本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種薩能奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞miRNA的篩選與鑒定方法。

背景技術(shù)：

截止目前，miRNA的鑒別及發(fā)現(xiàn)主要有三種方法：miRNA cDNA文庫測序法，生物信息學(xué)預(yù)測法和正向遺傳性篩選。

生物信息學(xué)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量新miRNA，但該方法存在一個(gè)弊端：它是通過對已知miRNA序列或者前體序列規(guī)律的總結(jié)去鑒別新miRNA，因此導(dǎo)致預(yù)測結(jié)果精確度不高，而且容易出現(xiàn)假陽性和假陰性。正向遺傳學(xué)篩選是分子生物學(xué)家最初使用的一種研究方法，它是通過生物個(gè)體或細(xì)胞基因組的自發(fā)突變或人工誘變產(chǎn)生的變異表型而鑒定候選miRNA。使用該方法最早鑒定發(fā)現(xiàn)了lin-4，let-7，后來通過這種方法又鑒別發(fā)現(xiàn)了果蠅中的miR-278、miR-14以及線蟲中的lsy-6。可是，通過正向遺傳學(xué)篩選鑒別候選miRNA的效率比較低；如果miRNAs只是單個(gè)堿基發(fā)生突變、缺失、錯(cuò)位或堿基的改變僅僅使表型發(fā)生微小的差異甚至沒有變化，造成許多候選miRNAs的鑒別發(fā)生遺漏，因此該方法已經(jīng)慢慢被淘汰。

miRNA cDNA文庫測序法包括直接克隆法和高通量測序法，直接克隆法效率相對比較低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，具有明顯的局限性。相對于克隆測序技術(shù)，高通量測序具有高效性、精確性以及快速性等優(yōu)點(diǎn)，提取RNA接頭連接反轉(zhuǎn)錄后只進(jìn)行PCR擴(kuò)增，直接上機(jī)測序即可，不需要克隆過程，再將測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析及靶基因預(yù)測等，從而獲得新miRNA。目前，高通量測序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到各種植物及動物的miRNA研究當(dāng)中。目前，現(xiàn)有技術(shù)中還沒有一種薩能奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞miRNA的篩選與鑒定方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種薩能奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞miRNA的篩選與鑒定方法，該方法利用高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)對薩能奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞miRNA進(jìn)行鑒定并作GO功能分析及KEGG通路分析。

其具體技術(shù)方案為：

一種薩能奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞miRNA的篩選與鑒定方法，包括以下步驟：

步驟1、薩能奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的獲得：

選取5只奶山羊做同期發(fā)情，與最后一次配種30天B超檢查妊娠狀況，選成功妊娠并與40-45天通過手術(shù)法無菌取出胎兒，用含雙抗PBS沖洗三遍，放入無血清培養(yǎng)基快速帶回實(shí)驗(yàn)室。在細(xì)胞室內(nèi)無菌除去頭、四肢、內(nèi)臟，剩余皮膚組織酒精沖洗三遍，PBS沖洗三遍，然后剪成1mm³小塊貼在細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)，每三天換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿90％時(shí)消化傳代，并作生長曲線及核型分析；

步驟2、RNA提?。?/p>

取對數(shù)生長期的細(xì)胞用trizol法提取RNA，該實(shí)驗(yàn)用到的所有物品包括1000mL、200μL、10μL tip頭、槍頭盒、Enpendoff管必須用0.1％的DEPC水或無RNA酶水浸泡6h以上或直接過夜，包裝好后高壓滅菌20-30min，65℃烘干備用；用到的所有研缽、玻璃器皿、金屬器械用錫箔紙包裝好后放于180℃烘箱中烘烤8h以上，自然降溫備用，提取的總RNA經(jīng)微量分光光度計(jì)檢查純度及濃度，合適以后送華大基因進(jìn)行高通量測序；

步驟3、文庫構(gòu)建及高通量測序

取上述總RNA經(jīng)PAGE膠純化、反轉(zhuǎn)錄，然后以HiSeq2000為測序平臺進(jìn)行高通量測序構(gòu)建cDNA文庫；

步驟4、數(shù)據(jù)處理

薩能奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞樣品在HiSeq2000平臺測序后得到冗余數(shù)據(jù)，對該原始數(shù)據(jù)首先要進(jìn)行去低質(zhì)量序列，去接頭序列以及去污染序列處理，獲得干凈序列即clean reads，然后再進(jìn)行下一步生物信息學(xué)分析；

