本發(fā)明涉及DNA遺傳工程和小型豬轉(zhuǎn)基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種含有人SLC3A2基因的慢病毒載體的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)基因動物模型在了解人類疾病的發(fā)病過程中起著重要的作用，在開發(fā)新型藥物中也同樣有不容忽視的作用。經(jīng)典的轉(zhuǎn)基因小鼠模型在生物醫(yī)學(xué)的研究歷程中有重要的作用。然而，小鼠和人類在包括生理特性和基因表達(dá)等許多方面是不同的。因此，小鼠模型在某些情況下不能充分模仿人類基本疾病類型，所以大型動物模型仍然是迫切需要的。在過去20年，轉(zhuǎn)基因小型豬越來越成為研究人類疾病和其他生物學(xué)應(yīng)用的重要動物模型。

病毒載體是提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)的一個有效途徑。慢病毒可以感染分裂和非分裂細(xì)胞。并且可以將外源DNA插入到感染細(xì)胞的基因組中。慢病毒使插入的基因序列容量較大，而且這類病毒載體插入的基因能夠避免基因沉默并且能在體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，能在整合酶基因突變喪失功能時整合，所以生物安全性較高。研究發(fā)現(xiàn)，慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后比逆轉(zhuǎn)錄病毒的致癌性低。腺病毒載體攜帶的目的基因不會整合到宿主細(xì)胞的基因組中，且在傳代的細(xì)胞中將基因信息丟失，同時一些腺病毒基因產(chǎn)物也會致細(xì)胞凋亡。研究表明慢病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒一樣能在體外感染雄性小鼠生殖系細(xì)胞。另一項研究報道，采用慢病毒載體感染生殖干細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因大鼠，并且穩(wěn)定遺傳到了F2代。迄今為止，已經(jīng)由慢病毒轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的各種轉(zhuǎn)基因動物包括小鼠、魚、豬、非人靈長類動物等。相比傳統(tǒng)的原核DNA顯微注射或體細(xì)胞克隆，慢病毒基因轉(zhuǎn)移的效果要高4到8倍，并且在90％以上的第一代轉(zhuǎn)基因動物上都能檢測到轉(zhuǎn)基因表達(dá)。因此，開發(fā)一個可用于轉(zhuǎn)基因小型豬開發(fā)的新載體及其構(gòu)建方法將是解決生產(chǎn)實(shí)踐中育種時間長的有效方法。

溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SLC)基因家族中的SLC3A2、SLC7A1、SLC12A8、SLC22A16、SLC22A 1、SLC22A 2、SLC22A 3基因及其編碼的蛋白質(zhì)可參與多胺的跨膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。SLC3A2和GGTL3B可與細(xì)胞內(nèi)CT120A相互作用，可能擁有與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及谷胱苷肽代謝有關(guān)的重要的生理功能。CT120是在染色體17p13.3高頻突變區(qū)通過電子克隆及RACE方法克隆并鑒定出的一個人新基因，是一個與乳腺癌及肺癌等發(fā)生發(fā)展相關(guān)的細(xì)胞生長重要調(diào)節(jié)因子。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是一種含有SLC3A2基因的慢病毒載體及其構(gòu)建方法，以解決針對目的基因生長功能的實(shí)踐驗證和轉(zhuǎn)基因小型豬開發(fā)新方法的問題。

本發(fā)明的第一個方面提供一種含有SLC3A2基因的慢病毒載體，其中SLC3A2基因如 序列表中序列1所示，該基因編碼的氨基酸序列如序列2所示。

本發(fā)明的另一個方面提供含有SLC3A2基因的慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(A)用PCR方法擴(kuò)增SLC3A2基因；

