本發(fā)明涉及細(xì)胞生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特不是一種構(gòu)建穩(wěn)定高效表達(dá)-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法。
背景技術(shù)：
：c-met基因是由α鏈和β鏈組成的異源二聚體，其編碼蛋白質(zhì)是跨膜酪氨酸激酶受體(RTKS)超家族成員之一，具有自主磷酸化的活性。肝細(xì)胞生長因子(HGF)為c-met的配體，其與受體c-met特異結(jié)合后，可誘導(dǎo)c-met構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中的PTK發(fā)生磷酸化，進(jìn)一步激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮效應(yīng)。肝衰竭是目前嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，該病病情兇險，進(jìn)展迅速，病死率高。目前，肝移植是該病最有效的治療方法，但因各方面條件的缺乏而受到限制。因此，尋找一種新的方式治療肝衰竭至關(guān)重要。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種能自我復(fù)制和具有多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，且易于分離，增殖能力強(qiáng)，在適宜的信號刺激下可以向不同組織類型細(xì)胞分化，易于進(jìn)行外源性基因的轉(zhuǎn)染和其蛋白的表達(dá)。YijingCai等研究發(fā)現(xiàn)，移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可顯著改善肝衰竭患者肝功能，但經(jīng)移植BMSCs治療的肝衰竭患者肝功能只在短期內(nèi)均可以獲得明顯改善，但其遠(yuǎn)期生存率并無明顯改善。造成上述原因可能是BMSCs回輸后歸巢于肝臟細(xì)胞數(shù)過少，以及其歸巢的細(xì)胞分化再生能力差。研究發(fā)現(xiàn)，HGF/c-met受體通路與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢密切相關(guān)，且影響B(tài)MSCs向類肝細(xì)胞分化及調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的再生功能；也有研究表明肝衰竭患者肝細(xì)胞再生障礙與肝細(xì)胞c-met基因表達(dá)水平下降，HGF/c-met通路受損有關(guān)。因此，建立穩(wěn)定高效表達(dá)c-met的BMSCs細(xì)胞株，對于以后研究BMSCs治療肝衰竭時,c-met對BMSCs歸巢于肝臟及向肝細(xì)胞分化的影響，以及相應(yīng)機(jī)制及是否以后可作為治療肝衰竭患者的一種新的、更有效的治療方案都是十分重要的。且相比以往常見的瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染解決了其轉(zhuǎn)染效率低，轉(zhuǎn)染的外源基因不能整合到細(xì)胞基因組，轉(zhuǎn)染的基因表達(dá)時間短等缺點(diǎn)。目前尚未見到關(guān)于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs細(xì)胞株的研究和報道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明提供一種可以穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs細(xì)胞株的構(gòu)建方法，用于多種腫瘤的相關(guān)機(jī)制研究，本發(fā)明是這樣獲得的：一種構(gòu)建穩(wěn)定高效表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法，其具體步驟如下：A)選取4周齡SPF級SD雄性大鼠，提取并培養(yǎng)BMSCs；B)分別以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2為上下游引物，以c-met基因為模板(根據(jù)NCBI提供的c-met(rat)mRNA序列NM-031517，委托上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成)，輕輕吹打混勻，置于PCR儀中擴(kuò)增目的基因c-met并測序鑒定；PCR反應(yīng)體系：5×PSBuffer10μl，2.5mMeach的dNTPMix4μl，10μM的上游引物1μl，10μM的下游引物1μl，10ng/μL的模板1μl，PrimeSTARHSDNApolymerase0.5μl，ddH2O補(bǔ)足至50μl；PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)熱5min；98℃10s，55℃10s，72℃90s，共30個循環(huán)；4℃延伸；C)利用限制性內(nèi)切酶AgeI酶切慢病毒載體GV35，配置酶切體系，用移液器輕輕吹打混勻，于37℃反應(yīng)3h，即獲得慢病毒載體GV358的酶切產(chǎn)物線性化載體DNA；酶切體系：10×CutSmartBuffer5μl，1μg/μL的純化的質(zhì)粒DNA(購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)2μl，10U/μl的限制性內(nèi)切酶AgeI酶1μl，ddH2O補(bǔ)足至50μl；D)于冰水浴中配制線性化載體DNA和目