本發(fā)明涉及分子生物學及遺傳育種領(lǐng)域，具體地說，涉及雞胡須性狀的基因型快速鑒定方法。
背景技術(shù)：
：中國是世界上家禽遺傳資源最豐富的國家之一，家雞的羽毛和性狀特征多樣性豐富，常被作為某些品種的特征性狀。雞的胡須是一種在臉頰兩側(cè)以及頷下著生的延長生長的羽毛類型。在我國地方雞種中，惠陽胡須雞、北京油雞、絲羽烏骨雞等均具有胡須性狀。惠陽胡須雞為我國地方優(yōu)良肉用型品種，又被稱為三黃胡須雞、惠州雞、龍門雞、龍崗雞等，額下呈發(fā)達而張開的胡須狀房羽(國家畜禽遺傳資源委員會組編.中國畜禽遺傳資源志地方品種圖冊.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015.2)?；蓐柡氹u體質(zhì)結(jié)實，胸肌發(fā)達，以肉嫩骨細，皮脆味鮮與三黃胡須的外貌馳名中外。雞的胡須性狀同雞的玫瑰冠、豆冠、復冠、絲羽、縷頭、翻毛以及裸頸等性狀一樣，都可直接在外部表型鑒來定品種和用于育種工作。胡須性狀的研究開始于上個世紀初，研究人員通過雜交實驗確定胡須是一種常染色體不完全顯性遺傳的性狀(Davenport,C.B.1906.Inheritanceinpoultry.Washington,DC:CarnegieInstitutionPublication,1906；Serebrovsky,A.S.,Petrov,S.G.1930.Onthecompositionoftheplanofthechromosomesofthedomesticshen.J.Exp.Biol.Russia6:157-179.)。然而雞胡須性狀在基因組上的準確定位和解析最近才報道(Guo,Y.,etal.,AComplexStructuralVariationonChromosome27LeadstotheEctopicExpressionofHOXB8andtheMuffsandBeardPhenotypeinChickens.PLoSGenet,2016.12(6):p.e1006071；郭影.雞胡須性狀的基因定位及功能研究,2016,中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文)。該研究采用全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wideassociationstudy,GWAS)、連鎖分析(Linkageanalysis)、同源一致性(Identitybydescent,IBD)分析、比較基因組雜交芯片(Arraycomparativegenomichybridization,arrayCGH)、全基因組重測序和表達分析等技術(shù)手段來研究引起胡須性狀的致因基因。研究結(jié)果表明胡須性狀是由27號染色體上復雜結(jié)構(gòu)變異(Structuralvariation,SV)導致，此結(jié)構(gòu)變異由位于27號染色體上1.7Mb、3.5Mb以及4.4Mb位置的3個拷貝數(shù)變異(Copynumbervariation,CNV)組成。3個CNV以CNV3、CNV2和CNV1的順序串聯(lián)在一起，并插入CNV1的下游(圖1)。該結(jié)果在其他雞胡須雞群體中(包括北京油雞，揚州胡須雞，波蘭矮腳雞，DutchOwl等)驗證與胡須性狀完全關(guān)聯(lián)。此復雜結(jié)構(gòu)變異區(qū)間內(nèi)共包含七個注釋基因，對七個基因在胡須發(fā)育的不同階段基因的表達情況進行檢測，結(jié)果表明HOXBB基因在下頜皮膚組織中連續(xù)的異位高表達，強烈表明其在胡須性狀發(fā)育過程中具有重要作用。由于雞胡須性狀是由常染色體上一個顯性遺傳基因控制的，從表型上無法區(qū)分純合型胡須基因個體(Mb/Mb)和雜合性胡須基因個體(Mb/mb)，只能通過測交的方式判定，為胡須性狀的選擇帶來不便。