專(zhuān)利名稱(chēng)：洋地黃提取物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種洋地黃提取物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
洋地黃葉為玄參科植物紫花洋地黃(Digitalis purpurea L.)的干燥葉。目 前已從紫花洋地黃葉中分離出20余種強(qiáng)心甙，由三種不同的甙元洋地黃毒甙元 (digitoxigenin)、輕基洋地黃毒試元(gitoxigenin)禾口吉他洛試元(gitaloxigenin)與不 同的糖縮合而成。將從洋地黃中提取得到的有效成分應(yīng)用于臨床疾病治療的歷史悠久，例如洋地 黃毒苷用于治療充血性心力衰竭已有近百年的歷史。近年來(lái)，大量研究表明，洋地黃的某些 有效成分可以用來(lái)治療眼部視疲勞。目前糖尿病視網(wǎng)膜病變是醫(yī)療領(lǐng)域的難題，臨床上只 能采取一些輔助治療手段，至今沒(méi)有專(zhuān)門(mén)治療的藥品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種洋地黃提取物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種洋地黃提取物的制備方法，包括如下步驟(1)將洋地黃葉進(jìn)行醇提，得到粗提液；(2)將步驟(1)的粗提液和酸乙醇混合，靜置后過(guò)濾，得到濾液；所述粗提液和所 述酸乙醇的體積比為1 1 ；所述酸乙醇是乙醇和醋酸的水溶液，乙醇的含量為94%-95% (質(zhì)量百分含量)，醋酸的含量為0.6%-0.7% (質(zhì)量百分含量)；(3)將步驟(2)的濾液50-60°C、0. 08-0. 12MPa蒸發(fā)，得到提取液；(4)將步驟(3)的提取液與正丁醇混合，分層后棄正丁醇層，得到萃取液；(5)在步驟⑷的萃取液中加入4-6倍體積的水，經(jīng)過(guò)截留分子量10K Da的超濾 柱超濾，得到粗濾液；將粗濾液經(jīng)過(guò)截留分子量5K Da的超濾柱超濾，得到超濾液；(6)將步驟(5)的超濾液蒸干，得到洋地黃提取物。步驟(1)中，所述醇提可為將洋地黃葉用95% (質(zhì)量百分含量)乙醇水溶液 75-85°C提取1. 5-2. 5小時(shí)；所述洋地黃葉和所述95%乙醇水溶液的配比為lg洋地黃葉 9-1 lmL 95%乙醇水溶液；所述醇提優(yōu)選為將洋地黃葉粉末用所述95%乙醇水溶液80°C 提取2小時(shí)；所述洋地黃葉和所述95%乙醇水溶液的配比為lg洋地黃葉10mL 95%乙醇 水溶液。步驟(1)中，進(jìn)行所述醇提后，可50°C，0.092MPa蒸發(fā)，蒸發(fā)后體積為蒸發(fā)前體積 的1/23-1/24，得到所述粗提液。所述步驟⑵中，可將步驟(1)的粗提液和酸乙醇混合，靜置40分鐘后過(guò)濾，得到 濾液；所述酸乙醇的制備方法為每100ml 95% (質(zhì)量百分含量)乙醇水溶液中加入0.5ml 冰醋酸(冰乙酸)。所述步驟(3)中，可將步驟(2)的濾液55°C、0. IMPa蒸發(fā)，蒸發(fā)后體積為蒸發(fā)前體 積的51% -57%，得到提取液。
所述步驟(4)中，可將步驟(3)的提取液與正丁醇等體積混合。所述步驟(5)中，可在步驟(4)的萃取液中加入5倍體積的水。所述步驟(6)中，可將步驟(5)的超濾液60°C蒸干，得到洋地黃提取物。所述洋地黃可為紫花洋地黃。以上任一所述方法制備得到的洋地黃提取物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種眼用凝膠，是用如下原料制備得到的-.2. 7-3. 2質(zhì)量份所述洋 地黃提取物、145-155質(zhì)量份NaOH、480-520質(zhì)量份卡波姆943、25_29質(zhì)量份富馬酸二甲酯 和49300-49350質(zhì)量份水。所述眼用凝膠具體可為用如下原料制備得到的3質(zhì)量份所述洋地黃提取物、150 質(zhì)量份Na0H、500質(zhì)量份卡波姆943、27質(zhì)量份富馬酸二甲酯和49320質(zhì)量份水。