的基因重組反應(yīng)體系，配制時用移液器輕輕吹打混勻，避克產(chǎn)生氣泡；配制后將反應(yīng)體系置于37℃反應(yīng)30min，獲得慢病毒表達(dá)載體GV358-c-met；重組反應(yīng)體系：5×CEIIBuffer2μl，步驟C)獲得的線性化載體DNA(濃度800ng/μL)2.5μl，步驟B)獲得的目的基因c-met(濃度700ng/μL)1μl，ExnaseII1μl，ddH2O補(bǔ)足至10μl；E)向離心管中加入GV358-c-met20μg、pHelper1.015μg、pHelper2.010μg，以InvitrogenLipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑補(bǔ)足至1ml，形成轉(zhuǎn)染混合液，室溫下孵育15min；然后將轉(zhuǎn)染混合液緩慢滴入細(xì)胞密度為70％～80％的293T細(xì)胞中，混勻，于37℃，含5％CO2(體積分?jǐn)?shù))的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)6h后，棄去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，緩慢加入含10％血清的細(xì)胞培養(yǎng)基10ml，于37℃、含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48-72h；F)收集轉(zhuǎn)染后48h(轉(zhuǎn)染時即為0h計起)的293T細(xì)胞上清液，于4℃，4000g離心10min，除去細(xì)胞碎片；取上清液以0.45μm濾器過濾并于40ml的超速離心管中，將帶有病毒上清液的超速離心管逐一放入至Beckman超速離心機(jī)內(nèi),設(shè)置離心參數(shù)為25000rpm，于4℃離心2h；離心結(jié)束后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒保存液(購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司),獲得c-met基因慢病毒；G)c-met基因慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，具體步驟為：轉(zhuǎn)染前一天，將處于對數(shù)生長期的BMSCs接種于96孔板中，每孔加入4～5×104個細(xì)胞(接種密度為細(xì)胞3～4天長滿為宜)及100μl含10％血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到25％-35％時，棄去原培養(yǎng)基，以感染復(fù)數(shù)(MOI＝100)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，即向各孔中加入10μl步驟F)獲得的c-met基因慢病毒(病毒滴度為2×108TU/ml)、10μl終濃度為5μg/ml的ploybrene增強(qiáng)液和80μl的含10％血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，于37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；感染12h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100μl含10％血清的細(xì)胞培養(yǎng)基；在轉(zhuǎn)染48h后，即可用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況；感染72h后，再次以含10％血清的細(xì)胞培養(yǎng)基換液，并向每孔加入終濃度為9μg/ml的嘌呤毒素，藥物篩選周期為一周，并在熒光顯微鏡下觀察效果，待顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光陽性率達(dá)100％后，將藥物篩選濃度維持在1.8μg/ml，即獲得穩(wěn)定高效表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株；其中，所述含10％血清的細(xì)胞培養(yǎng)基配制方法為：該培養(yǎng)基中含89％的DMEM培養(yǎng)基(購自Hyclone公司)、10％的胎牛血清(購自Corning公司)和1％的青霉素-鏈霉素溶液(購自碧云天公司)。優(yōu)選的，在本發(fā)明所述構(gòu)建穩(wěn)定高效表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法中，步驟E)所述細(xì)胞密度為70％～80％的293T細(xì)胞是這樣獲得的：轉(zhuǎn)染前24h，用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，以含10％血清的細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度約為5×106細(xì)胞/15ml，接種于直徑為10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)70％～80％時即可用于轉(zhuǎn)染；并于轉(zhuǎn)染前2h更換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。本發(fā)明所使用的細(xì)胞為大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，來自于4周齡SPF級SD雄性大鼠脛骨和肱骨提取獲得。