雞胡須基因(Mb)的定位與鑒定為雞胡須這一性狀的研究和生產(chǎn)應(yīng)用提供了基礎(chǔ)條件。Guo等(2016)報道了一個鑒定胡須基因型的方法，是利用胡須基因復雜結(jié)構(gòu)中重復的CNV1中出現(xiàn)了一個堿基突變(C→T)，建立了一種基于焦磷酸測序的基因分型方法。然而該方法實驗過程較多，且需要昂貴的焦磷酸測序儀，在實際應(yīng)用中不易推廣應(yīng)用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種雞胡須性狀的基因型快速鑒定方法。本發(fā)明根據(jù)雞胡須基因在基因組上存在CNV的拷貝數(shù)位置變化，用常規(guī)PCR、電泳技術(shù)和PCR產(chǎn)物條帶亮度識別直接鑒定基因型，開發(fā)了一種簡單、快速、準確鑒定雞胡須基因的分型方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明基于胡須基因結(jié)構(gòu)中3個拷貝數(shù)變異(CNV1、CNV2和CNV3)在基因組上位置與非胡須雞不同，提供用于鑒別雞胡須性狀基因型的PCR引物組合，包括：正向引物F1：5'-TGGTTGTGTGCCAAGTAGAG-3'(SEQIDNO.1)；正向引物F2：5'-GCTCTTGCTCTTTTTGGTAA-3'(SEQIDNO.2)；以及反向引物R：5'-CTTTTCGTACTGCGTTGTTA-3'(SEQIDNO.3)。本發(fā)明還提供含有上述引物組合的用于鑒別雞胡須性狀基因型的試劑盒。本發(fā)明還提供雞胡須性狀的基因型快速鑒定方法，包括以下步驟：1)提取待測雞的基因組DNA；2)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用上述引物組合，進行PCR擴增反應(yīng)；3)分析PCR產(chǎn)物。利用電泳技術(shù)對PCR產(chǎn)物進行電泳；然后用ImageJ軟件分析電泳膠圖，計算每個泳道中條帶的亮度及其比值，從而判定待測雞的基因型。其中，所述正向引物F1與所述反向引物R組成一對引物，擴增胡須基因207bp序列；所述正向引物F2與所述反向引物R組成一對引物，擴增非胡須基因296bp序列。PCR反應(yīng)體系以20μl計為：PCR反應(yīng)條件為：95℃5分鐘；95℃30秒，53℃30秒，72℃20秒，共27個循環(huán)；72℃7分鐘。步驟3)分析PCR產(chǎn)物的方法如下：將PCR擴增產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR擴增條帶，并拍照。用ImageJ軟件分析電泳膠圖，計算每個泳道中296bp條帶和207bp條帶的亮度值，并計算207bp條帶亮度值與296bp條帶亮度值的比值P；P值在0.7-0.9之間判定為胡須雞基因純合子，P值在0.2-0.5之間判定為胡須雞雜合子；P值為0，只擴增出296bp條帶，則判定為非胡須雞個體。本發(fā)明所述胡須雞包括惠陽胡須雞、北京油雞、絲羽烏骨雞等。非胡須雞包括白來航雞等。本發(fā)明還提供與雞胡須性狀相關(guān)的特異性分子標記，所述分子標記是位于雞27號染色體上CNV1下游(新增的CNV3與CNV2結(jié)合處，圖2)，大小為207bp的DNA片段，用于擴增所述分子標記的引物如SEQIDNO.1和3所示。對207bp大小的擴增產(chǎn)物進行測序，通過DNAMAN軟件比對，確認其與CNV3與CNV2結(jié)合處的堿基序列一致(圖3)。本發(fā)明還提供所述特異性分子標記在鑒定胡須雞品種中的應(yīng)用。本發(fā)明進一步提供所述特異性分子標記在雞分子標記輔助育種中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種雞胡須基因的基因型分子鑒定方法及應(yīng)用，即采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)和電泳技術(shù)來檢測具有雞胡須基因的純合型、雜合型以及非胡須雞，根據(jù)PCR產(chǎn)物膠圖的條帶數(shù)以及條帶亮度進行雞胡須性狀基因型的快速鑒定，可加快選育具有胡須特征雞種的育種進程，縮短胡須雞育種時間。