本發(fā)明屬于醫(yī)藥化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及了穩(wěn)定的D晶型巖白菜素，并公開了制備該D晶型巖白菜素的方法。

背景技術(shù)：

巖白菜素，英文名為Bergenin，結(jié)構(gòu)式如式1所示。巖白菜素又稱為巖白菜素內(nèi)酯、虎耳草素、矮茶素等。為一類二氫異香豆素類化合物，其化學(xué)名為3,4,8,10-四-O-羥基-2-羥甲基-9-O-甲基-2,3,4a,10b-四氫吡喃基[3,2-c]苯并吡喃-6-酮，化學(xué)式為C14H16O9，分子量為328.27。巖白菜素為白色疏松的結(jié)晶性粉末或針狀結(jié)晶；味苦，無臭；遇熱或光逐漸變色，在甲醇中溶解，在水或乙醇中微溶。因其具有較好的鎮(zhèn)咳和抗?jié)冏饔帽?990版《中華人民共和國藥典》收為鎮(zhèn)咳祛痰藥。目前國內(nèi)外對巖白菜素的結(jié)構(gòu)修飾及活性進(jìn)行了大量研究。發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗氧化、保肝、抑菌、抗病毒、抗HIV等活性。

晶型(crystalline forms, polymorphs)是指結(jié)晶物質(zhì)晶格內(nèi)分子的排列形式。同一藥物由于藥物晶型的不同，其物理、化學(xué)（溶解度、熔點、溶出度、生物有效性等方面）性質(zhì)可能會有顯著不同，直接影響藥物的質(zhì)量與藥效，因此藥物晶型研究也是新藥研究中的重要內(nèi)容之一。發(fā)明人想通過研究找到化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易于制備不同劑型或具有更高活性的巖白菜素新晶型。

中國專利CN101899052A公開了巖白菜素的化合物的B晶型及這種巖白菜素新晶型固體物質(zhì)樣品的制備方法，含有這種巖白菜素新晶型的藥物組合物，發(fā)現(xiàn)了巖白菜素新晶型固體物質(zhì)經(jīng)口服固體給藥后在生物體內(nèi)的吸收與血藥濃度特征；新晶型固體物質(zhì)改變了原有晶型固體藥物有效成分在生物體內(nèi)的吸收速度、增強了生物體內(nèi)血藥濃度而達(dá)到提高藥物在臨床疾病治療中優(yōu)勢防治作用。

中國專利CN101899053A公開了巖白菜素的化合物的晶C晶型及這種巖白菜素新晶型固體物質(zhì)樣品的制備方法，含有這種巖白菜素新晶型的藥物組合物，發(fā)現(xiàn)了巖白菜素新晶型固體物質(zhì)經(jīng)口服固體給藥后在生物體內(nèi)的吸收與血藥濃度特征；新晶型固體物質(zhì)改變了原有晶型固體藥物有效成分在生物體內(nèi)的吸收速度、增強了生物體內(nèi)血藥濃度而達(dá)到提高藥物在臨床疾病治療中優(yōu)勢防治作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了實現(xiàn)一種巖白菜素新的D晶型及其制備方法，提供了一種巖白菜素的D晶型固體物質(zhì)及其制備方法與用途，其巖白菜素D晶型固體物質(zhì)的抗腫瘤藥理活性。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:

一種巖白菜素的D晶型固體物質(zhì)，當(dāng)樣品的化學(xué)純度與晶型純度均大于99.5%，使用粉末X射線衍射分析采用Cu-Kα 輻射實驗條件時,其以2θ角度表示X射線粉末衍射在12.1±0.2°，14.6±0.2°，18.6±0.2°，19.9±0.2°，23.2±0.2°，25.3±0.2°，35.4±0.2°處有特征峰。

所述的當(dāng)巖白菜素樣品的化學(xué)純度與晶型純度均大于99.5%，使用粉末X射線衍射分析采用Cu-Kα輻射實驗條件時，其以2θ角度表示X射線粉末衍射在12.1±0.2°，13.5±0.2°, 14.6±0.2°，17.1±0.2°, 18.6±0.2°，19.9±0.2°，20.1±0.2°, 22.5±0.2°, 23.2±0.2°，24.8±0.2°, 25.3±0.2°，27.9±0.2°, 35.4±0.2°，38.7±0.2°，40.1±0.2°，41.0±0.2°處有特征峰。