本發(fā)明提供一種穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs細(xì)胞株，以突破現(xiàn)有的關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝衰竭的研究方向。通過BMSCs穩(wěn)定高效表達(dá)c-met，以實(shí)現(xiàn)BMSCs治療肝衰竭時更好的歸巢于肝臟及向肝細(xì)胞分化，以及研究其相應(yīng)作用機(jī)制，對于肝衰竭治療的研究和發(fā)展具有重要意義。該細(xì)胞株還可用于多種腫瘤的相關(guān)機(jī)制研究。附圖說明圖1是大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鏡檢查(×100)照片；其中，A:原代細(xì)胞；B:第五代細(xì)胞。圖2是目的基因c-met電泳圖；其大小為4190bp。圖3是慢病毒載體GV358載體圖譜。圖4是重組載體GV358-c-met陽性克隆PCR鑒定電泳結(jié)果示意圖；圖中，1：陰性對照(ddH2O),2：陰性對照(空載自連對照組),3：陽性對照(GAPDH),4：Marker,5-12：c-met1-8號轉(zhuǎn)化子。圖5是慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞72h后熒光顯微鏡(×100)下觀察GFP熒光圖；其中，A:白光視野；B:熒光視野。圖6是不同濃度嘌呤霉素篩選4天后大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)果鏡檢(×100)示意圖；其中，A-F依次為0μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml和10μg/ml。圖7是慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs48h后熒光顯微鏡(×100)下觀察GFP熒光圖；圖中，A:白光視野；B:熒光視野。圖8是慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs篩藥一周后熒光顯微鏡(×100)下觀察GFP熒光圖；圖中，A:白光視野；B:熒光視野。圖9是Western-blot檢測BMSCs中c-met蛋白表達(dá)情況示意圖；其中，蛋白大小為154KD。圖10是穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs組、穩(wěn)定表達(dá)GFP的BMSCs組和生理鹽水組分別治療肝衰竭SD大鼠72h后三組肝臟病理圖(A:穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs治療組肝臟病理圖(×100),B:穩(wěn)定表達(dá)GFP的BMSCs治療組肝臟病理圖(×100)，C:生理鹽水治療組肝臟病理圖(×100))。圖11是穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs組、穩(wěn)定表達(dá)GFP的BMSCs組和生理鹽水組三組SD大鼠生存率圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明進(jìn)行具體描述。實(shí)施例涉及實(shí)驗材料與儀器:4周齡SPF級SD雄性大鼠購于南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗動物中心；胎牛血清購自Corning公司；LowDMEM購自Hyclone公司；大鼠淋巴細(xì)胞分離液購于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；慢病毒載體GV358、病毒包裝輔助質(zhì)粒(Helper1.0、Helper2.0)購于購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；1kpDNAladderMarker購自Fermentas公司；250bpDNAladderMarker購自捷瑞公司；In-FusionTMPCRCloningKit購自clontech公司；Taqpolymerase購自SinoBio公司；dNTP購自Takara；純化的質(zhì)粒DNA購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；Plasmid抽提Kit購自promega；嘌呤霉素購自amresco公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化公司；無血清培養(yǎng)基購于Hyclone公司；病毒保存液購于吉凱公司；細(xì)菌搖床購自華利達(dá)實(shí)驗設(shè)備公司；PCR儀購自AppliedBiosystems公司；positiveclone測序由美季生物技術(shù)完成；穩(wěn)壓DNA電泳儀購自BioRad公司；凝膠成像儀購自天能公司。實(shí)施例涉及的培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化鈉(NaCl)10g/L、濃度為10mmol/lNaOH10μL；含有氨芐青霉素抗生素的LB平板：向LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15g/100ml,高壓使其完全溶解，然后待該液體冷卻到60度左右時，加入終濃度100ng/ml的氨芐青霉素，再將該液體倒入細(xì)菌培養(yǎng)板中，冷卻形成平板；含10％血清的細(xì)胞培養(yǎng)基配方：以質(zhì)量百分百計，將89％的DMEM培養(yǎng)基(購自Hyclone公司)、10％的胎牛血清及(購自Corning公司)1％的青霉素-鏈霉素溶液(購自碧云天公司，100×雙抗)混合后獲得。