1.一種用于高通量測序檢測藥物基因組SNP變異文庫的構(gòu)建方法,其特征在于:包括如下步驟:
(1)針對目的基因VKORC1、UGT1A1、HLA-A、HLA-B、TPMT、NAT1、NAT2、G6PD、F5、F2、IFNL3、APOE、COMT、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A5、MTFHR、SLCO1B1、DPYD上的總共85種遺傳性SNP位點設(shè)計一基本擴增引物組,該基本擴增引物組的正向引物和反向引物的5’端設(shè)有額外的2~5個T,且該2~5個T的靠近3’端的第一個T具有PNA修飾,同時該基本擴增引物組的Tm值相差不超過1℃,具體的,所述基本擴增引物組包括VK1-F、VK1-R、UG1-F、UG1-R、HLAA-F、HLAA-R、HLAB-1-F、HLAB-1-R、HLAB-2-F、HLAB-2-R、TP1-F、TP1-R、TP2-F、TP2-R、TP3-F、TP3-R、TP4-F、TP4-R、TP5-F、TP5-R、NAT1-1-F、NAT1-1-R、NAT1-2-F、NAT1-2-R、NAT1-3-F、NAT1-3-R、NAT2-1-F、NAT2-1-R、NAT2-2-F、NAT2-2-R、NAT2-3-F、NAT2-3-R、NAT2-4-F、NAT2-4-R、G6PD-1-F、G6PD-1-R、G6PD-2-F、G6PD-2-R、G6PD-3-F、G6PD-3-R、G6PD-4-F、G6PD-4-R、G6PD-5-F、G6PD-5-R、F5-F、F5-R、F2-F、F2-R、IFNL3-F、IFNL3-R、APOE-1-F、APOE-1-R、APOE-2-F、APOE-2-R、COMT-F、COMT-R、CY12-1-F、CY12-1-R、CY12-2-F、CY12-2-R、CY12-3-F、CY12-3-R、CY12-4-F、CY12-4-R、CY2B6-1-F、CY2B6-1-R、CY2B6-2-F、CY2B6-2-R、CY2B6-3-F、CY2B6-3-R、CY219-1-F、CY219-1-R、CY219-2-F、CY219-2-R、CY219-3-F、CY219-3-R、CY219-4-F、CY219-4-R、CY219-5-F、CY219-5-R、CY219-6-F、CY219-6-R、CY219-7-F、CY219-7-R、CY29-1-F、CY29-1-R、CY29-2-F、CY29-2-R、CY26-1-F、CY26-1-R、CY26-2-F、CY26-2-R、CY26-3-F、CY26-3-R、CY26-4-F、CY26-4-R、CY26-5-F、CY26-5-R、CY26-6-F、CY26-6-R、CY26-7-F、CY26-7-R、CY26-8-F、CY26-8-R、CY26-9-F、CY26-9-R、CY35-1-F、CY35-1-R、CY35-2-F、CY35-2-R、CY35-3-F、CY35-3-R、CY35-4-F、CY35-4-R、CY35-5-F、CY35-5-R、MTF-1-F、MTF-1-R、MTF-2-F、MTF-2-R、SLC-F、SLC-R、DPY-1-F、DPY-1-R、DPY-2-F、DPY-2-R、DPY-3-F、DPY-3-R、DPY-4-F、DPY-4-R、DPY-5-F和DPY-5-R,其序列依次如SEQ ID 01~SEQ ID 132所示;
(2)設(shè)計一不對稱連接探針組與一不與人類基因組形成互補的通用引物,不對稱連接探針組含有多對不同的不對稱連接探針,每對不對稱連接探針均包括可自身形成環(huán)狀的一正向探針和一反向探針,該正向探針和反向探針從3’端至5’端均依次包括一能夠與不對稱連接探針的5’端若干連續(xù)堿基配對的互補序列、一與所述通用引物互補配對的擴增序列和一與上述2~5個T相對應(yīng)的粘性末端識別序列,同時各正向探針和反向探針均具有相應(yīng)的標(biāo)簽序列,上述每對不對稱連接探針的正向探針和反向探針的Tm值相差不超過1℃,具體的,所述不對稱連接探針組包括Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR,其序列依次如SEQ ID 133~SEQ ID 164所示,上述BC1~8分別表示八種不同的標(biāo)簽序列;
(3)將模板、上述基本擴增引物組置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反應(yīng)體系中進行擴增,純化后得擴增產(chǎn)物;將上述擴增產(chǎn)物、不對稱連接探針組、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合進行PCR,純化后獲得所述用于高通量測序檢測藥物基因組SNP變異文庫;
