本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的探針組合、液相芯片、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，轉(zhuǎn)基因玉米是目前全球最主要的轉(zhuǎn)基因糧食作物之一。根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(ISAAA)資料顯示，從1996年到2015年的20年期間全球轉(zhuǎn)基因作物累計種植面積達到空前的20億公頃，相當于中國大陸總面積(9.56億公頃)或美國總面積(9.37億公頃)的2倍，其中轉(zhuǎn)基因玉米占了30％。轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物在全球市場的大量出現(xiàn)，在其環(huán)境和食品安全問題尚未完全確定的情況下，中國、歐盟等國家和組織要求對其進行標識。因此，快速、準確、靈敏和高通量的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)是非常主要的。目前，在基因水平上檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的方法已經(jīng)有很多，主要包括PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))技術(shù)和基因芯片技術(shù)。但由于轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種類多、數(shù)量大，很多作為加工原料引進，經(jīng)過處理后，轉(zhuǎn)基因成分可能會降解，所以使檢測難度變大，且現(xiàn)有的檢測試劑盒單次檢測能夠檢測出的轉(zhuǎn)基因成分類別少。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的探針組合，此探針組合可用于快速準確的檢測出轉(zhuǎn)基因玉米中的多種轉(zhuǎn)基因成分，其具有特異性好，靈敏度高，通量大、結(jié)果可靠等特點。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的液相芯片，其由上述探針組合分別與熒光編碼微球偶聯(lián)制成，此液相芯片可用于快速準確的檢測出轉(zhuǎn)基因玉米中的多種轉(zhuǎn)基因成分，其具有特異性好，靈敏度高，通量大、結(jié)果可靠等特點。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒，此試劑盒包括上述液相芯片，此試劑盒快速準確的檢測出轉(zhuǎn)基因玉米中的多種轉(zhuǎn)基因成分，具有特異性好，靈敏度高，通量大、結(jié)果可靠等特點。

本發(fā)明的第四目的在于提供另一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒，此試劑盒快速準確的檢測出轉(zhuǎn)基因玉米中的多種轉(zhuǎn)基因成分，具有特異性好，靈敏度高，通量大、結(jié)果可靠等特點。

本發(fā)明的第五目的在于提供上述用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒在玉米轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。

一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的探針組合，其包括5’端標記C₁₂分子臂和氨基修飾的陽性探針和檢測探針，陽性探針的堿基序列為SEQ ID NO.33所示，且檢測探針的堿基序列為選自SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列的中的任一種；或陽性探針的堿基序列為SEQ ID NO.33所示序列的反向互補序列，檢測探針的堿基序列為選自SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列的中的任一種的反向互補序列。

一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的液相芯片，其由上述的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的探針組合分別與羥基化的熒光編碼微球偶聯(lián)混合制成。

一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒，其包括上述的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的液相芯片。

一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒，其包括對照組和檢測組，檢測組包括第1-10檢測組中的至少一個，對照組包括正向引物、反向引物以及5’端帶有C12分子臂和氨基修飾標記的陽性探針，每個檢測組合均包括正向引物、反向引物以及5’端帶有C12分子臂和氨基修飾標記的檢測探針，對照組的正向引物和反向引物其中之一和每個檢測組的正向引物和反向引物其中之一的5’端帶有生物素標記；

其中，第1-10檢測組的正向引物和對照組的正向引物的堿基序列分別如SEQ ID NO.1-11所示，第1-10檢測組的反向引物和對照組的反向引物的堿基序列分別如SEQ ID NO.12-22所示；

當?shù)?-10檢測組的反向引物和對照組的反向引物的5’端帶有生物素標記時，第1-10檢測組和對照組的檢測探針的堿基序列分別如SEQ ID NO.23-33所示；

當?shù)?-10檢測組的正向引物和對照組的正向引物的5’端帶有生物素標記時，第1-10檢測組和對照組的檢測探針的堿基序列分別為SEQ ID NO.23-33所示序列的反向互補序列。

