本發(fā)明涉及一株低產(chǎn)乙醛的啤酒酵母及其應(yīng)用，屬于微生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
啤酒是歷史最悠久的酒精飲料之一。我國啤酒行業(yè)發(fā)展日趨成熟，發(fā)展方向也由重?cái)?shù)量向著重質(zhì)量轉(zhuǎn)變。然而我國的啤酒質(zhì)量至今還和國外的優(yōu)質(zhì)啤酒有著一定差距，這成為制約國內(nèi)啤酒企業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的主要因素。啤酒中的風(fēng)味物質(zhì)對(duì)其口感和香氣起著極其重要的作用，醛類是啤酒中存在的主要羰基化合物，其中乙醛是啤酒中含量最高的揮發(fā)性醛類，占啤酒中總?cè)┑?0％。乙醛的含量直接影響著啤酒的風(fēng)味和老化，其含量過高會(huì)給啤酒帶來惡劣的青草味，并會(huì)縮短啤酒風(fēng)味的保鮮期，甚至飲用后會(huì)引起人體的不良反應(yīng)。
如何降低啤酒中乙醛含量是啤酒行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)之一，雖然學(xué)者們提出了很多控制乙醛含量的措施，然而多數(shù)的工藝控制措施是針對(duì)某些企業(yè)自身的菌種、發(fā)酵工藝提出的，沒有普遍適用性，同樣的措施應(yīng)用于不同的菌種、不同的工藝條件下可能會(huì)出現(xiàn)不同甚至相反的結(jié)果。與此同時(shí)，對(duì)于酵母菌株的改造基本也都是通過分子手段，構(gòu)建工程菌以達(dá)到降低乙醛的目的，但是考慮到食品安全，這些工程菌是不被消費(fèi)者所接受，不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的。乙醛在啤酒中主要來自酵母代謝，因此，獲得低產(chǎn)乙醛酵母才是降低啤酒中乙醛含量的根本途徑。因此，建立一種行業(yè)內(nèi)通用的技術(shù)手段，在保證食品安全的前提下有效降低乙醛含量是當(dāng)前啤酒行業(yè)急需解決的問題之一。
乙醛在啤酒釀造過程典型的生物代謝途徑如圖1所示。由圖1可以看出，影響乙醛含量的關(guān)鍵酶有丙酮酸脫氫酶、乙醛脫氫酶(ALDH)及乙醇脫氫酶(ADH2)等，其中ALDH和ADH2是酵母乙醛代謝途徑中的關(guān)鍵酶。乙醇經(jīng)ADH2代謝為乙醛，再經(jīng)乙醛脫氫酶代謝為乙酸。酶的抑制劑可特異性地作用于酶的特殊基團(tuán)或者活性中心，合理的選擇抑制劑可大幅度提高篩選菌株的效率。若抑制或降低ADH2活性，使乙醇流向乙醛的代謝流減弱，可以令乙醛含量降低；4-甲基吡唑可以與ADH2的酶活性中心結(jié)合，從而抑制乙醇的代謝。戒酒硫是乙醛脫氫酶的抑制劑之一，一定濃度的戒酒硫能部分或全部抑制乙醛脫氫酶的活性，從而使乙醛不能氧化為乙酸。在以乙醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中，乙酸一旦不能形成，酵母的代謝流就無法進(jìn)行下去，酵母則不會(huì)生長。不同酵母菌株分泌ALDH和ADH2的酶活水平高低不同，催化乙醛的能力不同，最終表現(xiàn)在發(fā)酵產(chǎn)物中乙醛的終濃度有所差別。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2016年7月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.12781，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
所述酵母形狀近似于圓形，直徑大小介于1.5-3.0微米；在YPD固體培養(yǎng)基表面生長48個(gè)小時(shí)后，即能長出直徑大小約2.5毫米左右的菌落，菌落乳白色，有光澤，平坦，邊緣整齊，質(zhì)地均勻，半透明，易挑取，有酒香味。
所述酵母是由出發(fā)菌株經(jīng)常壓室溫等離子體誘變(ARTP)后，稀釋涂布于甲吡唑-戒酒硫-乙醇抗性平板，挑取長出的菌落，在高濃乙醛環(huán)境中進(jìn)化篩選后得到具有較強(qiáng)的乙醛還原能力的啤酒酵母。
在含有甲吡唑和戒酒硫的以乙醇為唯一碳源的培養(yǎng)上，戒酒硫通過抑制ALDH酶的活性進(jìn)而抑制酵母的生長，而只有突變具有高ALDH酶活性的酵母可以代謝乙醛而正常生長，其代謝乙醛能力強(qiáng)，從而使乙醛含量降低；甲吡唑能與酵母中ADH2特異性結(jié)合，從而阻止了乙醇向乙醛的轉(zhuǎn)化，使代謝產(chǎn)生的乙醛流向合成乙醇或乙酸的方向。最后，通過向培養(yǎng)基中添加高濃度的乙醛，使酵母長期處在一個(gè)高乙醛濃度的環(huán)境中進(jìn)化出較強(qiáng)的乙醛還原能力，進(jìn)一步降低乙醛產(chǎn)量，增強(qiáng)優(yōu)選菌株的遺傳穩(wěn)定性。甲吡唑和戒酒硫雙抑制劑平板與高濃度乙醛培養(yǎng)基馴化相結(jié)合可以更加高效地篩選出低產(chǎn)乙醛酵母菌，減少了菌株選育的盲目性。
本發(fā)明提供的一株低產(chǎn)乙醛的釀酒酵母CGMCC No.12781，其發(fā)酵后乙醛含量可低達(dá)2.17mg/L。
生物材料保藏
一種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2016年7月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.12781，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