附圖說明圖1為Readdepth分析確定胡須雞27號染色體存在的CNV及其重排方式。圖2為本發(fā)明實施例2中雞胡須基因分型引物擴增位置。圖3為本發(fā)明雞胡須基因207bp大小的擴增產(chǎn)物測序峰圖及所在位置。圖4為本發(fā)明實施例2中雞胡須基因鑒定PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。圖5為本發(fā)明實施例2中ImageJ軟件計算PCR產(chǎn)物條帶亮度示意圖。圖6為本發(fā)明實施例3中雞胡須基因鑒定PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。圖7為本發(fā)明實施例4中引物的靈敏度分析結(jié)果。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。實施例1測交鑒定胡須雞的基因型及其遺傳規(guī)律來自廣東金種農(nóng)牧科技股份有限公司惠陽胡須雞國家級保種場的10只胡須雞公雞與中國農(nóng)業(yè)大學實驗?zāi)翀龅?50只白來航母雞(均為非胡須雞)，按照1只公雞配15只母雞的方式組建10個家系進行人工授精，每只母雞收集10～15枚種蛋，共計約1800枚種蛋進行孵化。孵化出雛后的F1代雞全部育雛，并飼養(yǎng)至9周齡，觀察胡須性狀，按照家系統(tǒng)計(表1)。除7號和9號胡須雞公雞與白來航雞雜交F1代雞有胡須和無胡須雞個體接近1:1外，其他8只胡須雞公雞與白來航雞的雜交F1代雞全部具有胡須性狀。表1胡須雞與白來航雞雜交F1代胡須性狀統(tǒng)計公雞家系號有胡須無胡須112602145031420415505113061490743468113095858101150測交試驗結(jié)果說明，雞胡須性狀由單基因控制，胡須性狀對非胡須性狀表現(xiàn)完全顯性，除7號和9號公雞是胡須基因雜合型外，其他8只均為胡須基因純合型。實施例2雞胡須基因的基因型鑒定方法的建立1、引物設(shè)計：根據(jù)雞胡須性狀基因復雜結(jié)構(gòu)的3個拷貝數(shù)變異(CNV1、CNV2和CNV3)在基因組上分布的位置，分別下載雞基因組CNV3后端600bp序列、CNV2前端上游600bp序列和CNV2前端600bp序列。采用PrimerPremier5軟件分別設(shè)計3條引物：正向引物F1：5'-TGGTTGTGTGCCAAGTAGAG-3'，正向引物F2：5'-GCTCTTGCTCTTTTTGGTAA-3'，反向引物R：5'-CTTTTCGTACTGCGTTGTTA-3'。引物設(shè)計構(gòu)思如下：本發(fā)明考慮到用最少的引物來鑒定雞胡須基因型。引物設(shè)計原則是引物結(jié)合區(qū)段序列保守、3條引物的預(yù)測退火溫度接近、3條引物構(gòu)成的2個擴增產(chǎn)物長度200-400bp之間且長度相差可以通過電泳明顯區(qū)別。另外，綜合考慮引物GC含量、產(chǎn)物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物末端連續(xù)堿基、正反引物退火溫度等因素，最終通過優(yōu)化比較確定以上3條引物。3條引物在胡須雞和非胡須雞基因組DNA有A和B兩個擴增子(圖2)，A擴增子長度207bp，B擴增子長度296bp。在非胡須雞中，只有B擴增子，產(chǎn)物長度296bp。設(shè)計好的引物由生物工程公司合成，并稀釋至濃度10μmol/L。2、試驗動物：采集實施例1中經(jīng)過測交確定的2只胡須基因純合型個體、2只胡須基因雜合型個體和2只白來航雞(非胡須雞)血液。3、DNA提?。