本發(fā)明涉及甘露三糖提取制備技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種鮮地黃中甘露三糖的提取方法。

背景技術(shù)：

甘露三糖(英文名：manninotriose，分子式C₁₈H₃₂O₁₆)，是一種天然的功能性寡糖，可以強(qiáng)效增殖人體腸道內(nèi)有益菌群(雙歧桿菌和乳酸菌等)，具有良好的生理功能。尤為重要的是，甘露三糖是鮮地黃經(jīng)加工炮制成熟地黃后含量最高的化學(xué)成分，含量高達(dá)30％(折干計)，因此從經(jīng)濟(jì)效益和安全性角度考慮，有必要開發(fā)從鮮地黃中制備高純度甘露三糖的方法，以期經(jīng)進(jìn)一步研究和開發(fā)使甘露三糖成為一類創(chuàng)新藥物，并為地黃的質(zhì)量控制提供參考。

CN104059111B公開了一種采用地黃根為原料，用活性炭分離得到甘露三糖的方案。所采用原料中甘露三糖含量偏低(因水蘇糖含量高于甘露三糖數(shù)倍)從而導(dǎo)致提取率偏低，采用活性炭分離甘露三糖容易造成吸附從而提取率進(jìn)一步降低。

郭威等在上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2007,21(6):70-72.“地黃中活性成分甘露三糖提取工藝研究”中以熟地黃為原料，優(yōu)化了沸水浸提工藝，如時間、次數(shù)、加水量等，但其使用的是沸水浸提，能源消耗大，提取率不高。

山東大學(xué)趙宇的碩士學(xué)位論文《鮮地黃產(chǎn)后加工機(jī)理研究》中以鮮地黃加工后生地黃為原料，測定了不同溫度和時間等因素影響下的甘露三糖的含量變化，為控制地黃在加工炮制過程中水蘇糖的降解方式提供了有益的參考，但論文中并未提及如何將甘露三糖更大程度的提取出來。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)從鮮地黃中提取甘露三糖的工藝中存在的能耗高、提取率不高的問題，本申請公開了一種從鮮地黃炮制直到提取、純化的甘露三糖的提取方法。

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

一種鮮地黃中甘露三糖的提取方法，包括以下步驟：

(1)鮮地黃高溫加工炮制：鮮地黃洗凈后切片，密閉加熱至90-95℃保持5-6h進(jìn)行炮制；

(2)甘露三糖樣液制備：將步驟(1)得到的鮮地黃加工炮制品加入70-80℃的水中浸提0.5-1h，殘渣按上述操作繼續(xù)浸提1次，合并浸提液，真空濃縮，即得到甘露三糖樣液；

(3)醇沉：將乙醇加入甘露三糖樣液，自然降溫靜置，得甘露三糖樣液醇沉部分；

(4)除雜脫色濃縮：將步驟(3)得到的醇沉部分用水稀釋，用0.5％的活性炭或大孔吸附樹脂脫色，過濾后濃縮得濃縮液；

(5)色譜分離：將濃縮液稀釋，通過凝膠LH20柱色譜以25％的乙醇洗脫，以TLC檢測合并含甘露三糖的餾分，濃縮或冷凍干燥得甘露三糖。

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(2)中鮮地黃加工炮制品與水的質(zhì)量比為1:2。

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(3)中乙醇與甘露三糖樣液體積比為1:2。

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(4)中脫色時上樣液重量與樹脂體積比例為450g/L。

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(3)中將乙醇加入甘露三糖樣液，在溫度80℃保溫30min，自然降溫靜置24h。

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(5)得到的甘露三糖純度大于98％，總收率≥4％。

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(2)中合并浸提液，真空濃縮至60^。Brix，即得到甘露三糖樣液。

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(4)中過濾后在60℃條件下濃縮樣液至60^。Brix；

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(5)中將濃縮液稀釋到10^。Brix，然后再過色譜柱。

