗原透析后的體積，mL；C為抗原的蛋白濃度。因此，在抗原透析后，直接測定透析后抗原的總體積。通過計(jì)算可得，抗原的蛋白濃度為3.72mg?mL^-1。

偶聯(lián)比的測定：配制0.2 mg/mL載體蛋白的水溶液，抗原采用水溶液稀釋到0.2 mg/mL，分別測定在278 nm處的吸光值，測出的吸光值為A1，A2，則偶聯(lián)比率r為：

r=((A2-A1)／ε)／(200×10^-3／載體蛋白的分子質(zhì)量)

其中ε為摩爾吸光系數(shù)（L/moL），本實(shí)驗(yàn)計(jì)算得：r≈15。由此得出，半抗原與載體蛋白的比例為15：1。

實(shí)施例1戊唑醇半抗原的合成與鑒定

步驟一、中間產(chǎn)物的合成

首先將戊唑醇 (184 mg, 0.6 mmol) 溶于無水二氯甲烷 (CH₂Cl₂，15 mL) 中，再加入三乙胺（C₆H₁₅N, 730 mg, 7.2 mmol），冰浴攪拌5分鐘后，加入琥珀酸單乙酯單酰氯（C₆H₉ClO₃, 988 mg, 6 mmol），室溫下攪拌過夜，依次以水、飽和鹽水洗滌（分別為15 mL×3），用無水硫酸鈉干燥二氯甲烷后，過濾，減壓蒸發(fā)濃縮至干，得到中間產(chǎn)物（約400mg），直接用于下一步水解。該產(chǎn)物結(jié)構(gòu)通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行表征。

步驟二、戊唑醇半抗原的合成

中間產(chǎn)物 (400 mg, 0.6 mmol) 溶于無水甲醇-四氫呋喃 (9 mL：9 mL) 混合液中，加入一水合氫氧化鋰的水溶液 (LiOH·H₂O，252 mg, 6 mmol, 3 mL水)，室溫?cái)嚢柽^夜，除去有機(jī)溶劑。冰浴下，采用1 mol/L鹽酸將溶液的pH調(diào)到2.0-3.0，采用反相柱純化，流動(dòng)相為體積濃度為40%乙腈水溶液，濃縮凍干，回收得到無色油狀固體(約70mg )，得率29%。該產(chǎn)物結(jié)構(gòu)采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和核磁共振的氫譜和碳譜進(jìn)行分析。戊唑醇半抗原的結(jié)構(gòu)如下，

實(shí)施例2戊唑醇抗原的制備與鑒定

1、將戊唑醇半抗原采用活性酯法（EDC法）和血藍(lán)蛋白（KLH）偶聯(lián)，用作免疫原，具體反應(yīng)路線如下：

將戊唑醇半抗原采用混合酸酐法和雞卵清蛋白（OVA）或牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)，用作包被原，具體反應(yīng)路線如下：

說明：其中Protein是蛋白質(zhì)。

2、人工抗原的純化

采用透析法對(duì)人工抗原進(jìn)行脫鹽純化。

3、人工抗原的鑒定

偶聯(lián)物蛋白濃度的測定：本方法所制備的抗原為棕黃色的澄清溶液，蛋白濃度的計(jì)算公式為：

C=M/V

M為載體蛋白的質(zhì)量，g；V為抗原透析后的體積，mL；C為抗原的蛋白濃度。因此，在抗原透析后，直接測定透析后抗原的總體積。通過計(jì)算可得，抗原的蛋白濃度為3.72 mg/mL。

偶聯(lián)比測定：配制0.2 mg/mL載體蛋白的水溶液，抗原采用蒸餾水稀釋到0.2 mg/mL，分別測定在278 nm處測吸光值，測出的吸光值為A1，A2。偶聯(lián)比率r的計(jì)算公式為：

；其中ε為摩爾吸光系數(shù)（L/moL），本實(shí)驗(yàn)計(jì)算得出：r≈15，因此，根據(jù)上述公式估算戊唑醇免疫原的偶聯(lián)比15：1。

多克隆抗體的效價(jià)為1:16000，半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）為1.46±0.32 ng/mL，與其類似物的的交叉反應(yīng)率低于10%；按照如下步驟產(chǎn)生：

步驟一 抗戊唑醇多克隆抗體的制備

1、動(dòng)物免疫：選擇體重為2.0 kg左右的新西蘭大白兔為試驗(yàn)動(dòng)物，每2只為一組，共3組。免疫原為戊唑醇半抗原和血藍(lán)蛋白通過活性酯法制備的偶聯(lián)物。初免采用氟氏完全佐劑乳化，免疫原乳化后，采用背部多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行免疫，初免劑量為1 mg/kg體重（以蛋白含量計(jì)），四周后進(jìn)行加強(qiáng)免。加強(qiáng)免采用不完全佐劑進(jìn)行乳化，免疫劑量0.65 mg/kg體重，每隔3周加強(qiáng)免一次。

2、抗血清的篩選：第四次免疫后7-10天，通過耳廓外緣靜脈采血，采血后，室溫下靜置30分鐘, 離心（5000 rpm，10 min），吸出上清液，獲得抗血清。采用間接競爭酶聯(lián)免疫法測定抗血清的效價(jià)和抑制，選出效價(jià)高且抑制好的血清，通過心臟采血的方式對(duì)選出的兔子采血，收集于50 mL滅菌塑料離心管中，按照上述方法制備抗血清。

3、抗體的純化

采用硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化。

步驟二、戊唑醇抗體特性的測定

1、抗體效價(jià)的測定

采用間接競爭酶聯(lián)免疫法（ic-ELISA）測定戊唑醇抗體的效價(jià)，得出抗體的效價(jià)為1:16000。采用戊唑醇半抗原-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物包被酶標(biāo)板；封閉后，加入倍比稀釋的一抗血清，37℃下反應(yīng)30 分鐘；洗滌拍干后，加入酶標(biāo)二抗，37℃下反應(yīng)30 分鐘；洗滌拍干后，37℃下顯色15 分鐘，終止。采用酶標(biāo)儀測定450 nm下的吸光值。

2、靈敏度的測定

采用間接競爭酶聯(lián)免疫法（ic-ELISA）測定抗體對(duì)戊唑醇農(nóng)藥的抑制效果。選擇包被原濃度為0.3μg/mL，抗體的蛋白濃度為0.04μg/mL，測定結(jié)果用origin 8.5軟件進(jìn)行四參數(shù)回歸擬合，結(jié)果見圖10。根據(jù)擬合的回歸方程，計(jì)算戊唑醇抗體的半數(shù)抑制濃度，即IC₅₀為1.46±0.32 ng/mL；標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍在0-40 ng/mL之間。

3、特異性的測定

采用間接競爭酶聯(lián)免疫法測定戊唑醇抗體對(duì)其類似物（三唑醇、三唑酮、烯唑醇、腈菌唑和聯(lián)苯三唑醇）的抑制作用。根據(jù)圖10的四參數(shù)回歸方程計(jì)算戊唑醇類似物的半數(shù)抑制濃度，再利用下式計(jì)算戊唑醇類似物的交叉反應(yīng)率。

交叉反應(yīng)率（CR，%）= IC₅₀（戊唑醇）/ IC₅₀（戊唑醇類似物）。戊唑醇抗體的交叉反應(yīng)的結(jié)果見表1。

表1：