將獲得的clean reads與綿羊全基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對，用SOAPv1.11軟件分析序列表達(dá)差異及分布情況，為了使每個(gè)unique sRNA有唯一的注釋，我們采用如下優(yōu)先規(guī)則：rRNAetc>known miRNA>repeat>exon>intron，由于rRNAetc是經(jīng)Genbank數(shù)據(jù)庫和Rfam數(shù)據(jù)庫比對獲得，實(shí)驗(yàn)規(guī)定兩個(gè)數(shù)據(jù)庫間的優(yōu)先順序?yàn)镚enbank>Rfam，沒有比對上任何注釋信息的sRNA用unann表示。

為進(jìn)一步分析候選miRNA二級結(jié)構(gòu)，該實(shí)驗(yàn)用Mfold3.2軟件^]和RNAfold在線軟件預(yù)測新miRNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)及最小自由能，用MIREAPv0.2軟件再進(jìn)一步深入分析每一個(gè)候選序列，參數(shù)設(shè)置如下：

(1)miRNA序列長度為18-26nt

(2)miRNA參考序列長度為20-24nt

(3)Drosha/Dicer酶切位點(diǎn)最少為3個(gè)

(4)miRNA在參考序列上最大拷貝數(shù)為20

(5)miRNA前體允許的最大自由能為200kcal/mol

(6)miRNA和miRNA*之間最大空格數(shù)為35

(7)miRNA和miRNA*之間最小配對數(shù)為14

(8)miRNAand miRNA*之間最大凸環(huán)為4。

進(jìn)一步，步驟3中具體操作過程依據(jù)Small RNA Sample Preparation Kit(Illumina,USA)試劑盒說明書步驟進(jìn)行，簡單過程如下：

(1)首先通過15％聚丙酰胺凝膠電泳分離總RNA，切割片段為18-30nt部分，然后進(jìn)行分離純化、膠回收；

(2)通過T₄RNA連接酶分別在3’端和5’端添加3’((PO₄)-CTGTAGGCACCATCAA-(NH₂)-(CH₂)₆)和5’(ATCGTAGGCACCUGAAA)接頭序列

(3)將成功添加接頭序列的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后25個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

(4)90bp左右的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PAGE膠純化回收以后其產(chǎn)物在深圳華大科技HiSeq2000平臺進(jìn)行測序。

(5)測序片段去除低質(zhì)量序列、接頭序列、重復(fù)序列以及污染序列后進(jìn)行信息生物學(xué)分析。

進(jìn)一步，步驟4中進(jìn)行去低質(zhì)量序列，去接頭序列以及去污染序列處理的過程具體如下：

(1)去除有5’接頭序列的reads；

(2)去除沒有3’接頭序列的reads；

(3)去除測序質(zhì)量較低的reads；

(4)去除沒有插入片段的reads；

(5)去除含有polyA的reads；

(6)去除小于18核苷酸的片段。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明通過高通量測序，獲得16395039 total_reads，取出冗余數(shù)據(jù)后獲得clean_reads 16150181，其中Unique sRNAS 205857。生物信息學(xué)分析獲得已知miRNA 44條，候選新miRNA247條。已知miRNA靶基因數(shù)量5401，靶基因位點(diǎn)數(shù)為6069；候選miRNA靶基因數(shù)量8401，靶基因位點(diǎn)數(shù)位10832。

附圖說明

圖1是：高通量測序準(zhǔn)備流程圖；

圖2是：生物信息學(xué)分析流程圖；

圖3是：部分候選新miRNA前體二級結(jié)構(gòu)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方案對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。

一種薩能奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞miRNA的篩選與鑒定方法，包括以下步驟：

步驟1、薩能奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的獲得：

選取5只奶山羊做同期發(fā)情，與最后一次配種30天左右B超檢查妊娠狀況，選成功妊娠并與40-45天左右通過手術(shù)法無菌取出胎兒，用含雙抗PBS沖洗三遍，放入無血清培養(yǎng)基快速帶回實(shí)驗(yàn)室。在細(xì)胞室內(nèi)無菌除去頭、四肢、內(nèi)臟，剩余皮膚組織酒精沖洗三遍，PBS沖洗三遍，然后剪成1mm³小塊貼在細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)，每三天換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿90％時(shí)消化傳代，并作生長曲線及核型分析；