上述所述的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒在玉米轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的探針組合、液相芯片、試劑盒及其應(yīng)用有益效果是：本發(fā)明提供的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的探針組合包括5’端標記C12分子臂和氨基修飾的陽性探針和檢測探針，陽性探針的堿基序列為SEQ ID NO.33所示，且檢測探針的堿基序列為選自SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列的中的任一種?；蛘哧栃蕴结樀膲A基序列為SEQ ID NO.33所示序列的反向互補序列，檢測探針的堿基序列為選自SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列的中的任一種的反向互補序列。由于SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示的檢測探針的序列針對轉(zhuǎn)基因玉米常見的轉(zhuǎn)基因成分Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’進行特異性設(shè)計，上述5’端標記C12分子臂和氨基修飾的各探針能夠與熒光編碼微球偶聯(lián)混合后，得到液相芯片，其與多重PCR擴增產(chǎn)物特異性結(jié)合，通過液相芯片的檢測方法，可檢測出樣品中是否含有上述轉(zhuǎn)基因成分。其中，陽性探針針對性檢測的玉米內(nèi)源基因Ivr1，作為陽性對照，以使檢測結(jié)果更可靠，避免假陽性結(jié)果出現(xiàn)?？傊景l(fā)明的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的探針組合具有靈敏度高、特異性強、單次可檢指標多的特點，其對種子站、農(nóng)科院所和邊境口岸對轉(zhuǎn)基因玉米檢測具有重要作用。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例5的檢測結(jié)果；

圖2為本發(fā)明實施例6的檢測結(jié)果；

圖3為本發(fā)明實施例7的檢測結(jié)果；

圖4為本發(fā)明實施例8的檢測結(jié)果。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明實施例的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的探針組合、液相芯片、試劑盒及其應(yīng)用進行具體說明。

液相芯片是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子檢測技術(shù)平臺。迄今為止十年時間，全球已有數(shù)百套基于xMAP技術(shù)的檢測平臺用于免疫學、蛋白質(zhì)、核酸檢測、基因研究等領(lǐng)域，該技術(shù)已成為一種新的蛋白質(zhì)組學和基因組學研究工具，也是最早通過美國食品與藥物管理局(FDA)認證的可用于臨床診斷的生物芯片技術(shù)。該技術(shù)主要通過紅、綠兩束激光分別檢測微球編碼和報告熒光來達到定性和定量的目的，一個反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多達100種不同的生物學反應(yīng)。這使它具有生物芯片的高通量、高集成、微型化、連續(xù)化和自動化等優(yōu)點，還具有液相反應(yīng)的高敏感性、高重復(fù)性、檢測線性范圍寬、反應(yīng)快速等優(yōu)點，并且該方法操作簡便、快捷、樣品用量少。

基于此技術(shù)，發(fā)明人針對轉(zhuǎn)基因玉米常見的轉(zhuǎn)基因成分如Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’等的保守序列以及玉米內(nèi)源基因Ivr1的保守序列設(shè)進行計，得到了檢測上述基因成分的11種探針。對于該11種探針形成的探針組合具體說明如下。

一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的探針組合，其包括5’端標記C₁₂分子臂和氨基修飾的陽性探針和檢測探針，陽性探針的堿基序列為SEQ ID NO.33所示，且檢測探針的堿基序列為選自SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列的中的任一種；或陽性探針的堿基序列為SEQ ID NO.33所示序列的反向互補序列，檢測探針的堿基序列為選自SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列的中的任一種的反向互補序列。

上述探針的5’端標記C₁₂分子臂和氨基修飾，它們可分別與不同的熒光編碼微球偶聯(lián)、混合后制成液相芯片，進而可實現(xiàn)對Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’轉(zhuǎn)基因成分的液相芯片檢測。且在檢測過程中，具有上述堿基序列的各探針之間不發(fā)生非特異性結(jié)合，確保探針能夠與其對應(yīng)的目標序列(對應(yīng)的基因或?qū)?yīng)基因的PCR產(chǎn)物)進行特異性結(jié)合，檢測結(jié)果更加準確可靠，有效地避免假陽性結(jié)果出現(xiàn)。且本發(fā)明提供的探針組合為采用液相芯片檢測技術(shù)來實現(xiàn)對玉米轉(zhuǎn)基因成分Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’的快速、簡便、特異性強、靈敏度高等的檢測提供了支持。

優(yōu)選地，探針組合還包括5’端標記C₁₂分子臂和氨基修飾的陰性探針，陰性探針的堿基序列如SEQ ID NO.34所示。具有如SEQ ID NO.34所示陰性探針在檢測的過程不與任何PCR擴增的產(chǎn)物進行結(jié)合，能夠起到良好的陰性對照效果，進一步避免假陽性結(jié)果的發(fā)生，提高檢測結(jié)果的可靠性。

一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的液相芯片，其由上述任一項的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的探針組合分別與羥基化的熒光編碼微球偶聯(lián)混合制成。

