本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及新型熒光探針的合成及其對(duì)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤的檢測(cè)。

背景技術(shù)：

6-硫代鳥(niǎo)嘌呤(6-TG)是鳥(niǎo)嘌呤的類(lèi)似物，在20世紀(jì)50年代初被引入臨床和患者的研究。在過(guò)去的二十年里，6-硫代鳥(niǎo)嘌呤一直被用來(lái)作為白血病治療的常用藥物。近年來(lái)，它被應(yīng)用于治療乳腺癌。但是6-硫代鳥(niǎo)嘌呤對(duì)人體也有一定的危害，它可以抑制鳥(niǎo)嘌呤核苷的合成。6-硫代鳥(niǎo)嘌呤可以整合到CpG位點(diǎn)，并影響DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1和HpaI介導(dǎo)的胞嘧啶甲基化反應(yīng)。在從急性淋巴細(xì)胞白血病中分離的Jurkat T細(xì)胞中，6-硫代鳥(niǎo)嘌呤顯著降低整體胞嘧啶甲基化水平。而且，6-硫代鳥(niǎo)嘌呤很容易插入到線粒體DNA(mtDNA)中，并引起細(xì)胞中線粒體機(jī)能失調(diào)。除了插入DNA中，6-硫代鳥(niǎo)嘌呤還可以通過(guò)活性氧途徑(ROS)殺死細(xì)胞。ROS作用于DNA，產(chǎn)生強(qiáng)效的強(qiáng)有力地破壞性的復(fù)制逮捕DNA病變包括鏈間交聯(lián)。因此對(duì)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤的檢測(cè)是至關(guān)重要的。熒光技術(shù)因其具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，成本低，選擇性好等眾多優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于生化分析，環(huán)境監(jiān)測(cè)，食品分析和臨床檢驗(yàn)等方面，滲透到化學(xué)，生物，物理，環(huán)境和醫(yī)藥等多學(xué)科研究領(lǐng)域之中。因此，利用熒光技術(shù)開(kāi)發(fā)具有實(shí)用價(jià)值的化學(xué)生物探針已成為當(dāng)前倍受關(guān)注的研究課題。其中，熒光探針，日益成為現(xiàn)代生命科學(xué)和疾病診斷等領(lǐng)域不可或缺的分子工具。新型熒光探針的設(shè)計(jì)合成及其應(yīng)用為目前跨學(xué)科的前沿交叉研究熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)合成一種可用于有效檢測(cè)尿液當(dāng)中的6-硫代鳥(niǎo)嘌呤的新型熒光探針Eu^III-dtpa-bis(cytosine)。本發(fā)明所涉及化合物屬于新型熒光探針，將其應(yīng)用于檢測(cè)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤操作簡(jiǎn)單，成本低，無(wú)污染，且選擇性好。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種新型熒光探針，所述的新型熒光探針是Eu^III-dtpa-bis(cytosine)。

上述的新型熒光探針的制備方法，方法如下：

1)取二乙三胺五乙酸(dtpa)、乙酸酐和吡啶，混合均勻，在60-70℃下，攪拌加熱22-25h，冷卻至室溫，過(guò)濾，無(wú)水乙醚洗滌，抽濾，干燥，得二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)；

2)取二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)、三乙胺、無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)和胞嘧啶(cytosine)，混合均勻，于95-105℃下，攪拌加熱22-25h，靜置，冷卻到室溫，過(guò)濾，真空干燥，得二乙三胺五乙酸-雙(胞嘧啶)(dtpa-bis(cytosine))；

3)將二乙三胺五乙酸-雙(胞嘧啶)用pH＝7.4的Tris-HCl緩沖溶液溶解，得dtpa-bis(cytosine)溶液，用dtpa-bis(cytosine)溶液洗滌Eu(NO₃)₃·6H₂O，收集洗滌液，洗滌液于70-80℃下加熱20-30min或于室溫下放置1-2天，得Eu^III-dtpa-bis(cytosine)。