步驟2、RNA提?。?/p>

取對數(shù)生長期的細(xì)胞用trizol法提取RNA，該實(shí)驗(yàn)用到的所有物品包括1000mL、200μL、10μL tip頭、槍頭盒、Enpendoff管等均必須用0.1％的DEPC水或無RNA酶水浸泡6h以上或直接過夜，包裝好后高壓滅菌20-30min，65℃烘干備用；用到的所有研缽、玻璃器皿、金屬器械等用錫箔紙包裝好后放于180℃烘箱中烘烤8h以上，自然降溫備用，提取的總RNA經(jīng)微量分光光度計(jì)檢查純度及濃度，合適以后送華大基因進(jìn)行高通量測序；

步驟3、文庫構(gòu)建及高通量測序

取上述總RNA經(jīng)PAGE膠純化、反轉(zhuǎn)錄，然后以HiSeq2000為測序平臺進(jìn)行高通量測序構(gòu)建cDNA文庫，建庫過程及生物信息學(xué)分析流程如圖1、圖2；

具體操作過程依據(jù)Small RNA Sample Preparation Kit(Illumina,USA)試劑盒說明書步驟進(jìn)行，簡單過程如下：

(1)首先通過15％聚丙酰胺凝膠電泳分離總RNA，切割片段為18-30nt部分，然后進(jìn)行分離純化、膠回收；

(2)通過T₄RNA連接酶分別在3’端和5’端添加3’((PO₄)-CTGTAGGCACCATCAA-(NH₂)-(CH₂)₆)和5’(ATCGTAGGCACCUGAAA)接頭序列

(3)將成功添加接頭序列的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后25個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

(4)90bp左右的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PAGE膠純化回收以后其產(chǎn)物在深圳華大科技HiSeq2000平臺進(jìn)行測序。

(5)測序片段去除低質(zhì)量序列、接頭序列、重復(fù)序列以及污染序列后進(jìn)行信息生物學(xué)分析。

步驟4、數(shù)據(jù)處理

薩能奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞樣品在HiSeq2000平臺測序后得到冗余數(shù)據(jù)，對該原始數(shù)據(jù)首先要進(jìn)行去低質(zhì)量序列，去接頭序列以及去污染序列等處理，獲得干凈序列即clean reads，然后再進(jìn)行下一步生物信息學(xué)分析。其處理過程具體如下：

(1)去除有5’接頭序列的reads；

(2)去除沒有3’接頭序列的reads；

(3)去除測序質(zhì)量較低的reads；

(4)去除沒有插入片段的reads；

(5)去除含有polyA的reads；

(6)去除小于18核苷酸的片段；

將獲得的clean reads與綿羊全基因組數(shù)據(jù)庫(International Sheep Genomics Consortium：ISGC)進(jìn)行blast比對，用SOAPv1.11軟件分析序列表達(dá)差異及分布情況，為了使每個(gè)unique sRNA有唯一的注釋，我們采用如下優(yōu)先規(guī)則：rRNAetc>known miRNA>repeat>exon>intron，由于rRNAetc是經(jīng)Genbank數(shù)據(jù)庫和Rfam數(shù)據(jù)庫比對獲得，實(shí)驗(yàn)規(guī)定兩個(gè)數(shù)據(jù)庫間的優(yōu)先順序?yàn)镚enbank>Rfam，沒有比對上任何注釋信息的sRNA用unann表示。

為進(jìn)一步分析候選miRNA二級結(jié)構(gòu)，該實(shí)驗(yàn)用Mfold3.2軟件^]和RNAfold在線軟件預(yù)測新miRNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)及最小自由能，用MIREAPv0.2軟件再進(jìn)一步深入分析每一個(gè)候選序列，參數(shù)設(shè)置如下：

(1)miRNA序列長度為18-26nt

(2)miRNA參考序列長度為20-24nt

(3)Drosha/Dicer酶切位點(diǎn)最少為3個(gè)

(4)miRNA在參考序列上最大拷貝數(shù)為20

(5)miRNA前體允許的最大自由能為200kcal/mol

(6)miRNA和miRNA*之間最大空格數(shù)為35

(7)miRNA和miRNA*之間最小配對數(shù)為14

(8)miRNA and miRNA*之間最大凸環(huán)為4。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。