優(yōu)選地，在偶聯(lián)的過程中，按0.1nmol用量的檢測探針對應(yīng)1×10⁵個羥基化的熒光編碼微球進行偶聯(lián)?？墒沟门悸?lián)效率更高，有利于節(jié)約資源和降低成本。

一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒，其包括上述的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的液相芯片。

本發(fā)明的另一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒，其包括對照組和檢測組，檢測組包括第1-10檢測組中的至少一個，對照組包括正向引物、反向引物以及5’端帶有C12分子臂和氨基修飾標記的陽性探針，每個檢測組合均包括正向引物、反向引物以及5’端帶有C12分子臂和氨基修飾標記的檢測探針，對照組的正向引物和反向引物其中之一和每個檢測組的正向引物和反向引物其中之一的5’端帶有生物素標記；

其中，第1-10檢測組的正向引物和對照組的正向引物的堿基序列分別如SEQ ID NO.1-11所示，第1-10檢測組的反向引物和對照組的反向引物的堿基序列分別如SEQ ID NO.12-22所示。需要說明的是，探針需要與帶有生物素標記的引物所擴增出的單鏈DNA進行特異性結(jié)合，進行實現(xiàn)檢出目的。

因此，當?shù)?-10檢測組的反向引物和對照組的反向引物的5’端帶有生物素標記時，第1-10檢測組和對照組的檢測探針的堿基序列分別如SEQ ID NO.23-33所示；

當?shù)?-10檢測組的正向引物和對照組的正向引物的5’端帶有生物素標記時，第1-10檢測組和對照組的檢測探針的堿基序列分別為SEQ ID NO.23-33所示序列的反向互補序列。

此外，發(fā)明人在上述探針設(shè)計的基礎(chǔ)上，還針對轉(zhuǎn)基因玉米常見的轉(zhuǎn)基因成分如Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’等的保守序列以及玉米內(nèi)源基因Ivr1進行了引物設(shè)計，得到了檢測上述可同時擴增上述基因的11重PCR引物。以確保其在進行11重PCR時能夠最大程度地避免了非特異性擴增，且通過非對稱擴增技術(shù)進行非對稱PCR，確保擴增出的單鏈DNA鏈能夠有效地和對應(yīng)的檢測探針進行特異性結(jié)合，使得檢測結(jié)果更加準確可靠，避免假陽性結(jié)果出現(xiàn)。引物對和檢測探針所其對應(yīng)的基因檢測成分的類別見實施例。

優(yōu)選地，該試劑盒還包括報告分子，報告分子為鏈霉親和素-藻紅蛋白。鏈霉親和素-藻紅蛋白能夠和生物素標記的引物所擴增出的單鏈DNA鏈結(jié)合，在相應(yīng)激發(fā)光的作用下產(chǎn)生熒光信號，實現(xiàn)檢出目的。

優(yōu)選地，試劑盒還包括輔料組合，輔料組合為選自dNTP、TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液中的一種或多種。

上述的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒在玉米轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用。

進一步地，用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒在玉米轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用，其包括：用正向引物和反向引物進行多重非對稱PCR，在PCR反應(yīng)體系中，帶有生物素標記的正向引物與未帶有生物素標記的反向引物的摩爾比為1.2-1.8:1或帶有生物素標記的反向引物與未帶有生物素標記的正向引物的摩爾比為1.2-1.8:1。也就是說，在進行多重非對稱PCR的過程中，帶有生物素標記的引物與未帶有生物素標記的引物的摩爾比為1.2-1.8:1，以使擴增出的單鏈DNA具有生物素標記，便于與報告分子結(jié)合。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述。

實施例1

本實施例提供的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的探針組合，其包括5’端標記C12分子臂和氨基修飾的陽性探針和檢測探針。陽性探針的堿基序列為SEQ ID NO.33所示，且檢測探針的堿基序列分別為SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列。

其中，陽性探針所檢測的基因成分為玉米轉(zhuǎn)化酶I基因(Irv1)，為內(nèi)參基因，作為陽性對照。

檢測探針的5’端也標記C12分子臂和氨基修飾，用于與熒光編碼微球偶聯(lián)。檢測探針共10個，分別是第1-10檢測探針，其堿基序列SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.32所示序列。

其中，堿基序列如SEQ ID NO.23所示的第1檢測探針用于檢測草丁膦乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶基因(Pat)。

堿基序列如SEQ ID NO.24所示的第2檢測探針用于檢測草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(Bar)。

堿基序列如SEQ ID NO.25所示的第3檢測探針用于檢測蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白cry1A(b)基因(Cry1Ab)。