優(yōu)選的，上述的新型熒光探針的制備方法，按摩爾比，二乙三胺五乙酸:乙酸酐:吡啶＝1:4:6。

優(yōu)選的，上述的新型熒光探針的制備方法，按摩爾比，二乙三胺五乙酸二酐:三乙胺:胞嘧啶＝1:3:3。

優(yōu)選的，上述的新型熒光探針的制備方法，按質(zhì)量比，二乙三胺五乙酸-雙(胞嘧啶):Eu(NO₃)₃·6H₂O＝40:1。

本發(fā)明的新型熒光探針可在檢測(cè)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤中應(yīng)用。方法如下：將6-硫代鳥(niǎo)嘌呤用pH＝7.4的Tris-HCl緩沖溶液溶解。加入由Tris-HCl緩沖溶液配置的pH＝7.4的新型熒光探針Eu^III-dtpa-bis(cytosine)，在288nm的激發(fā)波長(zhǎng)下觀察熒光光譜的變化。

本發(fā)明的有益效果是：

1.本發(fā)明，對(duì)dtpa進(jìn)行了修飾，在dtpa兩端接上胞嘧啶，由于結(jié)構(gòu)的相似性，通過(guò)氫鍵和π-π堆積以及配位鍵的作用抓取目標(biāo)物，從而達(dá)到檢測(cè)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤的目的。

2.本發(fā)明針對(duì)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一種新型的熒光探針。通過(guò)本發(fā)明的方法，該探針可以對(duì)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤進(jìn)行特異性檢測(cè)。與其它檢測(cè)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤的熒光探針相比，具有簡(jiǎn)單，快速，成本低等特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是熒光探針Eu^III-dtpa-bis(cytosine)的合成反應(yīng)的流程圖。

圖2a是dtpa-bis(cytosine)(DC-dtpa)的傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)圖。

圖2b是胞嘧啶的傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)圖。

圖2c是dtpa的傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)圖。

圖3是Eu³⁺，dtpa-bis(cytosine)(dtpa-DC)，Eu^III-dtpa-bis(cytosine)的紫外吸收光譜圖。

圖4a是熒光探針加入不同物質(zhì)熒光光譜對(duì)比圖。

圖4b是熒光探針對(duì)不同物質(zhì)熒光光譜對(duì)比圖(575nm)。

圖4c是熒光探針對(duì)不同物質(zhì)熒光光譜對(duì)比圖(525nm)。

圖5是熒光探針與6-硫代鳥(niǎo)嘌呤相互作用機(jī)理圖。

圖6a是熒光探針對(duì)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤分別與不同物質(zhì)混合的干擾熒光光譜對(duì)比圖。

圖6b是熒光探針對(duì)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤分別與不同物質(zhì)混合的干擾熒光光譜對(duì)比圖(575nm)。

圖6c是熒光探針對(duì)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤分別與不同物質(zhì)混合的干擾熒光光譜對(duì)比圖(525nm)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1新型熒光探針Eu^III-dtpa-bis(cytosine)

(一)制備方法

1、二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)的制備

稱取dtpa 7.8100g(0.02mmol)，乙酸酐16.0mL(0.08mmol)，吡啶10.0mL(0.12mmol)置于三頸圓底燒瓶中，在65℃下緩慢攪拌加熱24h。冷卻至室溫，將反應(yīng)混合物過(guò)濾，并用少量無(wú)水乙醚洗滌兩次，用真空泵抽濾，所得物于真空干燥箱中80℃真空干燥，即得dtpaa。

2、二乙三胺五乙酸雙胞嘧啶(dtpa-bis(cytosine))的制備

取1.9610g的dtpaa(55mmol)、8.0mL(165mmol)的三乙胺、50mL的無(wú)水DMF和1.83g(165mmol)的胞嘧啶(cytosine)，于三頸圓底燒瓶。恒溫100℃加熱，快速攪拌24h。反應(yīng)完全后靜置，冷卻到室溫后，得白色固體物質(zhì)，過(guò)濾，50℃真空干燥，即得dtpa-bis(cytosine)。