(B)將目的基因SLC3A2克隆到慢病毒載體中；

(C)制備感受態(tài)細(xì)胞；

(D)將步驟(B)制備的慢病毒載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；

(E)從平板上挑取克隆菌落，小抽質(zhì)粒并做鑒定挑出陽性克??；

(F)純化提取的質(zhì)粒，將抽提好的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

上述構(gòu)建方法的詳細(xì)操作過程如下：

PCR方法擴(kuò)增SLC3A2基因：oligo設(shè)計，目的基因SLC3A2序列片段根據(jù)編號NM_001012662.2設(shè)計，上下游引物分別加上NotI和BamHII及保護(hù)堿基，用于載體的亞克隆。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。將oligo溶解成50μM，將oligo分別取相同體積至一1.5ml離心管，混合均勻，配成oligo mix。用配制好的oligo mix進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，用Y164-1和Y164-62進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，模板為第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物。第一輪PCR可得到混有目的基因的非單一條帶的PCR產(chǎn)物混合物，然后再用第一輪的PCR產(chǎn)物為模板，通過第二輪PCR則可獲得單一的目的基因條帶。PCR反應(yīng)完成后，利用電泳并切膠回收SLC3A2基因片段。

目的基因SLC3A2克隆到載體LV5中：用NotI和BamHI對SLC3A2基因片段進(jìn)行酶切，37℃酶切2小時；用NotI和BamHI對載體LV5進(jìn)行酶切，37℃酶切2小時；電泳后，用NA凝膠回收試劑盒回收SLC3A2基因片段和載體LV5；用T4 DNA ligase連接雙酶切得到的SLC3A2基因片段和線性化的載體，22℃連接2小時。

制備感受態(tài)細(xì)胞：從-70℃冰箱保存的細(xì)菌接種到固體培養(yǎng)基LB中，然后在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h；在平板上挑取一個單菌落直徑約2mm，再接種到一個1L燒瓶其中含有100mlLB培養(yǎng)基，接著在37℃劇烈振蕩培養(yǎng)3h；將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個無菌，用冰預(yù)冷的1.5ml EP管中，冰上放置10min后，使培養(yǎng)基冷卻到0℃。同時用另一管作轉(zhuǎn)化的陰性對照；然后在4℃，13000rpm，30s條件下離心；將培養(yǎng)液，管反轉(zhuǎn)1min，盡量使管培養(yǎng)液倒干凈；添加前的0.1mol/L cach500μL冷卻，在冰上5min重懸沉淀；再次在4℃，13000rpm，30s條件下離心；接著倒出培養(yǎng)液，最后的培養(yǎng)液通過把EP管倒置將其流盡；加200μl提前冰預(yù)冷0.1mol/LCach，重懸沉淀后置于冰上30min；所得產(chǎn)物可用于轉(zhuǎn)化。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞：從-70℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，將裝有其離心管冰上放置4min，待細(xì)胞解凍后，加入10μl連接產(chǎn)物，輕柔混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min；將離心 管放到42℃的水浴鍋中放好的試管架上，在90s后，取出離心管；快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻3min；向每支離心管加入800μl不含抗生素的LB培養(yǎng)基，然后將離心管轉(zhuǎn)移到37℃搖床，250轉(zhuǎn)/分鐘，培育45min使細(xì)菌復(fù)蘇；取200μl培育后的細(xì)胞均勻涂布于LB平板上(含50μg/ml kanamycin)；等平板上液體消失后，將平板倒置放置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16h。

從平板上挑取克隆菌落，小抽質(zhì)粒并做鑒定挑出陽性克?。簭呐囵B(yǎng)好的平板上挑取4個單獨(dú)、飽滿的菌落，置于含有5ml(含50μg/ml Kanamycin)LB培養(yǎng)基的試管中；將上述試管置于細(xì)菌搖床中培養(yǎng)，37℃，250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)16小時；將培養(yǎng)好的菌液，用質(zhì)粒小提試劑盒。