堿基序列如SEQ ID NO.26所示的第4檢測探針用于檢測蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白cry1A(c)基因(Cry1Ac)。

堿基序列如SEQ ID NO.27所示的第5檢測探針用于檢測蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白cry105基因(Cry105)。

堿基序列如SEQ ID NO.28所示的第6檢測探針用于檢測莽草酸羥基乙酰轉(zhuǎn)移酶P0基因(EPSPS-P0)。

堿基序列如SEQ ID NO.29所示的第7檢測探針用于檢測莽草酸羥基乙酰轉(zhuǎn)移酶P2基因(EPSPS-P2)。

堿基序列如SEQ ID NO.30所示的第8檢測探針用于檢測花椰菜花葉病毒35S啟動子(P35S)。

堿基序列如SEQ ID NO.31所示的第9檢測探針用于檢測花椰菜花葉病毒35S終止子(T35S)。

堿基序列如SEQ ID NO.32所示的第10檢測探針用于檢測堿基序列胭脂堿合成酶基因終止子(Nos-3’)。

由于上述探針的5’端標記C12分子臂和氨基修飾，使得它們可分別與不同的熒光編碼微球偶聯(lián)、混合后制成液相芯片，進而為實現(xiàn)對Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’轉(zhuǎn)基因成分的液相芯片檢測提供了支持。

且在檢測過程中，具有上述堿基序列的各探針之間不發(fā)生非特異性結(jié)合，確保探針能夠與其對應(yīng)的目標序列(對應(yīng)的基因或?qū)?yīng)基因的PCR產(chǎn)物)進行特異性結(jié)合，檢測結(jié)果更加準確可靠，有效地避免假陽性結(jié)果出現(xiàn)。

因此，本發(fā)明提供的探針組合為采用液相芯片檢測技術(shù)來實現(xiàn)對玉米轉(zhuǎn)基因成分Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’的快速、簡便、特異性強、靈敏度高等的檢測提供了支持。

總之，上述所述的任意一種探針組合均能夠?qū)崿F(xiàn)對玉米轉(zhuǎn)基因成分的液相芯片檢測，且在檢測過程中，各探針之間不發(fā)生非特異性結(jié)合，確保探針能夠與其對應(yīng)的目標序列進行特異性結(jié)合，使得檢測結(jié)果更加準確可靠，有效地避免假陽性結(jié)果出現(xiàn)。

實施例2

本發(fā)明提供的用于用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的探針組合同實施例1，但不同的本發(fā)明的探針組合還包括5’端標記C₁₂分子臂和氨基修飾的陰性探針，陰性探針的堿基序列如SEQ ID NO.34所示。本發(fā)明提供的用于用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的探針組合不僅具有與同實施例1相同的效果。還有其他的效果體現(xiàn)在，具有如SEQ ID NO.34所示陰性探針在檢測的過程不與任何PCR擴增的產(chǎn)物進行結(jié)合，能夠起到良好的陰性對照效果，進一步避免假陽性結(jié)果的發(fā)生，提高檢測結(jié)果的可靠性。

實施例3

本實施例提供的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的液相芯片，該液相芯片由實施例1所述的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的探針組合(即陽性探針和第1-10檢測探針)分別與熒光編碼微球偶聯(lián)制成。以下對于偶聯(lián)的步驟作具體說明。但本發(fā)明的液相芯片并不限于采用以下所述的偶聯(lián)方法制成，也可以是由其他的偶聯(lián)方法制得，只要是采用了實施例1所述的探針組合的任意一種組合與熒光編碼微球結(jié)合，實現(xiàn)對玉米轉(zhuǎn)基因成分的液相芯片檢測即落入本發(fā)明的保護范圍。本實施例的可通過如下偶聯(lián)方法制成。

1制備偶聯(lián)體系：取40μl(微球總數(shù)量為1×10⁵個)羥基化修飾的熒光編碼微球(微球，美國Luminex公司)，12000rpm離心2min后棄上清，在沉淀中加入5μl的0.1M、pH值4.5的MES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸]溶液，混勻，得到5μl的偶聯(lián)體系(微球濃度為2×10⁴個/μl，微球總數(shù)量為1×10⁵個)。