3、熒光探針Eu^III-dtpa-bis(cytosine)的制備

稱取0.0724g的dtpa-bis(cytosine)于200.0mL的pH＝7.4的Tris-HCl緩沖溶液中溶解，得dtpa-bis(cytosine)溶液。稱取0.0018g的Eu(NO₃)₃·6H₂O置于燒杯中。然后用上面配制的dtpa-bis(cytosine)溶液洗滌三次，洗滌液依次移入250mL容量瓶中，定容。把容量瓶中的溶液于70-80℃下加熱20-30min，形成Eu^III-dtpa-bis(cytosine)，此時(shí)濃度為5.0×10^-4mol/L，作為儲(chǔ)備液，備用。合成過(guò)程如圖1所示。

(二)檢測(cè)

1.胞嘧啶，dtpa，dtpa-bis(cytosine)的FT-IR圖如圖2a、圖2b和2c所示。通過(guò)FT-IR對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在圖2a中的dtpa-bis(cytosine)，不僅出現(xiàn)了胞嘧啶的特征衍射峰還出現(xiàn)了dtpa的特征衍射峰，即dtpa-bis(cytosine)中不僅存在dtpa還同時(shí)存在胞嘧啶?？梢园l(fā)現(xiàn)，圖2a中dtpa-bis(cytosine)的v(C-N)出現(xiàn)在906cm^-1處，與圖2b中胞嘧啶的982cm^-1相比有一個(gè)76cm^-1的紅移。圖2a中dtpa-bis(cytosine)的v_s(COO)出現(xiàn)在1372cm^-1，與圖2c中dtpa的1399cm^-1相比有27cm^-1的紅移。此外，dtpa-bis(cytosine)的v_as(COO)出現(xiàn)在1726cm^-1處，而dtpa的v_as(COO)出現(xiàn)在1734cm^-1，有一個(gè)8cm^-1的紅移。dtpa-bis(cytosine)的v_as(CONH)出現(xiàn)在1648cm^-1和羥基特征的吸收峰出現(xiàn)在3378cm^-1。這些變化證實(shí)，合成了dtpa-bis(cytosine)。

2.稀土Eu³⁺，dtpa-bis(cytosine)(dtpa-DC)，Eu^III-dtpa-bis(cytosine)(Eu³⁺-dtpa-DC)紫外吸收光譜圖如圖3所示。由紫外吸收光譜可以看出，Eu³⁺的溶液有一個(gè)最大吸收峰在220nm波長(zhǎng)處，dtpa-bis(cytosine)溶液在205nm處顯示很弱的吸收峰。形成Eu^III-dtpa-bis(cytosine)后也有最大吸收峰在220nm處，但與Eu³⁺的溶液相比明顯變強(qiáng)。此外，Eu^III-dtpa-bis(cytosine)有一個(gè)新的吸收峰出現(xiàn)在288nm。這表明dtpa-bis(cytosine)可以形成新的配位場(chǎng)使Eu³⁺電子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。這表明Eu^III-dtpa-bis(cytosine)具有作為熒光探針檢測(cè)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤的潛在能力。

實(shí)施例2熒光探針Eu^III-dtpa-bis(cytosine)在檢測(cè)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤中的應(yīng)用