所述眼用凝膠具體可為用如下方法制備的將所述洋地黃提取物用水溶解，過(guò)濾 后收集濾液；將所述NaOH、所述卡波姆943、所述富馬酸二甲酯用水溶解，滅菌后得到無(wú)菌 基質(zhì)；將所述濾液和所述無(wú)菌基質(zhì)混合，加入水，得到洋地黃苷眼用凝膠。本發(fā)明還保護(hù)一種治療和/或預(yù)防糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物，它的活性成分為以 上任一所述的眼用凝膠。本發(fā)明從紫花洋地黃中提取得到一種提取物，通過(guò)制劑技術(shù)將其生產(chǎn)成為眼用凝 膠制劑，可高效預(yù)防和治療糖尿病視網(wǎng)膜病變。本發(fā)明提供的藥物第一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于預(yù)防和 治療糖尿并視網(wǎng)膜病變的藥品，改變了糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療現(xiàn)狀。


圖1為洋地黃提取物的色譜圖。圖2七葉洋地黃雙苷滴眼液的色譜圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。紫花洋地黃購(gòu)于上海中藥材公司；卡波姆943 購(gòu)于北京會(huì)友化工有限公司；富 馬酸二甲酯購(gòu)于上海歐樂(lè)化工有限公司。糖尿病視網(wǎng)膜病變的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下(根據(jù)眼底改變，將糖尿病視網(wǎng)膜病變分為六 期)I (1)數(shù)。II (2)易數(shù)。III (3)
易數(shù)增殖型。IV (4)V (5)
4視網(wǎng)膜有微動(dòng)脈瘤或并有小出血點(diǎn)；(+)極少量，易數(shù)；(++)較多，不易視網(wǎng)膜有黃白“硬性滲出”或并有出血斑；(+)極少量，易數(shù)；(++)較多，不視網(wǎng)膜有白色“軟性滲出”或并有出血斑；(+)極少量，易數(shù)；(++)較多，不視網(wǎng)膜有新生血管和/或玻璃體出血。 視網(wǎng)膜有新生血管和纖維增殖
VI (6)視網(wǎng)膜有新生血管和纖維增殖并發(fā)現(xiàn)網(wǎng)膜脫離。其中，I、II、III期統(tǒng)稱(chēng)為單純型視網(wǎng)膜病變，IV、V、VI期統(tǒng)稱(chēng)為增殖型視網(wǎng)膜病變。實(shí)施例1、洋地黃提取物的制備一、洋地黃提取物的制備1、醇提取紫花洋地黃葉300g粉碎，加入95%的乙醇水溶液3000ml，在80°C溫度回流提 取2小時(shí)，過(guò)濾后得到粗提濾液。利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將粗提濾液在50°C，0. 092MPa的條 件下減壓除乙醇至無(wú)醇味，得到粗提液約128ml。2、沉淀向粗提液中加入等體積酸乙醇，混勻后靜置40分鐘，過(guò)濾，得濾液252ml ；酸乙 醇的配方每IOOml 95 %的乙醇水溶液中加入0. 5ml冰醋酸(含乙醇94. 3 %，冰醋酸 0. 65% )0利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液在55°C，0. IMPa的條件下減壓除乙醇至無(wú)醇味，得到 提取液135ml。3、萃取向提取液中加入等體積正丁醇，保留水層、棄正丁醇層，得到萃取液約130ml。4、超濾向萃取液中加入650ml水，經(jīng)過(guò)截留分子量IOK Da的超濾柱超濾，得到粗濾液；粗 濾液再經(jīng)過(guò)截留分子量5K Da的超濾柱超濾，得到超濾液710ml左右。5、干燥超濾液60°C蒸干，得到70mg左右的洋地黃提取物。二、洋地黃提取物的色譜檢測(cè)采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(200mmX4. 6mm, 5 μ m)；以水-乙 腈為流動(dòng)相(水與乙腈的體積比為18 1)；流速lml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。將Img洋地黃提取物用20ml水溶解，配成濃度為0. 