本申請屬于轉(zhuǎn)基因生物新功能的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及于一種DNMT1敲除鼠可提高Btg2蛋白表達水平的新功能。
背景技術(shù)：
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1，即DNMT1，是一種催化DNA胞嘧啶甲基化的關(guān)鍵酶。DNA甲基化是生命體感受外界輸入信號、調(diào)控結(jié)構(gòu)基因表達的重要修飾手段，是表觀遺傳學的主要范疇之一。DNMT1在維持DNA甲基化特征及DNA的復制修復方面都有重要的作用。DNMT1作為一種基因表達的調(diào)控蛋白，其在不同生理條件下的對靶基因選擇的差異最終影響到細胞及組織整體功能的改變。
轉(zhuǎn)基因動物是指通過基因工程的手段使某些基因缺失或增量表達而獲得的動物品種，其中轉(zhuǎn)基因小鼠，又稱基因工程鼠，在現(xiàn)代神經(jīng)生物學、病理學、毒理學等學科的研究中發(fā)揮著不可替代的作用?；蚬こ淌髮ρ芯康鞍组g的相互作用、調(diào)控因子對靶蛋白的作用以及表觀遺傳學的調(diào)控作用均有很大的價值。
Btg2蛋白是一類共調(diào)控蛋白，可增強或抑制轉(zhuǎn)錄因子的活性，該蛋白在調(diào)控細胞周期進程和神經(jīng)基因表達方面起到重要的作用。Btg2在DG區(qū)和室下區(qū)的神經(jīng)再生過程的主要功能是調(diào)控其終末端分化；在小腦的早期神經(jīng)分化過程中，Btg2主要調(diào)控顆粒狀神經(jīng)元的遷移和分化。因此，Btg2是神經(jīng)發(fā)育過程中的一種重要的周期調(diào)控蛋白，其嚴謹?shù)谋磉_水平指示著正常的神經(jīng)發(fā)育進程。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本申請所用的基因工程鼠，即敲除了DNMT1基因的C57BL/6J小鼠，購自北京唯尚立德生物科技有限公司。用于對照的C57BL/6J小鼠購自安徽醫(yī)科大學。
敲除了DNMT1基因的C57BL/6J小鼠，即所述的“基因工程鼠”，它的大腦皮層的Btg2蛋白的表達水平提高到正常的對照鼠的1.9倍。
蛋白提取和檢測的過程如下：
將培養(yǎng)至1個月的基因工程鼠及對照的C57BL/6J小鼠各6只處死并分別取出其左腦的大腦皮層組織。將上述皮層組織用眼科剪剪成小塊后用勻漿機進行勻漿，充分研碎，將組織勻漿化。將勻漿液轉(zhuǎn)入1.5 ml的離心管中，12000 rpm在4oC下離心15 min。離心管中的液體分三層，提取中間無色液相，轉(zhuǎn)入新的離心管中。
將提取的蛋白首先通過本領(lǐng)域常規(guī)的BCA法測定其蛋白濃度。隨后用等體積的2×的SDS 上樣緩沖液混合后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳的條件設(shè)定為電壓120V，電泳時間1.5 h。隨后用硝酸纖維素膜進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為60 V轉(zhuǎn)移2 h。將膜清洗后浸泡入含Btg2抗體的溶液中4oC孵育過夜。隨后經(jīng)多次洗凈后使用本領(lǐng)域常用的二抗進行孵育，最后進行化學顯影，完成蛋白印跡實驗。所獲得的顯影條帶的密度值測定及相互間的比較使用ImageJ軟件來完成。
實驗組和對照組所獲得的Btg2蛋白的表達量的比較如圖1所示。
從圖1中可以看出，基因工程鼠的Btg2蛋白的表達量是對照鼠的1.9倍。
本申請證實了在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中DNMT1對Btg2的表達水平有顯著的調(diào)控作用，表明了DNMT1的缺失導致了包括神經(jīng)再生調(diào)控蛋白的表達異常，證明了DNMT1在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起到不可或缺的調(diào)控作用。
附圖說明
圖1 轉(zhuǎn)基因鼠和對照鼠大腦皮層的Btg2蛋白的表達水平。
Control指對照鼠；DNMT-KO指本申請所述的基因工程鼠。
具體實施方式
實施例1
蛋白提取和檢測的過程如下：
將培養(yǎng)至1個月的基因工程鼠及對照的C57BL/6J小鼠各6只處死并分別取出其左腦的大腦皮層組織。將上述皮層組織用眼科剪剪成小塊后用勻漿機進行勻漿，充分研碎，將組織勻漿化。將勻漿液轉(zhuǎn)入1.5 ml的離心管中，12000 rpm在4oC下離心15 min。離心管中的液體分三層，提取中間無色液相，轉(zhuǎn)入新的離心管中。
將提取的蛋白首先通過本領(lǐng)域常規(guī)的BCA法測定其蛋白濃度。隨后用等體積的2×的SDS 上樣緩沖液混合后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳的條件設(shè)定為電壓120V，電泳時間1.5 h。隨后用硝酸纖維素膜進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為60 V轉(zhuǎn)移2 h。將膜清洗后浸泡入含Btg2抗體的溶液中4oC孵育過夜。隨后經(jīng)多次洗凈后使用本領(lǐng)域常用的二抗進行孵育，最后進行化學顯影，完成蛋白印跡實驗。所獲得的顯影條帶的密度值測定及相互間的比較使用ImageJ軟件來完成。