附圖說明
圖1乙醛在酵母體內(nèi)的生物代謝途徑。
具體實(shí)施方式
平板篩選和液體培養(yǎng)基馴化過程中乙醛含量的測定方法：
利用頂空氣相色譜法(HS-GC)對(duì)篩選過程中的乙醛含量進(jìn)行測定，具體操作過程及實(shí)驗(yàn)條件如下：
樣品處理：向頂空瓶中加入1.8g NaCl，加入4mL濾紙過濾后的酵母發(fā)酵液或乙醛標(biāo)準(zhǔn)溶液(20mg/L)，同時(shí)加入內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)溶液3-庚酮1mL(30mg/L)，密封后直接放入頂空自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行樣品采集分析。
HS-GC檢測條件：
色譜柱：CP-WAX 52CB 30m，I.D.0.25mm(液膜原標(biāo):0.25μm)；載氣：N2，流速0.5-1.0mL/min，分流比1:1，尾吹20-30mL/min；氫氣：流速40mL/min；空氣：流速400mL/min；色譜柱室溫度：40℃保留5min，以10℃/min的速度升到180℃保留4min，氣化室溫度：200℃；檢測室溫度：250℃
實(shí)施例1低產(chǎn)乙醛啤酒酵母的獲得
甲吡唑-雙硫倫-乙醇抗性平板組分(mg/L)如下：甲吡唑1500，戒酒硫1.0，乙醇20，(NH4)2SO44500，NaCl 100，KH2PO4500，MgSO4·7H2O 500，CaCl2100，酵母膏100，瓊脂20。
將戒酒硫濃度固定為1.0mg·L-1后逐級(jí)增加甲吡唑濃度以確定復(fù)合抑制劑對(duì)OD600＝1.5時(shí)的酵母致死濃度。在復(fù)合篩選培養(yǎng)基上酵母的生長情況顯示，戒酒硫與甲吡唑復(fù)合培養(yǎng)基在甲吡唑濃度900mg·L-1、雙硫侖濃度1.0mg·L-1時(shí)已經(jīng)對(duì)稀釋倍數(shù)10-2以及10-1的酵母完全致死；在甲吡唑濃度1200mg·L-1、戒酒硫濃度1.0mg·L-1時(shí)開始對(duì)原濃度酵母(OD600＝1.5)產(chǎn)生影響；在甲吡唑濃度1500mg·L-1、戒酒硫濃度1.0mg·L-1時(shí)，對(duì)原濃度酵母基本致死，所以選取甲吡唑濃度1500mg·L-1、戒酒硫濃度1.0mg·L-1為篩選低產(chǎn)乙醛酵母的復(fù)合抗性濃度。
以啤酒酵母為出發(fā)菌株，將經(jīng)ARTP誘變(將稀釋過后的菌懸液取20μL涂布于載體表面，將載片放置于載臺(tái)的凹槽中，分別進(jìn)行2mm射距照射45s)的酵母菌株擴(kuò)培后，調(diào)整菌懸液濃度OD600＝1.5時(shí)涂布于完全致死抑制劑濃度的甲吡唑-雙硫倫-乙醇抗性平板，挑取篩選平板上長出的菌落進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。
表1復(fù)合抗性平板上挑取菌落的發(fā)酵情況
注：表中僅部分?jǐn)?shù)據(jù)，因篇幅有限部分?jǐn)?shù)據(jù)未列出。
表1中的菌株是出發(fā)酵母經(jīng)ARTP誘變后在甲吡唑+戒酒硫復(fù)合篩選培養(yǎng)基上生長的乙醛含量降低的菌株，各個(gè)酵母菌株乙醛代謝量降低幅度有所差異。
實(shí)施例2菌株的馴化
以乙醛為唯一碳源的高濃乙醛培養(yǎng)基，組分(mg/L)如下：乙醛800，KH2PO4500，NaCl100，(NH4)2SO45000，MgSO4·7H2O 500，酵母膏100，CaCl2100。
將實(shí)施例1中得到的7個(gè)菌株置于上述含不同濃度的以乙醛為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，每48-72h轉(zhuǎn)接一次以保證乙醛的濃度，10℃培養(yǎng)30天。馴養(yǎng)后，進(jìn)行三角瓶發(fā)酵，考察其乙醛含量，結(jié)果如表2所示。
表2經(jīng)乙醛培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)養(yǎng)后的酵母乙醛產(chǎn)量
注：表中僅部分?jǐn)?shù)據(jù)，因篇幅有限部分?jǐn)?shù)據(jù)未列出。
由表2可以看出，經(jīng)高濃乙醛培養(yǎng)基的馴化培養(yǎng)后，酵母乙醛的代謝量進(jìn)一步降低：5號(hào)酵母LAL-8a-LQ的乙醛產(chǎn)量較出發(fā)菌株降低了近90％，達(dá)到2.17mg/L。將該菌保藏至中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)，保藏號(hào)為：CGMCC No.12781。
同時(shí)，在保證酵母菌株乙醛產(chǎn)量降低的同時(shí)，考慮到啤酒酵母的其他發(fā)酵性能，進(jìn)一步將5號(hào)酵母LAL-8a-LQ進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測分析，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，5號(hào)酵母菌株在乙醛產(chǎn)量降低的同時(shí)，高級(jí)醇和揮發(fā)酯含量在正常范圍內(nèi)，醇酯比在4-5之間，保證了啤酒風(fēng)味的協(xié)調(diào)性特征。
表35號(hào)酵母風(fēng)味物質(zhì)檢測分析(mg/L)
注：試驗(yàn)1、試驗(yàn)2和試驗(yàn)3分別為優(yōu)選啤酒酵母菌株5的平行發(fā)酵試驗(yàn)。