05mg/ml的溶液，取10 μ 1進(jìn) 樣，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，所得色譜圖見(jiàn)圖1。以德國(guó)視都靈藥廠(chǎng)生產(chǎn)的七葉洋地黃 雙苷滴眼液(批號(hào)081009)為供試品，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，所得色譜圖見(jiàn)圖2。由圖1可知，洋地黃提取物在該色譜條件下，在保留時(shí)間10-30分鐘之間，有峰面 積占總面積超過(guò)15%的6個(gè)色譜峰。洋地黃提取物和七葉洋地黃雙苷滴眼液的圖譜有明顯 的差別，表明兩者的主要成分明顯不一致。實(shí)施例2、洋地黃苷眼用凝膠的生產(chǎn)1、稱(chēng)取實(shí)施例1制備的洋地黃提取物0. 3g，用IOOOml水溶解，溶液經(jīng)過(guò)0.22um微 孔濾膜過(guò)濾，收集濾液；2、稱(chēng)取NaOH 15g、卡波姆(943) 50g、富馬酸二甲酯2. 7g，用2000ml水溶解得基質(zhì)； 121°C高壓滅菌20min，得到無(wú)菌基質(zhì)；3、將步驟1的濾液和步驟2的無(wú)菌基質(zhì)混合，加水至5000g，混勻，得到洋地黃苷眼
用凝膠。將洋地黃苷眼用凝膠用鋁管灌裝，5g/支。上述步驟均在無(wú)菌條件下操作，所使用的器皿和鋁管事先都進(jìn)行無(wú)菌處理。
實(shí)施例3、洋地黃苷眼用凝膠用于預(yù)防糖尿病視網(wǎng)膜病變的療效一、制作糖尿病大鼠模型將鏈脲佐菌素(STZ)以0. lmol/L，pH4.2的檸檬酸緩沖液溶解配制成2% (2g鏈脲 佐菌素溶于100毫升緩沖液)STZ溶液。SD大鼠60只(購(gòu)于遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)， 按65mg/kg體重尾靜脈注射鏈脲佐菌素(注射過(guò)程中藥物置于冰浴中)。注射后48h檢測(cè) 尿糖和血糖，尿糖在+++以上，血糖高于16. 65m mol/L為糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠模 型，血糖、尿糖均保持在較高水平，并且隨病程延長(zhǎng)有所提高，同時(shí)均出現(xiàn)多飲、多食、多尿、 消瘦、活動(dòng)減少等表現(xiàn)。二、洋地黃苷眼用凝膠用于預(yù)防糖尿病視網(wǎng)膜病變的療效2周后，選擇血糖值在350 550mg* dl的大鼠30只用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng) 于動(dòng)物中心的標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房，并飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。飼養(yǎng)房條件室內(nèi)通風(fēng)良好，相對(duì)濕度 40% 70%，室溫 18 22°C。將30只糖尿病大鼠隨機(jī)分3組，每組10只。3組大鼠分別進(jìn)行給藥，具體如下第一組(空白對(duì)照組)滴加生理鹽水，每日三次，每次一滴，滴入眼結(jié)膜囊內(nèi)(近 耳側(cè)外眼角)；第二組(陽(yáng)性對(duì)照組)滴加七葉洋地黃雙苷滴眼液(德國(guó)視都靈藥廠(chǎng)生產(chǎn)，批號(hào) 081009)，每日三次，每次一滴，滴入眼結(jié)膜囊內(nèi)(近耳側(cè)外眼角)；第三組(治療組)滴加實(shí)施例2制備的洋地黃苷眼用凝膠，每日三次，每次一滴， 滴入眼結(jié)膜囊內(nèi)(近耳側(cè)外眼角)。連續(xù)給藥20周，然后檢查視網(wǎng)膜，根據(jù)糖尿病視網(wǎng)膜病變的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)， 見(jiàn)表1。表1不同組大鼠的視網(wǎng)膜病變的評(píng)價(jià)結(jié)果