純化提取的質(zhì)粒：進(jìn)行瓊脂糖膠/溴化乙錠電泳分析PCR產(chǎn)物；確定PCR產(chǎn)物反應(yīng)的量，將樣品轉(zhuǎn)至干凈的EP管，加4倍體積的Buffer CP；渦旋，使之徹底混勻，收集完全后，可短暫離心；將DNA結(jié)合柱放入已準(zhǔn)備好的2ml的收集管；將上述樣品放在DNA結(jié)合柱中，在室溫條件下，離心10000g，1min；棄液體，再將DNA結(jié)合柱放到同樣的收集管中；加700μl稀釋過的DNA Wash Buffer混勻，在室溫條件下，10000g，離心1min；棄液體，重復(fù)(7)；棄去液體，將結(jié)合柱在13000g條件下離心2min；將DNA結(jié)合柱放入一個干凈的1.5ml EP管中，加30μl Elution Buffer到DNA結(jié)合柱基質(zhì)使其侵沒濕潤，室溫下靜置1min，在13000g離心1min。丟棄DNA結(jié)合柱，將液體收集到1.5mlEP管中，—20℃保存；收集并鑒定。

將抽提好的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

酶切37℃，1小時后電泳，在目的條帶大小對應(yīng)區(qū)域有酶切得到的條帶對應(yīng)的克隆即為陽性克隆。

重組質(zhì)粒測序驗證并大量抽提：取200μl陽性克隆對應(yīng)的菌液送測序，將測序結(jié)果與目的基因序列進(jìn)行比對，插入序列100％匹配，證明重組載體構(gòu)建成功。

慢病毒包裝及病毒滴度檢測：感染前一天，取293T細(xì)胞傳代進(jìn)入24孔板，每孔細(xì)胞接種細(xì)胞數(shù)為1*10⁵個。培養(yǎng)基用正常的DMEM+10％FBS即可；分別吸取病毒10μl，1μl，0.1μl加入到各一個細(xì)胞培養(yǎng)孔中，不需要換細(xì)胞液。病毒可以先稀釋，再加入；2天后，丟掉細(xì)胞上清。將細(xì)胞收集下來，293T細(xì)胞基因組。以得到的基因組為模板，定量其中的內(nèi)參基因BAC和病毒序列WPRE，通過相對定量的方法用2^-ΔΔCt法計算病毒基因組數(shù)和細(xì)胞基因組數(shù)的比例。每個樣品每個基因重復(fù)測兩次；引物序列和2^-ΔΔCt法；如當(dāng)定量PCR的Ct值大于30，說明病毒基因組很少，數(shù)據(jù)的偏差會較大，所以這樣的數(shù)據(jù)不采用；因為使用Taqman探針，故不進(jìn)行熔解曲線分析。

引物序列：人基因組特異引物和探針(BAC)，5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’ (forward primer)，5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’(reverse primer)，5’-VIC-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-TAMRA-3’(probe)，病毒基因組特異引物和探針(WPRE)，5’-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3’(forward primer)，5’-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3’(reverse primer)，5’-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3’(probe)。

附圖說明

圖1SLC3A2 PCR產(chǎn)物電泳圖。

M:DNA Marker；1，2，3，4：均為兩次PCR后產(chǎn)物。

圖2SLC3A2基因全長測序部分結(jié)果。

圖3重組載體LV5質(zhì)粒圖譜。

圖4重組質(zhì)粒酶切鑒定圖。

M:DNA Marker；1：LV5-SLC3A2雙酶切鑒定。

圖5LV5-SLC3A2雙酶切鑒定測序結(jié)果。

圖6慢病毒載體與精子孵育不同時間SLC3A2的表達(dá)水平。

與1h比較，**P<0.01。

M：DNA Marker；1：慢病毒載體與精子孵育1h；2慢病毒載體與精子孵育2h；3:慢病毒載體與精子孵育3h；4：慢病毒載體與精子孵育4h。

圖7免疫熒光檢測慢病毒載體與精子孵育不同時間SLC3A2的表達(dá)。

A,B：慢病毒載體與精子孵育1h；C,D:慢病毒載體與精子孵育2h；E,F:慢病毒載體與精子孵育3h；G,H：慢病毒載體與精子孵育4h。A,C,E,G在光學(xué)顯微鏡下觀測(20×)，B,D,F,H在波長為570nm的熒光顯微鏡下觀察(20×)。