河肈NA提取試劑盒提取雞血液樣品基因組DNA，采用NanoDrop2000超微量分光光度計測定DNA濃度，并用ddH2O稀釋至60～100μg/ml，作為PCR擴增的模板。4、PCR擴增條件優(yōu)化：(1)退火溫度的優(yōu)化以6個胡須雞和非胡須雞的基因組DNA混合樣為模板，PCR體系為20μl，其中2×PCRMix用量10μl，基因組DNA模板1μl，10μmol/L正向引物F10.5μL、10μmol/L正向引物F20.5μL、10μmol/L反向引物R1μL，最后用ddH2O補充至20μL，混勻，即得PCR擴增反應(yīng)體系。PCR擴增的反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，49-58℃范圍內(nèi)設(shè)置8個梯度變化的退火溫度30s，72℃延伸20s，36個循環(huán)；72℃延伸7min；得到梯度PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用2％的瓊脂糖膠電泳，結(jié)果顯示，8個退火溫度條件下均得到207bp和296bp兩個PCR產(chǎn)物條帶，引物條帶均整齊、清晰、無雜帶，說明本發(fā)明的3條引物多重PCR退火溫度范圍較寬，本發(fā)明選擇中間的梯度溫度53℃作為3條引物的優(yōu)化退火溫度。(2)PCR循環(huán)數(shù)的優(yōu)化以6個已知胡須基因基因型個體的DNA作為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為20μL，其中2×PCRMix用量10μl，基因組DNA1μl，10μmol/L正向引物F10.5μL、10μmol/L正向引物F20.5μL、10μmol/L反向引物R1μL，最后用ddH2O補充至20μL，混勻，即得PCR擴增反應(yīng)體系。PCR擴增的反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸20s，25～35個循環(huán)；72℃延伸7min；即得到PCR產(chǎn)物。分別以25、27、29、31、33、35個循環(huán)進行6次PCR擴增。以濃度為2％的瓊脂糖凝膠對以上不同循環(huán)數(shù)PCR產(chǎn)物進行電泳，上樣量為8μL。觀察電泳結(jié)果，非胡須雞只有1個296bp的條帶；純合型和雜合型胡須雞個體均有296bp和207bp2條帶。選擇在296bp條帶亮度一致的情況下，純合型個體207bp條帶比雜合型207bp條帶更亮的膠圖(圖4)，作為優(yōu)化的PCR循環(huán)數(shù)。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在27個循環(huán)的PCR條件下，能夠從207bp的條帶亮度鑒定胡須基因的純合型與雜合型的差別，最終確定PCR的優(yōu)化循環(huán)數(shù)為27。5、電泳條帶亮度分析：應(yīng)用ImageJ軟件打開圖4的圖片文件，分析每個泳道中PCR產(chǎn)物條帶的亮度，通過識別條帶的峰面積計算亮度值(圖5)。然后計算207bp與296bp條帶的亮度的比值P(表2)，確定胡須基因純合型和雜合型的P值范圍。經(jīng)分析，確定純合型個體的P值大于等于0.7，雜合型個體的P值小于0.5。表2PCR產(chǎn)物條帶亮度量化值基因型樣品號296bp條帶亮度207bp條帶亮度P值非胡須157.3-0非胡須255.3-0胡須基因雜合型3142.253.40.38胡須基因雜合型4114.949.50.43胡須基因純合型596.377.00.80胡須基因純合型6103.778.20.75實施例3雞胡須基因的基因型鑒定方法的驗證從中國農(nóng)業(yè)大學實習牧場中的純種惠陽胡須雞、胡須雞與白來航雞雜交F1代、純種白來航雞群體中采集7個胡須基因純合型個體、7個胡須基因雜合型個體和6個非胡須雞個體，共計20個個體的血液樣品。