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(4)中將步驟(3)得到的醇沉部分用水稀釋10倍。

本發(fā)明的有益效果：

1)對鮮地黃直接進(jìn)行高溫加工炮制，而不經(jīng)過生地黃的操作，大大的減少了鮮地黃加工的工藝步驟，炮制后甘露三糖含量豐富，并且，從收率數(shù)據(jù)看，也具有積極的影響；

2)水浸提時溫度為70-80℃，而不是慣常使用的沸水浸提，對提高收率具有顯著影響；

3)采用高溫蒸制后經(jīng)樹脂和凝膠聯(lián)用得到甘露三糖，總收率達(dá)到4.0％以上，純度高于98.0％，為高純度甘露三糖的制備提供了一條環(huán)保、便捷和經(jīng)濟(jì)的方法；

4)制備工藝簡潔且所用溶劑環(huán)保經(jīng)濟(jì)，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控。

附圖說明

圖1：鮮地黃，

圖2：鮮地黃HPLC，

圖3：濟(jì)南建聯(lián)藥店生地黃HPLC，

圖4：濟(jì)南建聯(lián)藥店熟地黃HPLC，

圖5為對比例1中的生地黃的HPLC，

圖6為對比例1中的熟地黃的HPLC，

圖7為實施例1中鮮地黃經(jīng)高溫加工炮制后的HPLC，

圖8：高純度甘露三糖單體HPLC。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明：

實施例1一種由鮮地黃制備高純度甘露三糖的方法，由如下步驟組成：

(1)鮮地黃高溫加工炮制：取采收后的鮮地黃25.0g，棄去霉?fàn)€部位，洗凈后切片，切成厚度為3cm的切片，密閉加熱至90℃保持6h；

(2)甘露三糖樣液制備：按質(zhì)量比為1:2的比例將步驟(1)得到的鮮地黃加工炮制品加入70℃的水中浸提0.5h，殘渣按上述工藝?yán)^續(xù)浸提1次，合并浸提液，真空濃縮至60^。Brix的糖液，即得到甘露三糖樣液。

(3)醇沉得甘露三糖樣液醇沉部分：按體積比為1:2的比例將乙醇加入甘露三糖樣液，在溫度80℃保溫30min，自然降溫靜置24h，得甘露三糖樣液醇沉部分；

(4)除雜脫色濃縮得甘露三糖樣液：將步驟3所得到的醇沉甘露三糖樣液用水稀釋10倍，用0.5％的活性炭或大孔吸附樹脂(上樣液重量與樹脂體積比例為450g/L)脫色，過濾后在60℃條件下濃縮樣液至60^。Brix；

(5)凝膠LH20柱色譜分離得到甘露三糖：將甘露三糖樣液稀釋到10^。Brix，通過凝膠LH20柱色譜以25％的乙醇洗脫，以TLC檢測合并含甘露三糖的餾分，濃縮或冷凍干燥得甘露三糖，濃縮干燥得甘露三糖1.1g，純度98.5％，總收率4.4％。

實施例2一種由鮮地黃制備高純度甘露三糖的方法，由如下步驟組成：

(1)鮮地黃高溫加工炮制：取采收后的鮮地黃50.0g，棄去霉?fàn)€部位，洗凈后切片，切成厚度為4cm的切片，密閉加熱至95℃保持5h；

(2)甘露三糖樣液制備：按質(zhì)量比為1:2.5的比例將步驟(1)得到的鮮地黃加工炮制品加入80℃的水中浸提1h，殘渣按上述工藝?yán)^續(xù)浸提1次，合并浸提液，真空濃縮至60^。Brix的糖液，即得到甘露三糖樣液。

(3)醇沉得甘露三糖樣液醇沉部分：按體積比為1:2的比例將乙醇加入甘露三糖樣液，在溫度80℃保溫30min，自然降溫靜置24h，得甘露三糖樣液醇沉部分；

(4)除雜脫色濃縮得甘露三糖樣液：將步驟3所得到的醇沉甘露三糖樣液用水稀釋10倍，用1％的活性炭或大孔吸附樹脂(上樣液重量與樹脂體積比例為450g/L)脫色，過濾后在60℃條件下濃縮樣液至60^。Brix；