2將陽性探針稀釋至0.1mM，往偶聯(lián)體系中加入2μl的陽性探針(共0.2nmol的陽性探針)，混勻。

3往偶聯(lián)體系中加入2.5μl EDC(濃度為10mg/ml，二氯乙烷)，混勻，避光反應(yīng)30min。

4往偶聯(lián)體系中再次加入2.5μl EDC(10mg/ml)，混勻，避光反應(yīng)30min。

5往偶聯(lián)體系中加入0.2ml 0.02％的Tween-20，離心12000rpm、1min，棄上清。

6往偶聯(lián)體系中加入0.2ml 0.1％的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液，離心12000rpm、1min，棄上清。

7加入10μl 1×TE緩沖液(pH 8.0)，混勻微球，得到偶聯(lián)有陽性探針的熒光編碼微球的微球儲備液，于4℃避光保存。

8按1-7的方法，將第1-10檢測探針分別偶聯(lián)不同的熒光編碼微球，分別得到10種微球儲備液。

9將上述得到11種微球儲備液混合，用1.5×TMAC溶液(組成的物質(zhì)終濃度如下：4.5M的TMAC(四甲基氯化氨)、質(zhì)量體積比0.15％的十二烷基肌氨酸鈉、75mM pH 8.0的Tris-HCl和pH 8.0的6mM EDTA)稀釋至每種熒光編碼微球的工作濃度為100個/μl，得到微球檢測液即液相芯片。

通過采用液相芯片檢測技術(shù)，本實施例的液相芯片可用于快速準確的檢測出轉(zhuǎn)基因玉米中的轉(zhuǎn)基因成分Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’，其具有特異性好，靈敏度高，通量大、結(jié)果可靠等特點。

實施例4

本實施例提供的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒，其包括上述實施例3所述的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的液相芯片。通過采用液相芯片檢測技術(shù)，本實施例的試劑盒快速準確的檢測出轉(zhuǎn)基因玉米中的轉(zhuǎn)基因成分Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’，其具有特異性好，靈敏度高，通量大、結(jié)果可靠等特點。

實施例5

本實施例提供了另一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒，該試劑盒與實施例4的試劑盒稍有不同。本實施例的試劑盒還包括與探針檢測配套的用于多重非對稱PCR擴增的引物。具體如下。

本實施例提供的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒包括對照組和檢測組，檢測組包括第1-10檢測組。對照組包括正向引物、反向引物以及5’端帶有C12分子臂和氨基修飾標記的陽性探針。每個檢測組合均包括正向引物、反向引物以及5’端帶有C12分子臂和氨基修飾標記的檢測探針。第1-10檢測組的反向引物和對照組的反向引物的5’端帶有生物素標記。其中，第1-10檢測組用于檢測玉米的外源轉(zhuǎn)基因成分，對照組合用于檢測玉米內(nèi)源基因Irv1，第1-10檢測組和對照組的引物和探針的堿基序列(5’-3’)如下。

第1檢測組合，用于檢測Pat(草丁膦乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶基因)：

正向引物為：TGATATGGCCGCGGTTTGTGAT(堿基序列如SEQ ID NO.1所示)；

反向引物為：Biotin-GGCCCAGCGTAAGCAATACC(堿基序列如SEQ ID NO.12所示)；

檢測探針(Pat探針)為：

NH₂-C₁₂-GCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTTGTGGCTGGTATTGCTT(堿基序列如SEQ ID NO.23所示)。

第2檢測組合，用于檢測Bar(草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)：

正向引物為：GGGGATCTACCATGAGCCCA(堿基序列如SEQ ID NO.2所示)；

反向引物為：Biotin-GGCTCGGTACGGAAGTTGAC(堿基序列如SEQ ID NO.13所示)；

檢測探針(Bar探針)為：

NH₂-C₁₂-ACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATCGTCAACCACTACATCGAGACAAGCAC(堿基序列如SEQ ID NO.24所示)。

第3檢測組合，用于檢測Cry1Ab(蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白cry1A(b)基因)：

正向引物為：CGACATCTCCTTGTCCTTGAC(堿基序列如SEQ ID NO.3所示)；

反向引物為：Biotin-CTCAATTTGCACCAGGAATGC(堿基序列如SEQ ID NO.14所示)；

檢測探針(Cry1Ab探針)為：

NH₂-C₁₂-GCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCTTTGGTCCATCTCAATG(堿基序列如SEQ ID NO.25所示)。

第4檢測組合，用于檢測Cry1Ac(蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白cry1A(c)基因)：

正向引物為：GTTAGACTCAACAGCAGTGGA(堿基序列如SEQ ID NO.4所示)；

反向引物為：Biotin-GAGAAGATGGATGAATTACCCCA(堿基序列如SEQ ID NO.15所示)；

檢測探針(Cry1Ac探針)為：

NH₂-C₁₂-TCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGGTATGCTTCTGTGACCCCTATTCACCTCAACGT(堿基序列如SEQ ID NO.26所示)。