1.熒光探針對(duì)不同物質(zhì)的熒光光譜

實(shí)驗(yàn)條件：取6-硫代鳥(niǎo)嘌呤，鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤，尿酸，黃嘌呤，次黃嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，胸腺嘧啶用pH＝7.4的Tris-HCl緩沖液分別配制成濃度為5.0×10^-4mol/L的溶液，作為儲(chǔ)備液。分別取5.0mL于50mL容量瓶中，再分別加入實(shí)施例1制備的5.0mL的熒光探針Eu^III-dtpa-bis(cytosine)儲(chǔ)備液，定容。此時(shí)探針及各檢測(cè)物質(zhì)濃度都為5.0×10^-5mol/L。在288nm的激發(fā)波長(zhǎng)下觀察熒光光譜的變化。結(jié)果如圖4a、圖4b和圖4c所示。如圖4b所示，在575nm處，熒光探針對(duì)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤的熒光強(qiáng)度較為顯著。并且在525nm處同時(shí)出現(xiàn)熒光峰，而其他的物質(zhì)在525nm處無(wú)明顯特征峰。通過(guò)圖4b和圖4c，能夠更加直觀的觀察到熒光強(qiáng)度在575nm和525nm的變化。由此可見(jiàn)，熒光探針Eu^III-dtpa-bis(cytosine)可以結(jié)合熒光方法對(duì)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤進(jìn)行檢測(cè)。

2.熒光探針Eu^III-dtpa-bis(cytosine)對(duì)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤的檢測(cè)機(jī)理

基于熒光探針對(duì)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤的檢測(cè)結(jié)果，本發(fā)明提出了熒光探針與被檢測(cè)物6-硫代鳥(niǎo)嘌呤反應(yīng)的機(jī)理，如圖5所示。眾所周知，Eu離子是九配位的，在Eu^III-dtpa-bis(cytosine)中有一分子的水與之配位。經(jīng)過(guò)修飾后的dtpa，在上下兩端形成兩只“手臂”，兩只“手臂”即胞嘧啶與6-硫代鳥(niǎo)嘌呤的結(jié)構(gòu)有一定的相似性，可以通過(guò)氫鍵和π-π堆積以及配位鍵抓取被檢測(cè)物，從而形成一個(gè)新的配合物。形成新的配合物以后，Eu的配位發(fā)生變化，所以在熒光光譜的575nm處出現(xiàn)熒光峰。繼續(xù)加入6-硫代鳥(niǎo)嘌呤，由于結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合方式的改變，即6-硫代鳥(niǎo)嘌呤在兩只“手臂”的外側(cè)結(jié)合，此時(shí)在525nm處出現(xiàn)了熒光峰。由于6-硫代鳥(niǎo)嘌呤的結(jié)構(gòu)與鳥(niǎo)嘌呤相似，所以在熒光探針中加入了鳥(niǎo)嘌呤，但是該檢測(cè)并沒(méi)有在525nm處出現(xiàn)熒光峰，由此可見(jiàn)，熒光探針Eu^III-dtpa-bis(cytosine)可以對(duì)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤選擇性檢測(cè)。

3.6-硫代鳥(niǎo)嘌呤與不同檢測(cè)物混合對(duì)熒光探針Eu^III-dtpa-bis(cytosine)檢測(cè)的影響

實(shí)驗(yàn)條件：分別取鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤，尿酸，黃嘌呤，次黃嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，胸腺嘧啶儲(chǔ)備液5.0mL于50mL容量瓶中，分別加入5.0mL的6-硫代鳥(niǎo)嘌呤儲(chǔ)備液，再分別加入5.0mL的熒光探針儲(chǔ)備液，定容，配制成探針，6-硫代鳥(niǎo)嘌呤，各檢測(cè)物質(zhì)濃度都為5.0×10^-5mol/L的溶液。在288nm的激發(fā)波長(zhǎng)下觀察熒光光譜的變化。結(jié)果如圖6a、圖6b和圖6c所示。在575nm處其他檢測(cè)物對(duì)熒光探針的檢測(cè)有一定影響，但在525nm處影響很小。此現(xiàn)象在圖6b和圖6c中更加直觀。由此可見(jiàn)，熒光探針在有其他物質(zhì)干擾的情況下，對(duì)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤依然具有特異性。