(5)凝膠LH20柱色譜分離得到甘露三糖：將甘露三糖樣液稀釋到10^。Brix，通過凝膠LH20柱色譜以20％的乙醇洗脫，以TLC檢測合并含甘露三糖的餾分，濃縮得甘露三糖，濃縮干燥得甘露三糖2.0g，純度98.1％，總收率4.0％。

實施例3一種由鮮地黃制備高純度甘露三糖的方法，由如下步驟組成：

(1)鮮地黃高溫加工炮制：取采收后的鮮地黃100.0g，棄去霉?fàn)€部位，洗凈后切片，切成厚度為3cm的切片，密閉加熱至90℃保持6h；

(2)甘露三糖樣液制備：按質(zhì)量比為1:2的比例將步驟(1)得到的鮮地黃加工炮制品加入80℃的水中浸提1h，殘渣按上述工藝?yán)^續(xù)浸提1次，合并浸提液，真空濃縮至60。Brix的糖液，即得到甘露三糖樣液。

(3)醇沉得甘露三糖樣液醇沉部分：按體積比為1:2的比例將乙醇加入甘露三糖樣液，在溫度80℃保溫30min，自然降溫靜置24h，得甘露三糖樣液醇沉部分；

(4)除雜脫色濃縮得甘露三糖樣液：將步驟3所得到的醇沉甘露三糖樣液用水稀釋10倍，用1％的活性炭或大孔吸附樹脂(上樣液重量與樹脂體積比例為450g/L)脫色，過濾后在60℃條件下濃縮樣液至60^。Brix；

(5)凝膠LH20柱色譜分離得到甘露三糖：將甘露三糖樣液稀釋到10^。Brix，通過凝膠LH20柱色譜以20％的乙醇洗脫，以TLC檢測合并含甘露三糖的餾分，濃縮得甘露三糖，濃縮干燥得甘露三糖4.3g，純度98.3％，總收率4.3％。

對比例1

步驟(1)中鮮地黃中60℃烘焙為生地黃，生地黃蒸鍋中蒸制16小時后進(jìn)行第2步操作，后續(xù)操作同實施例3相同。純度98.4％，總收率0.9％。

對比例2

同實施例3相比，步驟(2)中的水浸提操作中水為沸水，其余操作同實施例3相同。純度98.2％，總收率2.5％。

圖1為鮮地黃的圖片，圖2為鮮地黃的HPLC，HPLC檢測方法如下：

美國Agilent 1200高效液相色譜儀，包括四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱及Agilent Chem Station工作站。蒸發(fā)光散射檢測器為Alltech ELSD 2000ES。乙腈(色譜純)購于Honeywell Burdick&Jackson，實驗用水由Milli-Q Integral 3超純水處理器制備。色譜柱:Thermo Aps-2 Hypersil NH₂(4.6mm×250mm,5μm)，流動相:乙腈-水(75:25)，流速:1mL/min。蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度為94℃，載氣空氣流速為2.2L/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量10μL。樣品均精密稱定，加水適量溶解成1mg/mL溶液。

圖3和4分別為從濟(jì)南建聯(lián)藥店購買的生地黃和熟地黃的HPLC，圖5和6分別為對比例1中的生地黃和熟地黃的HPLC，圖7為實施例1中鮮地黃經(jīng)高溫加工炮制后的HPLC，圖8為高純度甘露三糖單體HPLC。從圖2-8中可以看出，從市面上方便買到的生地黃和熟地黃中甘露三糖的含量都比較低，對比例1中炮制方法得到的生地黃和熟地黃中甘露三糖的含量也比較低，而本申請實施例1中的炮制方法得到的熟地黃中，甘露三糖含量較高，為提高收率提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受實施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。