第5檢測組合，用于檢測Cry105(蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白cry105基因)：

正向引物為：ACTCGATCAGGTACAATGCCA(堿基序列如SEQ ID NO.5所示)；

反向引物為：Biotin-GCATCTGTTAGGCTCTCCAC(堿基序列如SEQ ID NO.16所示)；

檢測探針(Cry105探針)為：

NH₂-C₁₂-GACCGTGAATGTCCCAGGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTCTGCCCAATCTCCCATTG(堿基序列如SEQ ID NO.27所示)。

第6檢測組合，用于檢測EPSPS-P0(莽草酸羥基乙酰轉(zhuǎn)移酶P0基因)：

正向引物為：GCGCGATCATACGGAAAAGAT(堿基序列如SEQ ID NO.6所示)；

反向引物為：Biotin-TCGATGACTTGGCCGGTGAG(堿基序列如SEQ ID NO.17所示)；

檢測探針(EPSPS-P0探針)為：

NH₂-C₁₂-ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCCGCCTGGAAGGCCGCGGC(堿基序列如SEQ ID NO.28所示)。

第7檢測組合，用于檢測EPSPS-P2(莽草酸羥基乙酰轉(zhuǎn)移酶P2基因)：

正向引物為：TCGTGACCACACTGAAAAGAT(堿基序列如SEQ ID NO.7所示)；

反向引物為：Biotin-TCAATCACTTGACCGGTGAG(堿基序列如SEQ ID NO.18所示)；

檢測探針(EPSPS-P2探針)為：

NH₂-C₁₂-ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCCGCCTGGAAGGCCGCGGC(堿基序列如SEQ ID NO.29所示)。

第8檢測組合，用于檢測P35S(花椰菜花葉病毒35S啟動子)：

正向引物為：AAGACGTTCCAACCACGTCTTCAA(堿基序列如SEQ ID NO.8所示)；

反向引物為：Biotin-GAGGAAGGGTCTTGCGAAGG(堿基序列如SEQ ID NO.19所示)；

檢測探針(P35S探針)為：

NH₂-C₁₂-CAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCAC(堿基序列如SEQ ID NO.30所示)

第9檢測組合，用于檢測T35S(花椰菜花葉病毒35S終止子)：

正向引物為：TGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAA(堿基序列如SEQ ID NO.9所示)；

反向引物為：Biotin-CTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGA(堿基序列如SEQ ID NO.20所示)；

檢測探針(T35S探針)為：

NH₂-C₁₂-CTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAATTTCT(堿基序列如SEQ ID NO.31所示)。

第10檢測組合，用于檢測Nos-3’(堿基序列胭脂堿合成酶基因終止子)：

正向引物為：TGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT(堿基序列如SEQ ID NO.10所示)；

反向引物為：Biotin-GCGCGCGATAATTTATCCTAGTTT(堿基序列如SEQ ID NO.21所示)；

檢測探針(Nos-3’探針)為：

NH₂-C₁₂-TTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGC(堿基序列如SEQ ID NO.32所示)。

對照組，用于檢測Ivr1(玉米轉(zhuǎn)化酶I基因，為玉米內(nèi)參基因，可作為陽性對照)：

正向引物為：ACTAGTGCGACCCATATTCCAG(堿基序列如SEQ ID NO.11所示)；

反向引物為：Biotin-AAGCGGTAAGGCCAACAGTT(堿基序列如SEQ ID NO.22所示)；

陽性探針(Ivr1探針)為：

NH₂-C₁₂-ACTGCATGATGCAACAGGGGCTTGCCAGCTTGATGGCGTGTCCGTCCCTGATGCTGCAG(堿基序列如SEQ ID NO.33所示)。

本實施例以檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11為例進行說明檢測方法。采用固相亞磷酰胺三酯法合成得到上述引物和探針，當然合成引物和探針的方法不限于此，也可是由其他的方法合成。采用本實施例提供的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒檢測玉米轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法如下。

1提取待測樣品的基因組DNA

按DNA提取試劑盒(Nu Clean Plant Gen DNA Kit，CW2634S，北京康為世紀生物科技有限公司)的操作說明提取轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11的基因組DNA，按每30mg初始樣本經(jīng)抽提后用60μl ddH₂O溶解基因組DNA，并用紫外分光光度計將DNA溶液稀釋至同一質(zhì)量濃度(100ng/μl)，作為DNA模板。