上述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA連接酶和DNA末端修飾酶組成。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法,其特征在于:所述基本擴增引物組由VK1-F、VK1-R、UG1-F、UG1-R、HLAA-F、HLAA-R、HLAB-1-F、HLAB-1-R、HLAB-2-F、HLAB-2-R、TP1-F、TP1-R、TP2-F、TP2-R、TP3-F、TP3-R、TP4-F、TP4-R、TP5-F、TP5-R、NAT1-1-F、NAT1-1-R、NAT1-2-F、NAT1-2-R、NAT1-3-F、NAT1-3-R、NAT2-1-F、NAT2-1-R、NAT2-2-F、NAT2-2-R、NAT2-3-F、NAT2-3-R、NAT2-4-F、NAT2-4-R、G6PD-1-F、G6PD-1-R、G6PD-2-F、G6PD-2-R、G6PD-3-F、G6PD-3-R、G6PD-4-F、G6PD-4-R、G6PD-5-F、G6PD-5-R、F5-F、F5-R、F2-F、F2-R、IFNL3-F、IFNL3-R、APOE-1-F、APOE-1-R、APOE-2-F、APOE-2-R、COMT-F、COMT-R、CY12-1-F、CY12-1-R、CY12-2-F、CY12-2-R、CY12-3-F、CY12-3-R、CY12-4-F、CY12-4-R、CY2B6-1-F、CY2B6-1-R、CY2B6-2-F、CY2B6-2-R、CY2B6-3-F、CY2B6-3-R、CY219-1-F、CY219-1-R、CY219-2-F、CY219-2-R、CY219-3-F、CY219-3-R、CY219-4-F、CY219-4-R、CY219-5-F、CY219-5-R、CY219-6-F、CY219-6-R、CY219-7-F、CY219-7-R、CY29-1-F、CY29-1-R、CY29-2-F、CY29-2-R、CY26-1-F、CY26-1-R、CY26-2-F、CY26-2-R、CY26-3-F、CY26-3-R、CY26-4-F、CY26-4-R、CY26-5-F、CY26-5-R、CY26-6-F、CY26-6-R、CY26-7-F、CY26-7-R、CY26-8-F、CY26-8-R、CY26-9-F、CY26-9-R、CY35-1-F、CY35-1-R、CY35-2-F、CY35-2-R、CY35-3-F、CY35-3-R、CY35-4-F、CY35-4-R、CY35-5-F、CY35-5-R、MTF-1-F、MTF-1-R、MTF-2-F、MTF-2-R、SLC-F、SLC-R、DPY-1-F、DPY-1-R、DPY-2-F、DPY-2-R、DPY-3-F、DPY-3-R、DPY-4-F、DPY-4-R、DPY-5-F和DPY-5-R組成。
3.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法,其特征在于:所述不對稱連接探針組由Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR組成。
4.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法,其特征在于:所述通用引物為C-primer,其序列如SEQ ID 165所示。
5.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法,其特征在于:所述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA連接酶和DNA末端修飾酶組成,比例0.8~1.2∶0.8~1.2∶0.8~1.2。
6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法,其特征在于:所述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA連接酶和DNA末端修飾酶組成,比例1∶1∶1。
7.一種基于權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的構(gòu)建方法的試劑盒,其特征在于:包括:
一DNA富集反應(yīng)組件,由所述基本擴增引物組組成;
一RingCap-Taq酶,由Taq酶、DNA連接酶和DNA末端修飾酶組成;
一Barcode 1~8反應(yīng)組件,由所述不對稱連接探針組和通用引物組成,具體包括連在一起的八個反應(yīng)孔,每個反應(yīng)孔分別裝有對應(yīng)的標(biāo)簽序列的不對稱連接探針和通用引物;
一陽性質(zhì)控品;
和一陰性質(zhì)控品。