圖8不同濃度慢病毒載體與精子孵育后SLC3A2的表達(dá)水平。

與10⁴IU/ml比較，**P<0.0。

M：DNA Marker；1：0IU/ml慢病毒載體；2：10⁴IU/ml慢病毒載；3:10⁵IU/ml.慢病毒載體；4：10⁶IU/ml慢病毒載體。

圖9免疫熒光檢測不同濃度的慢病毒載體與精子孵育后SLC3A2的表達(dá)水平。

A,B：0IU/ml慢病毒載體；C,D：10⁴IU/ml慢病毒載體；E,F:10⁵IU/ml.慢病毒載體；G,H：10⁶IU/ml慢病毒載體。A,C,E,G在光學(xué)顯微鏡下觀測(20×)，B,D,F,H在波長為570nm的熒光顯微鏡下觀察(20×)。

圖10檢測不同溫度下慢病毒載體與精子孵育SLC3A2的表達(dá)水平。

M：DNA Marker；1：17℃慢病毒載體與精子孵育；2：25℃慢病毒載體與精子孵育；3:37℃ 慢病毒載體與精子孵育。

圖11在不同溫度條件慢病毒載體與精子孵育SLC3A2的表達(dá)水平

A,B：17℃慢病毒載體與精子孵育；C,D：25℃慢病毒載體與精子孵育；3:E,F 37℃慢病毒載體與精子孵育。A,C,E在光學(xué)顯微鏡下觀測(20×)，B,D,F在波長為570nm的熒光顯微鏡下觀察(20×)。

圖12不同濃度Polybrene與慢病毒載體和精子共孵育SLC3A2的表達(dá)水平。

與5μg/mL polybrene比較，^**P<0.01。

圖13不同濃度Polybrene對慢病毒載體和精子共孵育的影響。

A,B：0μg/mL polybrene；C,D：5μg/mL polybrene；E,F:10μg/mL polybrene；G,H：15μg/mL polybrene。A,C,E,G在光學(xué)顯微鏡下觀測(20×)，B,D,F,H在波長為570nm的熒光顯微鏡下觀察(20×)。

圖14慢病毒載體與精子孵育不同時間對精子活力的影響。

和1h組相比，^*P<0.05，^**P<0.01。

圖15不同濃度的慢病毒載體與精子孵育對精子活力的影響。

與10⁴IU/ml比較，^**P<0.01。

圖16在不同溫度下慢病毒載體與精子孵育對精子活力的影響。

與17℃組比較，^*P<0.05。

圖17不同濃度Polybrene與慢病毒載體和精子共孵育對精子細(xì)胞活力的影響。

與5μg/mL polybrene比較，^**P<0.01。

具體實(shí)施方式

PCR方法擴(kuò)增SLC3A2基因：oligo設(shè)計，目的基因SLC3A2序列片段根據(jù)編號NM_001012662.2設(shè)計，上下游引物分別加上NotI和BamHII及保護(hù)堿基，用于載體的亞克隆，SLC3A2基因的堿基序列如下：

引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

將oligo溶解成50μM，將oligo分別取相同體積至一1.5ml離心管，混合均勻，配成oligo mix。

用配制好的oligo mix進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，PCR體系如下：

反應(yīng)條件

用Y164-1和Y164-62進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，模板為第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物。

PCR體系如下：

反應(yīng)條件

第一輪PCR可得到混有目的基因的非單一條帶的PCR產(chǎn)物混合物，然后再用第一輪的PCR產(chǎn)物為模板，通過第二輪PCR則可獲得單一的目的基因條帶。條帶大小約在2000bp左右，沒有非特異性條帶產(chǎn)生。而目的基因片段大小為1896bp(圖1)。PCR反應(yīng)完成后，利用電泳并切膠回收SLC3A2基因片段。