2多重非對稱PCR

用本實施例提供的轉(zhuǎn)基因液相芯片檢測試劑盒中的各檢測組合中的正向引物和反向引物對待測樣品DNA模板進行多重非對稱PC擴增。正向引物和反向引物提前稀釋至工作濃度20μM。反應(yīng)體系為：10×PCR反應(yīng)緩沖液(含mg²⁺)5μl，dNTP(2.5mM each)4μl，正向引物(20μM)各0.5μl，反向引物(20μM)各0.6μl，EX-Taq DNA聚合酶(5U/μl、Takara)0.5μl，DNA模板(100ng/μl)1μl，補ddH2O至總體積為50μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，95℃變性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s、共35個循環(huán)，72℃延伸10min，最后4℃保存。最后得到多重非對稱PCR產(chǎn)物。

3微球與探針偶聯(lián)

3.1制備偶聯(lián)體系：取40μl(總微球數(shù)為1×10⁵個)羥基化修飾的熒光編碼微球(微球，美國Luminex公司)，12000rpm離心2min后棄上清，在沉淀中加入5μl的0.1M、pH值4.5的MES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸]溶液，混勻，得到5μl的偶聯(lián)體系，其中，微球濃度為2×10⁴個/μl。

3.2將對照組的陽性探針稀釋至0.1mM，往偶聯(lián)體系中加入1μl對照組的陽性探針(共0.1nm的陽性探針)，混勻。

3.3往偶聯(lián)體系中加入2.5μl EDC(濃度為10mg/ml，二氯乙烷)，混勻，避光反應(yīng)30min。

3.4往偶聯(lián)體系中再次加入2.5μl EDC(10mg/ml)，混勻，避光反應(yīng)30min。

3.5往偶聯(lián)體系中加入0.2ml 0.02％的Tween-20，離心12000rpm、1min，棄上清。

3.6往偶聯(lián)體系中加入0.2ml 0.1％的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液，離心12000rpm、1min，棄上清。

3.7加入10μl 1×TE緩沖液(pH 8.0)，混勻微球，得到偶聯(lián)有陽性探針的熒光編碼微球的陽性微球儲備液，于4℃避光保存。

3.8按3.1-3.7的方法，將第1-10檢測組的檢測探針以及陰性探針(Negative Probe)分別偶聯(lián)不同的熒光編碼微球，分別得到12種微球儲備液。其中，陰性探針為：

NH₂-C₁₂-GTTAATGCGCGATTGTCACCACACGTTGCGAGTTATGTTGCTGCGGAGATGG(如SEQ ID NO.34所示)。

3.9將上述得到12中微球儲備液混合，用1.5×TMAC溶液((組成的物質(zhì)終濃度如下：4.5M的TMAC(四甲基氯化氨)、質(zhì)量體積比0.15％的十二烷基肌氨酸鈉、75mM pH 8.0的Tris-HCl和pH 8.0的6mM EDTA))稀釋至每種熒光編碼微球的工作濃度為100個/μl，得到微球檢測液即液相芯片。

4雜交

4.1雜交反應(yīng)體系為：33μl微球檢測液，7μl pH8.0的l×TE緩沖液，10μl多重非對稱PCR產(chǎn)物。雜交程序為：95℃5min，55℃15min，循環(huán)1次。

4.2雜交結(jié)束后，加入25μl含鏈霉親和素R-藻紅蛋白的報告溶液，混勻，于55℃下孵育5min。其中，報告溶液為用25μl 1×TMAC溶液(物質(zhì)組成的終濃度如下：3M的TMAC、質(zhì)量體積比0.1％的十二烷基肌氨酸鈉、50mM pH 8.0的Tris-HCl、4mM pH 8.0的EDTA)稀釋0.04μg鏈霉親和素R-藻紅蛋白得到。

5檢測

上機檢測，使用Luminex液相芯片檢測儀，參數(shù)設(shè)置為Count100，儀器讀出MFI(Median Fluorescence Intensity，平均熒光強度)，數(shù)據(jù)收集軟件對檢測的熒光強度比值分析判斷。判斷標準是：探針熒光信號值與相應(yīng)陰性對照比值≥3判讀為陽性，信號值與相應(yīng)陰性對照比值≤3為陰性。本實施例的檢測結(jié)果如圖1和表1所示。