所述的巖白菜素的D晶型固體物質(zhì)的紅外光譜進(jìn)行分析時在3424、3390、3250、2989、2959、2942、2891、2724、1704、1611、1529、1462、14/14、1378、1371、1341、1336、1306、1294、1231、1215、1205、1180、1134、1120、1104、1095、1072、1045、1028、1020、991、963、859、820、765、718、679、649、593、547 cm^-1 處有吸收峰存在，其中2942、2724、1704、1611、1462、1414、1341、1231、1180、1134、1095、1020、991、963、904、765、718、679、593、547 cm^-1峰為巖白菜晶型固體物質(zhì)呈現(xiàn)D晶型特征的吸收峰位置。

所述的巖白菜素的D晶型固體物質(zhì)的DSC圖譜中主要有三個尖銳的特征吸收峰，并且均呈上升趨勢，第一個峰表示晶型轉(zhuǎn)變溫度為150.84℃，第二個峰表示熔融溫度即熔點為229.48℃，第三個峰表示氣化溫度為330.32℃。

一種D晶型巖白菜素的制備方法，向粉碎后的巖白菜素根中依次加入95%濃度的乙醇，分梯度和批次加熱回流3-6次，每次1-4h，收集濾液，合并濾液，濃縮后靜置1-4h，抽濾干燥得到巖白菜素粗品；向粗品里再次加入乙醇:乙腈=1:1的混合溶劑，加熱回流，趁熱抽濾，將濾液放入冰箱中冷卻靜置，然后在環(huán)境溫度4℃~8℃、環(huán)境濕度10%~75%、常壓或真空實驗條件下結(jié)晶獲得巖白菜的D晶型固體物質(zhì)。

一種巖白菜素的D晶型固體物質(zhì)應(yīng)用于制備用于治療腫瘤藥物。

本發(fā)明中，在以2θ角度表示的X-射線粉末衍射特征峰中，“±0.2°”表示特征峰位置所允許的合理測量誤差范圍。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明提供的巖白菜素的D晶型固體物質(zhì)經(jīng)MTT法測試，對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)、卵巢癌細(xì)胞（XB1309）有較好的抑制活性，可制備用于治療腫瘤的藥物。

說明書附圖

圖1巖白菜素D晶型樣品的粉末X射線衍射圖譜。

圖2巖白菜素D晶型樣品的紅外吸收光譜圖。

圖3巖白菜素D晶型樣品的DSC圖譜。

圖4巖白菜素D晶型樣品的高效液相色譜圖。

圖5巖白菜素D晶型樣品的核磁共振碳譜圖、核磁共振氫譜圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)一步敘述，但本發(fā)明不局限與以下實施例，本發(fā)明實施例中所使用的試劑和采用的方法都為本領(lǐng)域的常規(guī)試劑和常規(guī)的操作方法。在下文中，如果未特別說明，本發(fā)明所用材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然盡可能詳細(xì)描述。

一種巖白菜素的D晶型固體物質(zhì)，當(dāng)樣品的化學(xué)純度與晶型純度均大于99.5%，使用粉末X射線衍射分析采用Cu-Kα 輻射實驗條件時,其以2θ角度表示X射線粉末衍射在12.1±0.2°，14.6±0.2°，18.6±0.2°，19.9±0.2°，23.2±0.2°，25.3±0.2°，35.4±0.2°處有特征峰。

所述的當(dāng)巖白菜素樣品的化學(xué)純度與晶型純度均大于99.5%，使用粉末X射線衍射分析采用Cu-Kα輻射實驗條件時，其以2θ角度表示X射線粉末衍射在12.1±0.2°，13.5±0.2°, 14.6±0.2°，17.1±0.2°, 18.6±0.2°，19.9±0.2°，20.1±0.2°, 22.5±0.2°, 23.2±0.2°，24.8±0.2°, 25.3±0.2°，27.9±0.2°, 35.4±0.2°，38.7±0.2°，40.1±0.2°，41.0±0.2°處有特征峰。

在一個具體實施例中，所述的巖白菜素晶型D，其特征在于，當(dāng)樣品的化學(xué)純度與晶型純度均大于99.5%，使用Cu-Kα輻射，其以2θ角度表示的X-射線粉末衍射具有如附圖1所示的圖譜。