實(shí)施例涉及的DNA序列：SEQIDNO.1:5’-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGAAGGCTCCCACCGCGCTGGCACCTGG-3’；SEQIDNO.2:5’-TCCTTGTAGTCCATACCTGTGTTCGCTTCGCCGTCAATGTTGTCTTG-3’；SEQIDNO.3:CCAGTTTCCCAACTCCTCTCAG；SEQIDNO.4:CCTTATAGTCCTTATCATCGTC；實(shí)施例1(1)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取與培養(yǎng)選取4周齡SPF級SD雄性大鼠，頸椎脫臼法處死，取出脛骨和股骨，去除兩端干骺端，用5毫升注射器吸取生理鹽水沖洗骨髓腔于50毫升離心管中，1000rpm離心沖洗液10min后，采用3ml含10％血清低糖培養(yǎng)基沖懸離心管底部沉淀，將液體加入到含3ml大鼠淋巴細(xì)胞分離液的15毫升離心管中，2000rpm離心20min后，吸取離心管中第三層白膜層，并加入到含有其4倍體積生理鹽水的離心管中，1000rpm離心10min，含10％血清低糖培養(yǎng)基沖懸底部沉淀接種到培養(yǎng)皿中，并將細(xì)胞放入37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)到第5代用于實(shí)驗；圖1為大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞顯微鏡(×100)放大照片，其中圖1A為原代細(xì)胞，圖1B為第五代細(xì)胞；提取的細(xì)胞1天后即可貼壁，第3天開始出現(xiàn)形變，第7天形成MSC簇，并逐漸向周邊增殖擴(kuò)大，生長成形的BMSCs形態(tài)均一，呈梭形、紡錘形，細(xì)胞排列緊密,呈旋渦狀或掃帚狀排列。(2)大鼠c-met基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建與鑒定a)根據(jù)大鼠c-met基因的序列，設(shè)計并合成上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示，以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2為上下游引物，以基因c-met為模板(根據(jù)NCBI提供的c-met(rat)mRNA序列NM-031517，委托上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成)；配置如下反應(yīng)體系，輕輕吹打混勻，置于PCR儀中擴(kuò)增目的基因c-met；PCR反應(yīng)體系如下表(表1)：試劑體積(μl)ddH2O32.55×PSBuffer10dNTPMix(2.5mMeach)4上游擴(kuò)增引物(10μM)1下游擴(kuò)增引物(10μM)1模板(10ng/μL)1PrimeSTARHSDNApolymerase0.5Total50PCR反應(yīng)條件如下表(表2)：從而獲取目的基因片段(c-met基因)；該目的基因片段2.5％瓊脂糖凝膠電泳圖如圖2所示(M泳道為分子量標(biāo)記)，由圖2可見，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增片段為4190bp，與目的基因大小相符。b)根據(jù)表3，配制50μl酶切體系，按表3順序依次加入各種試劑，用移液器輕輕吹打混勻，置于37℃反應(yīng)3h，以獲得慢病毒載體GV358的酶切產(chǎn)物，以獲得線性化載體DNA。慢病毒載體GV358酶切體系如下表(表3)：試劑體積(μl)ddH2O4210×CutSmartBuffer5純化的質(zhì)粒DNA(1μg/μL)2AgeI(10U/μl)1Total50圖3為該GV358載體圖譜，該載體元件順序:Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。c)再以線性化載體DNA和目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物于冰水浴中配制如下反應(yīng)體系(表4)。用移液器輕輕吹打混勻，避克產(chǎn)生氣泡,于37℃反應(yīng)30min。以獲得由線性化載體和目的基因重組形成的慢病毒表達(dá)載體GV358-c-met；表4：試劑體積(μl)ddH2O3.55×CEIIBuffer2酶切后的線性化載體DNA2.5目的基因c-met1ExnaseTMII1Total10d)將10μL慢病毒表達(dá)載體GV358-c-met加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30min后，42℃水浴鍋中熱激90s，接著在冰水浴孵育2min；然后加入到500μLLB液體培養(yǎng)基中,置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)1h；取100μL菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素抗生素的LB平板上在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16h；再挑取平板上的單克隆進(jìn)行PCR鑒定，具體方法為配制如下反應(yīng)體系，震蕩混勻。在超凈工作臺中，用無菌的槍頭挑取平板上單個菌落至20μL鑒定體系中，吹打混勻，置于PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。