\^號(hào) 組別^\12345678910平均值第一組45655655455第二組23323223322. 5第三組10010112110.8空白對(duì)照組糖尿病視網(wǎng)膜病變非常嚴(yán)重，20%處于6期，60%處于5期，20%處于 4期。陽(yáng)性對(duì)照組病程有所緩解，50%處于3期，50%處于2期。治療組效果最好，10%處 于2期，60%處于1期，30%未見(jiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明所得的洋地黃 苷眼用凝膠預(yù)防糖尿病視網(wǎng)膜病變療效明顯，而且明顯好于德國(guó)視都靈藥廠(chǎng)生產(chǎn)的七葉洋 地黃雙苷滴眼液。實(shí)施例4、洋地黃苷眼用凝膠用于治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的療效一、制作糖尿病大鼠模型同實(shí)施例1的步驟一。二、洋地黃苷眼用凝膠用于治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的療效成模12周后觀(guān)察大鼠的視網(wǎng)膜，選擇視網(wǎng)膜病變處于4期且病變程度相近的大鼠30只用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)于動(dòng)物中心的標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房，并飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。室內(nèi)通 風(fēng)良好，相對(duì)濕度40 % 70 %，室溫18 22 °C。將30只糖尿病大鼠隨機(jī)分3組，每組10只。3組大鼠分別進(jìn)行給藥，具體如下第一組(空白對(duì)照組)滴加生理鹽水，每日三次，每次一滴，滴入眼結(jié)膜囊內(nèi)(近 耳側(cè)外眼角)；第二組(陽(yáng)性對(duì)照組)滴加七葉洋地黃雙苷滴眼液(德國(guó)視都靈藥廠(chǎng)生產(chǎn)，批號(hào) 081009)，每日三次，每次一滴，滴入眼結(jié)膜囊內(nèi)(近耳側(cè)外眼角)；第三組(治療組)滴加實(shí)施例2制備的洋地黃苷眼用凝膠，每日三次，每次一滴， 滴入眼結(jié)膜囊內(nèi)(近耳側(cè)外眼角)。連續(xù)給藥10周，然后檢查視網(wǎng)膜，根據(jù)糖尿病視網(wǎng)膜病變的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)， 見(jiàn)表2。表2不同組大鼠的視網(wǎng)膜病變的評(píng)價(jià)結(jié)果 空白對(duì)照組60%處于6期，40%處于5期。陽(yáng)性對(duì)照組10%處于4期，40%處于 2期，50%處于2期。治療組20%處于2期，80%處于1期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明所得的 洋地黃苷眼用凝膠治療糖尿病視網(wǎng)膜病變療效顯著，而且明顯好于德國(guó)視都靈藥廠(chǎng)生產(chǎn)的 七葉洋地黃雙苷滴眼液。
權(quán)利要求
一種洋地黃提取物的制備方法，包括如下步驟(1)將洋地黃葉進(jìn)行醇提，得到粗提液；(2)將步驟(1)的粗提液和酸乙醇混合，靜置后過(guò)濾，得到濾液；所述粗提液和所述酸乙醇的體積比為1∶1；所述酸乙醇是乙醇和醋酸的水溶液，乙醇的含量為94％-95％(質(zhì)量百分含量)，醋酸的含量為0.6％-0.7％(質(zhì)量百分含量)；(3)將步驟(2)的濾液50-60℃、0.08-0.12MPa蒸發(fā)，得到提取液；(4)將步驟(3)的提取液與正丁醇混合，分層后棄正丁醇層，得到萃取液；(5)在步驟(4)的萃取液中加入4-6倍體積的水，經(jīng)過(guò)截留分子量10K Da的超濾柱超濾，得到粗濾液；將粗濾液經(jīng)過(guò)截留分子量5K Da的超濾柱超濾，得到超濾液；(6)將步驟(5)的超濾液蒸干，得到洋地黃提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述醇提為將洋地黃葉用 95% (質(zhì)量百分含量)乙醇水溶液75-85°C提取1. 5-2. 