目的基因SLC3A2克隆到載體LV5中

用NotI和BamHI對SLC3A2基因片段進(jìn)行酶切，37℃酶切2小時，酶切體系如下：

用NotI和BamHI對載體LV5進(jìn)行酶切，37℃酶切2小時，酶切體系如下：

電泳后，用DNA凝膠回收試劑盒回收SLC3A2基因片段和載體LV5。

用T4 DNA ligase連接雙酶切得到的SLC3A2基因片段和線性化的載體，22℃連接2小時，連接體系如下：

制備感受態(tài)細(xì)胞：從-70℃冰箱保存的細(xì)菌接種到固體培養(yǎng)基LB中，然后在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h；在平板上挑取一個單菌落直徑約2mm，再接種到一個1L燒瓶其中含有100mlLB培養(yǎng)基，接著在37℃劇烈振蕩培養(yǎng)3h；將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個無菌，用冰預(yù)冷的1.5ml EP管中，冰上放置10min后，使培養(yǎng)基冷卻到0℃。同時用另一管作轉(zhuǎn)化的陰性對照；然后在4℃，13000rpm，30s條件下離心；將培養(yǎng)液，管反轉(zhuǎn)1min，盡量使管培養(yǎng)液倒干凈；添加前的0.1mol/L cach500μL冷卻，在冰上5min重懸沉淀；再次在4℃，13000rpm，30s條件下離心；接著倒出培養(yǎng)液，最后的培養(yǎng)液通過把EP管倒置將其流盡；加200μl提前冰預(yù)冷0.1mol/LCach，重懸沉淀后置于冰上30min；所得產(chǎn)物可用于轉(zhuǎn)化。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞：從-70℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，將裝有其離心管冰上放置4min，待細(xì)胞解凍后，加入10μl連接產(chǎn)物，輕柔混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min；將離心管放到42℃的水浴鍋中放好的試管架上，在90s后，取出離心管；快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻3min；向每支離心管加入800μl不含抗生素的LB培養(yǎng)基，然后將離心管轉(zhuǎn)移到37℃搖床，250轉(zhuǎn)/分鐘，培育45min使細(xì)菌復(fù)蘇；取200μl培育后的細(xì)胞均勻涂布于LB平板上(含50μg/ml kanamycin)；等平板上液體消失后，將平板倒置放置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16h。

從平板上挑取克隆菌落，小抽質(zhì)粒并做鑒定挑出陽性克?。簭呐囵B(yǎng)好的平板上挑取4個 單獨(dú)、飽滿的菌落，置于含有5ml(含50μg/ml Kanamycin)LB培養(yǎng)基的試管中。將上述試管置于細(xì)菌搖床中培養(yǎng)，37℃，250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)16小時。將培養(yǎng)好的菌液，用質(zhì)粒小提試劑盒：:挑取單菌落，在到含有抗生素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃搖床培養(yǎng)過夜；室溫下，1000g離心1min，留4.5ml菌液，棄液體；添加250μl Solution I用微型移液槍混勻(使細(xì)胞完全懸浮)；加250μl Solution II輕輕反轉(zhuǎn)5次，不可劇烈振動，培養(yǎng)2min；加入350μl Solution III立即翻轉(zhuǎn)，充分混勻，直到有白色絮狀沉淀產(chǎn)生；在室溫，13000g的條件下離心10min，待有白色貼壁沉淀生成，馬上在14000g條件下離心15min；去上清液，吸到結(jié)合柱中，并置于2ml的收集管中，不要吸入沉淀，在室溫下離心1000g，1min；棄液體，再放置到2ml收集管中，加500μl Buffer HB，在室溫條件下離心，10000g，1min；棄液體，方知道2ml收集管中，加700μl DNA wash Buffer(稀釋)。在室溫條件下離心10000g，1min，棄液體；重復(fù)一次；離心DNA結(jié)合柱2min，13000g，甩干結(jié)合柱基質(zhì)使其干燥，使殘余液體不下來；結(jié)合柱放在1.5mlEP管中，加50μl Elution Buffer即無菌去離子水到結(jié)合柱的基質(zhì)上，在室溫條件下靜置1min，然后離心，13000g，1min；收集鑒定：DNA純度＝A₂₆₀×50×稀釋倍數(shù)μg/ml。