更進(jìn)一步地，所述巖白菜素的D晶型固體物質(zhì)，其特征在于紅外光譜進(jìn)行分析時在3424、3390、3250、2989、2959、2942、2891、2724、1704、1611、1529、1462、14/14、1378、1371、1341、1336、1306、1294、1231、1215、1205、1180、1134、1120、1104、1095、1072、1045、1028、1020、991、963、859、820、765、718、679、649、593、547 cm-1 處有吸收峰存在，其中2942、2724、1704、1611、1462、1414、1341、1231、1180、1134、1095、1020、991、963、904、765、718、679、593、547 cm-1峰為巖白菜晶型固體物質(zhì)呈現(xiàn)D晶型特征的吸收峰位置，具有如附圖2所示的圖譜。

所述的巖白菜素D晶型固體物質(zhì)的差示掃描量熱分析（DSC）檢測結(jié)構(gòu)顯示在150-335℃范圍內(nèi)有吸收峰；更具體地，所述巖白菜素D晶型在DSC圖譜中主要有三個尖銳的特征吸收峰，并且均呈上升趨勢，第一個峰表示晶型轉(zhuǎn)變溫度為150.84℃，第二個峰表示熔融溫度即熔點為229.48℃，第三個峰表示氣化溫度為330.32℃；在一個實施例中，具有如附圖3所示的圖譜：

一種巖白菜素D晶型固體物質(zhì)的制備方法，該方法包括以下步驟：向粉碎后的巖白菜素根中依次加入95%濃度的乙醇，分梯度和批次加熱回流3-6次，每次1-4h，收集濾液，合并濾液，濃縮后靜置1-4h，抽濾干燥得到巖白菜素粗品；向粗品里再次加入乙醇:乙腈=1:1的混合溶劑，加熱回流，趁熱抽濾，將濾液放入冰箱中冷卻靜置，然后在環(huán)境溫度4℃~8℃、環(huán)境濕度10%~75%、常壓或真空實驗條件下結(jié)晶獲得巖白菜的D晶型固體物質(zhì)。

本發(fā)明提供的巖白菜素D晶型固體物質(zhì)具有較高的純度和較好的收率，其純度在99.7％以上，單個雜質(zhì)含量在0.1％以下，其中一個實施例獲得的高純度D晶型巖白菜素純率高達(dá)99.995%（見附圖4），該方法工藝簡單，操作方便，條件溫和，不需要特殊的反應(yīng)條件，因此適合規(guī)?；a(chǎn)高純度巖白菜素D晶型固體物質(zhì)。

本發(fā)明所用的測試儀器：

1）X-射線粉末衍射儀

儀器型號：Thermo X’TRA 型X射線粉末衍射分析儀

測試方法：根據(jù)中國藥典2010版二部（附錄IX F X射線粉末衍射法）將研細(xì)后的樣品(l00mg)填在玻璃板凹槽里，用載玻片將其平面與玻璃面掛齊平后，將樣品置于Thermo X’TRA 型X射線粉末衍射分析儀中，使用40kV 40mA的銅X-射線源，掃描范圍為2～45° (2θ)，掃描速度8° /分鐘，掃描時間6分鐘。掃描誤差通常為土0.2°(2θ)。

2）差示掃描量熱儀

儀器型號：METTLER TGA/DSCI。

測試方法：根據(jù)JY/T014-1996熱分析方法通則，將重3.10mg的樣品置于具有小針孔的密閉鋁盤中，在50℃下保持平衡，然后以10℃/min的掃描速率加熱至350℃。干燥氮氣被用作吹掃氣體。

實施例1

制備巖白菜素粗品

稱取粉碎的巖白菜根100g加入1000mL圓底燒瓶中，向其中依次加入700mL、500mL、300mL 95%乙醇，加熱回流三次，每次2h，用紗布過濾收集濾液，合并三次濾液。濾液減壓濃縮至100~200mL, 將濃縮后的濾液倒入錐形瓶，放入冰箱中靜置待其結(jié)晶，靜置3d后，觀察錐形瓶底部有大量顆粒型晶體析出，抽濾，干燥，得巖白菜素粗品4.3g。