菌落PCR鑒定反應(yīng)體系如下表(表5)：試劑體積(μl)ddH2O9.22×TaqPlusMasterMix10上游引物SEQIDNO.3(10μM)0.4下游引物SEQIDNO.4(10μM)0.4單菌落-Total20PCR反應(yīng)條件(表6)：將PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果示PCR產(chǎn)物大小為1181bp，表明該單克隆菌落為陽性。再對該陽性克隆進(jìn)行測序及結(jié)果分析。接著將該正確的克隆菌液擴(kuò)大培養(yǎng)、抽提，以獲得高純度質(zhì)粒(大小為1181bp)。圖4為重組載體GV358-c-met陽性克隆PCR鑒定結(jié)果電泳圖，圖4中，1：陰性對照(ddH2O),2：陰性對照(GV358空載自連對照組),3：陽性對照(GAPDH，該基因購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司),4：Marker,5-12：c-met1-8號轉(zhuǎn)化子；可見1-8號轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化后行陽性克隆PCR鑒定(PCR產(chǎn)物大小為1181bp)，結(jié)果一致，表明慢病毒重組載體構(gòu)建成功。(3)c-met基因重組慢病毒包裝、濃縮與純化1)轉(zhuǎn)染前24h，用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞以含10％血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度約5x106細(xì)胞/15ml，重新接種于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后待細(xì)胞密度達(dá)70％～80％時即可用于轉(zhuǎn)染；并于轉(zhuǎn)染前2h更換為無血清培養(yǎng)基(購于Hyclone公司)；2)向一滅菌離心管中加入GV358-c-met20μg、pHelper1.015μg、pHelper2.010μg，并加入InvitrogenLipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑混合均勻，調(diào)整總體積為1ml，在室溫下溫育15min后；混合液緩慢滴加至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3)培養(yǎng)6h后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，并緩慢加入含10％血清的細(xì)胞培養(yǎng)基10ml，于37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48-72h；4)收集轉(zhuǎn)染后48h(轉(zhuǎn)染時即為0h計起)的293T細(xì)胞上清液；于4℃，4000g離心10min，除去細(xì)胞碎片；再以0.45μm濾器過濾上清液于40ml的超速離心管中；然后分別配平樣品，將帶有病毒上清液的超速離心管逐一放入至Beckman超速離心機(jī)內(nèi),設(shè)置離心參數(shù)為25000rpm，離心時間為2h，離心溫度控制在4℃；離心結(jié)束后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒保存液(購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司),獲得c-met基因慢病毒；(4)c-met重組慢病毒滴度測定采用熒光法測定病毒滴度，測定前一天，使用293T貼壁細(xì)胞鋪板，96孔板，每孔4×104個細(xì)胞；準(zhǔn)備7個無菌的EP管，每管中加入90μl無血清培養(yǎng)基(購于Hyclone公司)，取待測定的病毒原液10μl加入到第一個管中，混勻后，取10μl加入到第二個管中，繼續(xù)相同的操作直到最后一管；選取所需的細(xì)胞孔，棄去90μl培養(yǎng)基，加入90μl稀釋好的病毒溶液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4天后，觀察熒光表達(dá)情況，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少，根據(jù)公式：病毒滴度＝熒光細(xì)胞數(shù)/病毒原液量，即可算出病毒滴度。圖5為轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞72h后熒光顯微鏡(×100)下觀察GFP熒光圖，圖5A為白光視野，圖5B為熒光視野；可見，c-met慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72h，熒光顯微鏡下觀察熒光陽性率可達(dá)90％以上，按上述方法根據(jù)公式計算病毒滴度為2×108TU/ml。(5)確定嘌呤霉素篩選濃度取對數(shù)生長期的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用2mlPBS(購于Hyclone公司)清洗兩遍后，加入2ml胰酶(購于Sigma公司)消化2min，顯微鏡下觀察BMSCs已全部消化下來后，加入2ml含10％血清低糖培養(yǎng)基終止消化，并將其加入到15ml無菌離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清，加入6ml含10％血清低糖培養(yǎng)基沖懸底部沉淀，并將其接種于6孔板中。待各孔細(xì)胞長滿后，棄去原培養(yǎng)基，梯度加入含嘌呤霉素的含10％血清低糖培養(yǎng)基2ml，各孔嘌呤霉素濃度分別為0、6、7、8、9、10μg/ml。