純化提取的質(zhì)粒：進(jìn)行瓊脂糖膠/溴化乙錠電泳分析PCR產(chǎn)物；確定PCR產(chǎn)物反應(yīng)的量，將樣品轉(zhuǎn)至干凈的EP管，加4倍體積的Buffer CP；渦旋，使之徹底混勻，收集完全后，可短暫離心；將DNA結(jié)合柱放入已準(zhǔn)備好的2ml的收集管；將上述樣品放在DNA結(jié)合柱中，在室溫條件下，離心10000g，1min；棄液體，再將DNA結(jié)合柱放到同樣的收集管中；加700μl稀釋過的DNA Wash Buffer混勻，在室溫條件下，10000g，離心1min；棄液體，重復(fù)(7)；棄去液體，將結(jié)合柱在13000g條件下離心2min；將DNA結(jié)合柱放入一個干凈的1.5ml EP管中，加30μl Elution Buffer到DNA結(jié)合柱基質(zhì)使其侵沒濕潤，室溫下靜置1min，在13000g離心1min。丟棄DNA結(jié)合柱，將液體收集到1.5mlEP管中，—20℃保存；收集并鑒定：DNA純度＝A₂₆₀×50×稀釋倍數(shù)μg/ml。

將抽提好的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，每管反應(yīng)體系如下：

酶切37℃，1小時后電泳，在目的條帶大小對應(yīng)區(qū)域有酶切得到的條帶對應(yīng)的克隆即為陽性克隆。

重組質(zhì)粒測序驗證并大量抽提：取200μl陽性克隆對應(yīng)的菌液送測序，將測序結(jié)果(圖 2)與目的基因序列進(jìn)行比對，插入序列100％匹配，證明重組載體構(gòu)建成功(圖5)。對酶切重組載體LV5-SLC3A2鑒定：酶切37℃，1小時后電泳，在目的條帶大小對應(yīng)區(qū)域有酶切得到的條帶對應(yīng)的克隆即為陽性克隆。雙酶切后得到一條約為10000bp左右的條帶，和2000bp左右的條帶，且沒有其他非特異性條帶(圖4)。經(jīng)過膠回收，純化產(chǎn)物，測序結(jié)果顯示，2000bp左右的條帶即為目的基因條帶。

慢病毒包裝及病毒滴度檢測：感染前一天，取293T細(xì)胞傳代進(jìn)入24孔板，每孔細(xì)胞接種細(xì)胞數(shù)為1*10⁵個。培養(yǎng)基用正常的DMEM+10％FBS即可；分別吸取病毒10μl，1μl，0.1μl加入到各一個細(xì)胞培養(yǎng)孔中，不需要換細(xì)胞液。病毒可以先稀釋，再加入；2天后，丟掉細(xì)胞上清。將細(xì)胞收集下來，293T細(xì)胞基因組：收集細(xì)胞在1.5mlEP管中，在室溫條件下，12000g條件下離心15min；棄去上清后，加入400μl 1M Tris-HCl，200ul EDTA，100μl 10％SDS，10μl蛋白酶K工作液，混勻后，在37℃溫育過夜；取出EP管冷卻至室溫后，充分混勻振蕩后加400μl苯酚氯仿異戊醇溶液；混勻后，在12500pm，室溫條件下，振蕩1h；取出EP管，上下顛倒混勻3min，然后在室溫條件下，10000g離心6min；小心吸取上清至另一EP管；加500μlNaCl和2倍體積無水乙醇；充分混勻后可見白色沉淀，并挑出至另一EP管；用75％乙醇洗滌2次；室溫干燥10min，直至沒有乙醇為止；加50μl無菌水溶解，放置到—20℃冰箱保存。