5小時(shí)；所述洋地黃葉和所述95% 乙醇水溶液的配比為lg洋地黃葉9-llmL 95%乙醇水溶液；所述醇提優(yōu)選為將洋地黃葉 粉末用所述95%乙醇水溶液80°C提取2小時(shí)；所述洋地黃葉和所述95%乙醇水溶液的配 比為lg洋地黃葉10mL 95%乙醇水溶液。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(1)中，進(jìn)行所述醇提后，50°C、 0. 092MPa蒸發(fā)，蒸發(fā)后體積為蒸發(fā)前體積的1/23-1/24，得到所述粗提液。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，將步驟(1)的 粗提液和酸乙醇混合，靜置40分鐘后過(guò)濾，得到濾液；所述酸乙醇的制備方法為每100ml 95% (質(zhì)量百分含量)乙醇水溶液中加入0. 5ml冰醋酸。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中，將步驟⑵ 的濾液55°C、0. IMPa蒸發(fā)，蒸發(fā)后體積為蒸發(fā)前體積的51% _57%，得到提取液；所述步驟 ⑷中，將步驟⑶的提取液與正丁醇等體積混合；所述步驟(5)中，在步驟⑷的萃取液中 加入5倍體積的水；所述步驟(6)中，將步驟(5)的超濾液60°C蒸干，得到洋地黃提取物； 所述洋地黃為紫花洋地黃。
6.權(quán)利要求1至5中任一所述方法制備得到的洋地黃提取物。
7.—種眼用凝膠，是用如下原料制備得到的2. 7-3. 2質(zhì)量份權(quán)利要求6所述洋地黃 提取物、145-155質(zhì)量份Na0H、480-520質(zhì)量份卡波姆943、25_29質(zhì)量份富馬酸二甲酯和 49300-49350質(zhì)量份水。
8.如權(quán)利要求7所述的眼用凝膠，其特征在于是用如下原料制備得到的3質(zhì)量份權(quán) 利要求6所述洋地黃提取物、150質(zhì)量份Na0H、500質(zhì)量份卡波姆943、27質(zhì)量份富馬酸二甲 酯和49320質(zhì)量份水。
9.如權(quán)利要求7或8所述的眼用凝膠，其特征在于是用如下方法制備的將所述洋地 黃提取物用水溶解，過(guò)濾后收集濾液；將所述NaOH、所述卡波姆943、所述富馬酸二甲酯用 水溶解，滅菌后得到無(wú)菌基質(zhì)；將所述濾液和所述無(wú)菌基質(zhì)混合，加入水，得到洋地黃苷眼 用凝膠。
10.一種治療和/或預(yù)防糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物，它的活性成分為權(quán)利要求7至9中 任一所述的眼用凝膠。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種洋地黃提取物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種洋地黃提取物的制備方法，包括如下步驟(1)將洋地黃葉進(jìn)行醇提，得到粗提液；(2)將粗提液和酸乙醇混合，靜置后過(guò)濾，得到濾液；(3)將濾液蒸發(fā)，得到提取液；(4)將提取液與正丁醇混合，分層后棄正丁醇層，得到萃取液；(5)將萃取液經(jīng)過(guò)截留分子量10K Da和5K Da的超濾柱超濾，得到超濾液；(6)將超濾液蒸干，得到洋地黃提取物。本發(fā)明還保護(hù)所述方法制備得到的洋地黃提取物以及用所述洋地黃提取物制備的眼用凝膠。所述眼用凝膠，可高效預(yù)防和治療糖尿病視網(wǎng)膜病變。本發(fā)明提供的藥物是第一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于預(yù)防和治療糖尿并視網(wǎng)膜病變的藥品，改變了糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療現(xiàn)狀，具有重大的經(jīng)濟(jì)前景和社會(huì)意義。
文檔編號(hào)A61K9/00GK101874848SQ200910242110
公開(kāi)日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2009年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日
發(fā)明者于洪儒 申請(qǐng)人:于洪儒