所有血樣隱去基因型信息，隨機編號。按照實施例2建立的方法進行DNA提取、PCR產(chǎn)物獲得、瓊脂糖凝膠電泳、電泳條帶亮度分析，電泳結(jié)果見圖6，條帶亮度識別及比值見表3。泳道4、6、10、13、14、18中只有一條296bp的條帶，直接判定為非胡須雞。泳道1、2、3、15、16、17、19中有296bp和207bp2個條帶，且2個條帶的亮度差別不大，P值均大于等于0.7，因此判定為胡須基因純合型。泳道5、7、8、9、11、12、20中有296bp和207bp2個條帶，且明顯可見207bp條帶亮度比296bp條帶亮度低，P值均小于0.5，因此判定為胡須基因雜合型。表3待測個體PCR產(chǎn)物條帶亮度量化值及基因型判定樣品號296bp條帶亮度207bp條帶亮度P值基因型1135.2118.90.88胡須基因純合型2142.7116.30.82胡須基因純合型3159.1126.80.80胡須基因純合型4284.3－0非胡須基因5167.869.10.41胡須基因雜合型6365.5－0非胡須基因7166.360.00.36胡須基因雜合型8137.758.80.43胡須基因雜合型9183.574.90.41胡須基因雜合型10363.9－0非胡須基因11114.245.60.40胡須基因雜合型12127.349.10.39胡須基因雜合型13297.0－0非胡須基因14228.9－0非胡須基因15149.3106.70.71胡須基因純合型16146.3106.30.73胡須基因純合型17205.4143.80.70胡須基因純合型18222.4－0非胡須基因19182.2140.20.77胡須基因純合型2068.124.70.36胡須基因雜合型結(jié)果可見，條帶亮度的肉眼設(shè)別和軟件識別判定胡須基因的基因型完全一致，與隱去的實際基因型比較發(fā)現(xiàn)，判定準確率達100％。本發(fā)明僅利用3條引物進行單次普通的多重PCR反應(yīng)，就能成功地鑒定胡須雞的純合子、雜合子以及非胡須雞，方法簡單、快速且準確，非常實用于胡須雞外貌性狀的選育和提純。具體優(yōu)點如下：(1)本發(fā)明涉及的雞胡須性狀基因的基因型分子鑒定，能鑒定表型相同情況下純合型和雜合型個體，有效增加選種的準確性；(2)本發(fā)明涉及的分子鑒定不受胡須雞的年齡、性別等限制，可以用于胡須性狀的早期選育，縮短世代間隔，加快胡須雞的育種進程；(3)檢測方法簡單、快速、準確。實施例4引物的靈敏度檢測實驗分別選取非胡須雞、胡須雞雜合子以及胡須雞純合子各1只，提取基因組DNA，將其DNA濃度分別稀釋成100μg/mL、50μg/mL、20μg/mL和10μg/mL，PCR反應(yīng)的擴增程序和擴增產(chǎn)物檢測的方法同實施例2和3，PCR擴增27個循環(huán)。擴增反應(yīng)結(jié)束后，用2％的瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，結(jié)果如圖7所示。1-4泳道分別代表PCR反應(yīng)中DNA濃度依次為100μg/mL、50μg/mL、20μg/mL和10μg/mL，可以看出各基因型中在1和2泳道上產(chǎn)物條帶間的明暗程度最為明顯，而在3和4泳道上雖然可以看到PCR產(chǎn)物條帶，但條帶亮度不夠，不適宜通過明暗程度區(qū)別PCR產(chǎn)物量，給胡須基因的純合型和雜合型的鑒別帶來較大誤差。從圖7來看，盡管DNA濃度范圍在20-100μg/mL都能夠擴增出特征條帶，且3條引物PCR擴增所需的DNA模板濃度范圍較寬，可將最低限固定在20μg/mL。但是結(jié)合本發(fā)明最大的特色，依靠條帶間的明暗程度來鑒定胡須雞的純合型和雜合型，也便于ImageJ軟件亮度值的計算，因此最終將50-100μg/mL的DNA濃度作為本發(fā)明PCR反應(yīng)的模板濃度。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當前第1頁1 2 3