滴度報告：

吸取3組慢病毒上清液，經(jīng)過熒光定量PCR測定，C值分別為16.24，1.21，0.21。經(jīng)過計算得到慢病毒載體滴度分別為3.03×10⁸IU/ml，2.06×10⁸IU/ml，1.02×10⁸IU/ml；平均滴度為2.03×10⁸IU/ml。結(jié)果如下表所示。

表1 慢病毒載體滴度測定

以得到的基因組為模板，定量其中的內(nèi)參基因BAC和病毒序列WPRE，通過相對定量的方法用2^-ΔΔCt法計算病毒基因組數(shù)和細(xì)胞基因組數(shù)的比例。每個樣品每個基因重復(fù)測兩次。

引物序列和2^-ΔΔCt法；如當(dāng)定量PCR的Ct值大于30，說明病毒基因組很少，數(shù)據(jù)的偏差會較大，所以這樣的數(shù)據(jù)不采用；因為使用Taqman探針，故不進(jìn)行熔解曲線分析。

2^-ΔΔCt法：假設(shè)每次擴(kuò)增的效率都是一致的，那么：NC_t＝N₀*(1+E)^Ct

N₀：初始模版熒光值NC_t：經(jīng)過Ct個循環(huán)擴(kuò)增后的的熒光值，即閾值，我們假定它不變E：目的片斷的擴(kuò)增效率

兩邊同時取對數(shù)，得：Log(NC_t)＝Ct*Log(1+E)+Log(N₀)；Ct＝-Log(N₀)*1/Log(1+E)+ Log(N C_t)/Log(1+E)。式中，Log(N Ct)/Log(1+E)為常數(shù)，Log(N₀)為自變量，Ct為應(yīng)變量。以Ct對Log(N₀)作圖,-1/Log(1+E)為其斜率。設(shè)斜率為S，得：S＝-1/Log(1+E)。E＝10^-1/S–1

引物序列：

人基因組特異引物和探針(BAC)，

5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’(forward primer)

5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’(reverse primer)

5’-VIC-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-TAMRA-3’(probe)

病毒基因組特異引物和探針(WPRE)：

5’-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3’(forward primer)

5’-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3’(reverse primer)

5’-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3’(probe)。

反應(yīng)體系

反應(yīng)條件

寧鄉(xiāng)花豬精子與SLC3A2慢病毒載體孵育法：收集精液5ml，添加5ml SFM/BSA后，在37℃條件下培養(yǎng)5min，在25℃，800g條件下離心10min，棄去上清后，在17℃，800g條件下離心10min，徹底干凈的棄去上清后，用5ml SFM/BSA將精子重懸浮，用細(xì)胞計數(shù)板將精子細(xì)胞計數(shù)，每次進(jìn)行下一步實(shí)驗的精子數(shù)量約為1×10⁹個/ml。

根據(jù)不同分組條件，對精子進(jìn)行孵育。

將不同濃度(10⁴IU/ml，10⁵IU/ml，10⁶IU/ml)慢病毒載體與精子細(xì)胞在17℃條件下孵育2h；將10⁵IU/ml慢病毒載體與精子細(xì)胞在17℃條件下，分別孵育不同時間(1h，2h，3h，4h)；10⁵IU/ml慢病毒載體與精子細(xì)胞分別在不同溫度(17℃，20℃，25℃，37℃)下孵育2h；不同濃度(0μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，15μg/mL)的Polybrene分別添加10⁵IU/ml慢病毒載體和精子細(xì)胞在17℃條件下孵育2h。

用PCR檢測精子與慢病毒載體孵育后SLC3A2的表達(dá)

根據(jù)SLC3A2設(shè)計引物，引物由華大基因公司合成

將提取的DNA在如下反應(yīng)體系中檢測。

反應(yīng)條件如下

將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

免疫熒光法檢測精子與慢病毒載體孵育后SLC3A2的表達(dá)：提前用多聚賴氨酸處理6孔板，以備后續(xù)實(shí)驗；用1ml與慢病毒載體孵育后的精子細(xì)胞懸液放入6孔板中，用甲醇固定30min；吸去上清，用PBS洗滌3次；接著用1％BSA的PBS溶液封閉，在4℃冰箱過夜；吸取上清后，用1：1000稀釋后的VGV抗體工作液，孵育1h；去掉上清后，用PBS洗滌3次；在倒置熒光顯微鏡下觀察；用image J圖像分析軟件處理。