37度、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞每兩天更換一次含相應(yīng)濃度嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，并每天對各孔細(xì)胞生長情況進(jìn)行觀察。4天可以殺死相應(yīng)孔中全部細(xì)胞的嘌呤霉素最低濃度即為最終藥物篩選濃度。圖6是不同濃度嘌呤霉素篩選4天后大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞顯微鏡照片(×100)，其中A:0μg/ml、B:6μg/ml、C:7μg/ml、D:8μg/ml、E:9μg/ml、F:10μg/ml；可見，藥物濃度為9μg/ml時，即可殺死全部細(xì)胞，故最終確定嘌呤霉素篩選濃度為9μg/ml。(6)重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs及轉(zhuǎn)染后嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染前一天，將對數(shù)生長期的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入4～5×104個細(xì)胞(接種密度為細(xì)胞3～4天長滿為宜)；并向每孔中加入100μl的含10％血清的低糖培養(yǎng)基，然后放入37度、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到30％左右時，棄去原培養(yǎng)液，按照步驟(5)實(shí)驗的結(jié)果，以感染復(fù)數(shù)(MOI＝100)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，向各孔中加入10μl病毒液(病毒液為步驟3獲得的病毒原液，其病毒滴度為2×108TU/ml)、10μl終濃度為5μg/ml的ploybrene增強(qiáng)液和80μl的含10％血清的低糖培養(yǎng)基，并將細(xì)胞放回37度、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。待感染后12h棄去原培養(yǎng)液，換回含10％血清的低糖培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染48h后，即可用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，圖7即為慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs48h后熒光顯微鏡(×100)下觀察GFP熒光圖，圖7A:白光視野；圖7B:熒光視野；可見，c-met慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs48h后，熒光顯微鏡下觀察可見熒光，GFP陽性細(xì)胞占總細(xì)胞10％；轉(zhuǎn)染72h后，細(xì)胞換液(換含10％血清的低糖培養(yǎng)基)并向各細(xì)胞培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素(濃度為9μg/ml),藥物篩選周期為一周，一周后在熒光顯微鏡下觀察效果，可見細(xì)胞熒光陽性率達(dá)100％。接著把嘌呤霉素藥物濃度維持在1.8μg/ml，十天后在熒光顯微鏡下繼續(xù)觀察效果，可見細(xì)胞熒光陽性率仍然維持在100％。故獲得穩(wěn)定表達(dá)c-met基因的細(xì)胞株。圖8是慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs篩藥一周后熒光顯微鏡(×100)下觀察GFP熒光圖，其中，圖8A:白光視野，圖8B:熒光視野，可見，篩選一周后熒光陽性率達(dá)100％，即形成穩(wěn)定表達(dá)c-met基因的大鼠BMSCs。(7)Western-blot法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株c-met蛋白表達(dá)情況采用上述相同方法構(gòu)建GFP慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染BMSCs，形成穩(wěn)定表達(dá)GFP的BMSCs。分別取相同細(xì)胞數(shù)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染c-met的BMSCs(步驟(6)獲得的)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP的BMSCs兩組細(xì)胞行Westernblot法檢測。具體方法如下：棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次后吸凈，再加入150ul1×Lysisbuffer(購于碧云天公司)，用移液槍頭吹打至細(xì)胞充分裂解,得到的細(xì)胞裂解樣品轉(zhuǎn)移入EP管中，冰上再裂解細(xì)胞10-15min,接著4℃，12000g，離心5min，放入沸水中水浴10min后,接著4℃，12000g，離心1min，-80℃保存?zhèn)溆?。配?％SDS-PAGE分離膠，配制方法如表7所示：表78％SDS-PAGE分離膠配制體系H2O4.6ml30％PAGE2.7ml1.5mol/LTris(pH8.8)2.5ml10％SDS0.1ml10％APS0.1mlTEMED0.006ml等膠凝固好后，拔去梳子，電泳緩沖液清洗上樣孔，將準(zhǔn)備好的樣品進(jìn)行上樣，上樣完畢后接通電源，核對正負(fù)極后開始電泳，電泳時恒壓80V，2小時。電泳結(jié)束后，使用轉(zhuǎn)移電泳裝置，在4℃，300mA恒流條件下電轉(zhuǎn)150min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(購于millipore公司)。