實施例2

巖白菜素粗品D晶型樣品的制備

將4.3g巖白菜素粗品加入250mL圓底燒瓶中，加入80mL 95%乙醇與80mL乙腈，加熱回流15min，趁熱抽濾（布氏漏斗已加熱），除去大顆粒不溶性雜質(zhì)。將濾液放入冰箱中靜置待其結(jié)晶，靜置4d后，觀察有白色晶體析出，抽濾，然后用五氧化二磷作為干燥劑，在干燥器中干燥除水,得巖白菜素D晶型樣品3.2g收率約82%，HLPC純度99.995%, 如附圖4所示；經(jīng)測定，其X-射線粉末衍射圖譜如圖1所示；其DSC圖譜如圖2所示。

實施例3

核磁共振法鑒定巖白菜素結(jié)構(gòu)

（結(jié)晶后的巖白菜素晶體10mg，可根據(jù)需要稱取適量，加氘代DMSO試劑溶解，將配好的溶液置于核磁管中，測試巖白菜素13C譜、1H譜，對圖譜進(jìn)行解析并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對，所測巖白菜素13C譜、1H譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜完全吻合，判斷化合物是即為為巖白菜素。

實施例4

高效液相色譜法測定巖白菜素純度

實施例2所制備的巖白菜素粗品D晶型樣品經(jīng)高效液相色譜法測試純度為99.995%。色譜條件如下，色譜柱：C18柱；流動相為甲醇：水（32:68）；流量1.0mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為275nm；對照品溶液制備：精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥12h的巖白菜素對照品11.90mg，加甲醇制成19.04μg/mL對照品溶液；供試品溶液制備：取樣品細(xì)粉約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補充減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，既得；進(jìn)樣：樣品及對照品的進(jìn)樣量均為5μL。

實施例5

巖白菜素粗品D晶型樣品抗腫瘤活性測試

對本發(fā)明的化合物進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗，試驗方法采用常規(guī)的MTT法。

細(xì)胞株選用：非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)，人食管癌細(xì)胞(EC-9706)，人肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)，卵巢癌細(xì)胞(XB1309)，人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)。培養(yǎng)液為DMEM+15%NBS+雙抗。

樣品液的配制：巖白菜素樣品用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成的100 μmol/L的溶液或者均勻的混懸液，然后用DMSO的PBS(-)稀釋，最終濃度分別為0.1，1，10，20，40，60，80, 100 μmol/L。

將上市的抗腫瘤藥物阿糖胞苷(Ara-C)以同樣的條件配成對照品溶液。

細(xì)胞培養(yǎng)：貼壁生長腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 滅活新生牛血清和青霉素、鏈霉素（各100萬U/L）的1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2，飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，每2～3 天傳代1 次，傳代時首先倒出培養(yǎng)液，PBS洗2次，胰酶消化后，加入新鮮的培養(yǎng)液吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞至適當(dāng)濃度移入新的培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)液至適量。

取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化、計數(shù)，以 2×104/mL 的密度接種于 96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl。培養(yǎng) 24小時后，將待測化合物以0.1，1，10，20，40，60，80,100 μmol/L濃度處理細(xì)胞。實驗組每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，以含0.4% DMSO的培養(yǎng)液作對照。藥物作用 48小時后，去上清，每孔加入100 μl MTT（2-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-3,5-二苯基-2H-四唑氫溴酸鹽）(1mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng) 4小時，棄上清，每孔加入100μl DMSO，振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸光度值，采用 IC50 計算軟件求出半數(shù)抑制濃度(IC50)。

巖白菜素D晶型樣品對不同腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50（單位：μmol/L）

從表中可以看出，巖白菜素D晶型樣品對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)，人食管癌細(xì)胞（EC-9706），人肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)，卵巢癌細(xì)胞（XB1309），人結(jié)腸癌細(xì)胞（HT-29）均有一定的抑制活性，其中，D晶型樣品化合物對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)、卵巢癌細(xì)胞（XB1309）有較好的抑制活性且接近Ara-C。

以上實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的巖白菜素D晶型具有良好的抗腫瘤活性，被認(rèn)為是最有研究價值的。值得進(jìn)一步的研究與開發(fā)。因此本發(fā)明可以用于制備抗腫瘤藥物。