由圖1(橫坐標為偶聯(lián)相應(yīng)探針的微球、縱坐標為相應(yīng)微球的平均熒光強度，圖中NC代表陰性對照)和表1可知，本實施例的待測樣品轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11含有Pat、Cry1Ab、P35S以及Nos-3’等轉(zhuǎn)基因成分，檢測結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。

另外，需要說明的是本實施例中所用的報告分子、微球以及dNTP、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺和PCR緩沖液均為市購。

實施例6

本實施例提供的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒與實施例5基本相同。不同的是，本實施例的試劑盒還包括陰性探針。

陰性探針為：

NH₂-C₁₂-GTTAATGCGCGATTGTCACCACACGTTGCGAGTTATGTTGCTGCGGAGATGG(其堿基序列如SEQ ID NO.34所示)。

采用本實施例提供的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系BT176，檢測方法與實施例5基本一致。不同的是：在多重非對稱PCR中，反應(yīng)引物與正向引物的用量比為1.8:1，即每50μl的反應(yīng)體系中，各檢測組合中的反向引物(20μM)的加入量為0.9μl、正向引物(20μM)的加入量為0.5μl。檢測結(jié)果如圖2和表1所示。

由圖2和表1可知，本實施例的待測樣品轉(zhuǎn)基因玉米品系BT176含有Bar、P35S以及T35S等轉(zhuǎn)基因成分。

實施例7

本實施例提供的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒與實施例6基本相同，不同的是，本實施例的試劑盒還包括報告分子以及輔料組合。

報告分子為鏈霉親和素-藻紅蛋白。

輔料組合為dNTP、Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液。當然，在其他的實施例中，輔料組合可以是dNTP、Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液中的一種或任意兩種的組合。

采用本實施例提供的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系MON88017，檢測方法與同實施例5基本相同。檢測結(jié)果如圖3和表1所示。

由圖3和表1可知，本實施例的待測樣品轉(zhuǎn)基因玉米品系MON88017含有EPSPS-P2、P35S、Nos-3'等轉(zhuǎn)基因成分。

實施例8

本實施例提供的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒包括對照組和檢測組，檢測組包括第1-10檢測組。對照組包括正向引物、反向引物以及5’端帶有C12分子臂和氨基修飾標記的陽性探針。每個檢測組合均包括正向引物、反向引物以及5’端帶有C12分子臂和氨基修飾標記的檢測探針。與實施例5不同的是，本實施例中，第1-10檢測組的正向引物和對照組的正向引物的5’端帶有生物素標記。

第1-10檢測組的正向引物和對照組的正向引物的堿基序列和第1-10檢測組的反向引物和對照組的反向引物的堿基序列同實施例5。但本實施例中，第1-10檢測組和對照組的檢測探針的堿基序列分別為SEQ ID NO.23-33所示序列的反向互補序列。

采用本實施例的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系MON89034。檢測方法與實施例5基本相同，不同的是，在多重非對稱PCR時，各檢測組合所用的正向引物與反向引物的用量比為1.2:1，即每50μl的反應(yīng)體系中，各檢測組合中的正向引物(20μM)的加入量為0.6μl、反向引物(20μM)的加入量為0.5μl。檢測結(jié)果如圖4和表1所示。

表1.實施例5-8中待測樣品的檢測結(jié)果

由圖4和表1可知，本實施例的待測樣品轉(zhuǎn)基因玉米品系MON89034含有Cry105、P35S、Nos-3'等轉(zhuǎn)基因成分。

綜上所述，本發(fā)明實施例的試劑盒通過針對轉(zhuǎn)基因玉米常見的轉(zhuǎn)基因成分Pat、Bar、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry105、EPSPS-P0、EPSPS-P2、P35S、T35S以及Nos-3’等10種外源基因成分以及玉米內(nèi)源基因Ivr1設(shè)計出可快速檢測的多重非對稱PCR的引物組合和以及用于液相芯片檢測的探針組合，且設(shè)計出的11重PCR引物最大程度地避免了非特異性擴增，檢測探針能夠與PCR擴增產(chǎn)物的單鏈DNA進行特異性結(jié)合，避免假陽性結(jié)果，具有靈敏度高、特異性強、可檢指標多的特點。

總之，本發(fā)明提供的用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的探針組合、液相芯片以及試劑盒可以快速準確的判斷待檢玉米產(chǎn)品中是否含有上述轉(zhuǎn)基因序列，操作簡便，特異性好，靈敏度高，檢測通量大，對種子站、農(nóng)科院所和邊境口岸對轉(zhuǎn)基因玉米檢測具有重要作用。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。