用封閉液(含5％脫脂牛奶的TBST溶液)室溫封閉PVDF膜1h，一抗(兔抗c-met,5ml)孵育2h后，TBST洗膜3次，二抗(驢抗兔IgG,15ml)孵育2h，TBST洗膜3次。采用Amersham公司ECL+plusTMWesternblottingsystem試劑盒進(jìn)行顯色，曝光，成像分析。圖9是Western-blot檢測BMSCs中c-met蛋白表達(dá)情況，其中1為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染c-met的BMSCs組，其蛋白大小為154KD，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染c-met基因BMSCs細(xì)胞株可高效表達(dá)c-met蛋白；2位穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP的BMSCs組。(8)穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs組、穩(wěn)定表達(dá)GFP的BMSCs組和生理鹽水組分別治療肝衰竭SD大鼠72h后三組大鼠肝臟病理改變情況選取6周齡SD雄性大鼠(體重220-260g)15只，分為三組(A、B、C)，每組5只。采用D-氨基半乳糖(劑量900mg/kg，購自Sigma公司)和LPS(劑量10ug/kg，購自Sigma公司)聯(lián)合腹腔注射制造大鼠肝衰竭模型。待造模完成24h后，A組SD大鼠通過尾靜脈注射穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs(劑量為1.4×107個細(xì)胞/kg,溶于1ml生理鹽水中),B組SD大鼠通過尾靜脈注射穩(wěn)定表達(dá)GFP的BMSCs(劑量為1.4×107個細(xì)胞/kg,溶于1ml生理鹽水中)，C組SD大鼠通過尾靜脈注射1ml生理鹽水。待注射完成72h后，頸椎脫臼法處死三組SD大鼠，分別取出肝臟放于4％甲醛(購自西隴化工股份有限公司)中浸泡固定，HE染色觀察三組SD大鼠肝臟病理改變。圖10是穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs組、穩(wěn)定表達(dá)GFP的BMSCs組和生理鹽水組分別治療肝衰竭SD大鼠72h后三組肝臟病理圖(A:穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs治療組肝臟病理圖(×100),B:穩(wěn)定表達(dá)GFP的BMSCs治療組肝臟病理圖(×100)，C:生理鹽水治療組肝臟病理圖(×100)。從三組病理圖可見，穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs治療組肝臟病理未見明顯肝細(xì)胞變性及大片肝細(xì)胞壞死和炎性浸潤，穩(wěn)定表達(dá)GFP的BMSCs治療組肝臟病理可見肝細(xì)胞變性、水腫和炎性浸潤，未見大片肝細(xì)胞壞死，而生理鹽水治療組肝臟病理可見明顯肝細(xì)胞變性、水腫及大片肝細(xì)胞壞死和炎性浸潤。表明A組SD大鼠治療效果最好。實(shí)施例2穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs組、穩(wěn)定表達(dá)GFP的BMSCs組和生理鹽水組分別治療肝衰竭SD大鼠后大鼠生存率選取6周齡SD雄性大鼠(體重220-260g)18只，分為三組(A、B、C)，每組6只。采用D-氨基半乳糖(劑量900mg/kg，購自Sigma公司)和LPS(劑量10ug/kg，購自Sigma公司)聯(lián)合腹腔注射制造大鼠肝衰竭模型。待造模完成24h后，A組SD大鼠通過尾靜脈注射穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs(劑量為1.4×107個細(xì)胞/kg,溶于1ml生理鹽水中),B組SD大鼠通過尾靜脈注射穩(wěn)定表達(dá)GFP的BMSCs(劑量為1.4×107個細(xì)胞/kg,溶于1ml生理鹽水中)，C組SD大鼠通過尾靜脈注射1ml生理鹽水。然后觀察三組SD大鼠的生存情況。圖11是穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs組、穩(wěn)定表達(dá)GFP的BMSCs組和生理鹽水組三組SD大鼠生存率曲線圖，由圖可見，1周后，A組(c-met-BMSCs組)SD大鼠死亡1只，B組(GFP-BMSCs組)SD大鼠死亡3只，C組(生理鹽水組)SD大鼠全部死亡。表明A組SD大鼠治療效果最好。SEQUENCELISTING<110>朱傳龍<120>構(gòu)建穩(wěn)定高效表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法<130>4<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>56<212>DNA<213>人工合成<400>1gaggatccccgggtaccggtcgccaccatgaaggctcccaccgcgctggcacctgg56<210>2<211>47<212>DNA<213>人工合成<400>2tccttgtagtccatacctgtgttcgcttcgccgtcaatgttgtcttg47<210>3<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>3ccagtttcccaactcctctcag22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>4ccttatagtccttatcatcgtc22當(dāng)前第1頁1 2 3