慢病毒載體與精子孵育不同時間SLC3A2的表達(dá)

慢病毒載體與精子孵育1h組，并沒有檢測到目的基因，而在2h組，SLC3A2的表達(dá)明顯增加。并且2h，3h，4h檢測到的目的基因水平都沒有差異。在1h，2h，3h，4h各組都能觀察到紅色熒光。而2h，3h，4h各組與1h組相比，相對熒光密度提高，有顯著性差異(P<0.01)。如圖6，7。

不同濃度慢病毒載體與精子孵育后SLC3A2的表達(dá)水平

通過PCR檢測如圖8，在0IU/ml慢病毒載體與精子孵育后，沒有目的基因條帶出現(xiàn)，而在與10⁴IU/ml慢病毒載體孵育后，有條帶出現(xiàn)；在10⁵IU/ml和10⁶IU/ml慢病毒載體與精子孵育后，目的基因水平明顯高于10⁴IU/ml時，沒有顯著差異。在熒光下觀察時如圖9，0IU/ml慢病毒載體與精子孵育后，沒有熒光。10⁴IU/ml、10⁵IU/ml和10⁶IU/ml各組，均有有紅色熒光出現(xiàn)；10⁶IU/ml和10⁵IU/ml組的相對熒光密度都高于10⁴IU/ml組，且有顯著性差異 (P<0.01)。

不同溫度下慢病毒載體與精子孵育SLC3A2的表達(dá)水平

分別在17℃，25℃，37℃條件下慢病毒載體與精子孵育，目的基因的水平并沒有明顯差異如圖10所示。在熒光顯微鏡觀察，慢病毒載體與精子孵育在不同溫度下，相對熒光密度也沒有明顯差異(圖11)。

不同濃度Polybrene與慢病毒載體和精子共孵育SLC3A2的表達(dá)水平

在0μg/mL和5μg/mL polybrene與慢病毒載體和精子共孵育時，目的基因的水平?jīng)]有明顯差異，與加入10μg/mL和15μg/mL polybrene相比目的基因水平低如圖12。在熒光顯微鏡下觀察時(圖13)，0μg/mL和5μg/mL polybrene組的相對熒光密度低于10μg/mL組和15μg/mL組，且有顯著性差異(P<0.01)。

檢測精子活力：吸取孵育后的精子細(xì)胞10μl到990μlSFM培養(yǎng)基中，混勻；在光學(xué)顯微鏡下觀察精子活力即直線運(yùn)動的精子細(xì)胞數(shù)/總精子細(xì)胞數(shù)×100％

隨著慢病毒載體與精子孵育時間增加，精子活力降低：1h和2h組精子細(xì)胞活力沒有顯著性差異(P>0.05)，而3h和4h組與1h和2h組相比精子細(xì)胞活力降低，有顯著性差異(P<0.05)(圖14)。

慢病毒載體的濃度增加，精子活力降低：10⁴IU/ml、10⁵IU/ml和10⁶IU/ml各組與0IU/ml組相比，精子細(xì)胞活力降低有顯著性差異(P<0.01)。并且10⁶IU/ml組的精子細(xì)胞活力顯著低于10⁴IU/ml和10⁵IU/ml組(P<0.01)(圖15)。

溫度增加，精子活力降低：17℃組的精子細(xì)胞活力高于25℃和37℃組，有顯著性差異(P<0.05)(圖16)。

15μg/mL Polybrene降低精子細(xì)胞活力：0μg/mL、5μg/mL和10μg/mL各組間精子活力的差異不明顯。15μg/mL組的精子細(xì)胞活力顯著低于0μg/mL、5μg/mL和10μg/mL各組(P<0.01)(圖17)。