本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種兩步乳液PCR方法，具體涉及一種用于微量目的基因片段擴(kuò)增的兩步乳液PCR方法。

背景技術(shù)：

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR）是一種體外放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它的最大特點(diǎn)，是能將的DNA大幅增加。但擴(kuò)增微量目的片段時(shí)，特別是有相似干擾片段存在時(shí)，擴(kuò)增的特異性較差，往往不能擴(kuò)增出目的片段?，F(xiàn)有的PCR改進(jìn)方法如巢式PCR和有限稀釋半巢式PCR法（Anticancer Res. 2007; 27(3B):1459-1463）等。巢式PCR應(yīng)用兩套引物進(jìn)行兩步PCR來擴(kuò)增特異性的DNA片斷，第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對(duì)引物稱為巢式引物，結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異，但巢式PCR仍然不能避免非目的產(chǎn)物和其它雜質(zhì)的干擾，特別是在目的片段濃度極微量的時(shí)候，第一對(duì)引物往往不能擴(kuò)增出來產(chǎn)物。有限稀釋半巢式PCR方法通過有限稀釋把目的片段稀釋10倍，并分成10份，降低了干擾物的比例，并同時(shí)進(jìn)行半巢式PCR，10份中有一份陽(yáng)性就可說明有目的片段存在。該法結(jié)合有限稀釋法的抗干擾性和巢式PCR的特異性優(yōu)點(diǎn)來提高擴(kuò)增微量目的片段的成功率，雖然在一定程度上提高檢出率，但還是不能完全避免非目的產(chǎn)物的干擾。

乳液PCR是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR反應(yīng)所有成分的水相與油相按一定比例混合，在一定轉(zhuǎn)速攪拌力的作用下形成無數(shù)個(gè)大小相對(duì)均勻穩(wěn)定且在油相中懸浮的小水滴，由于油相的阻隔，這些小水滴構(gòu)成了獨(dú)立的PCR反應(yīng)空間，使每個(gè)乳液顆粒中的PCR反應(yīng)能夠獨(dú)立進(jìn)行而互不干擾，同時(shí)能有效的把干擾物和模板隔開，相當(dāng)于無限稀釋。其最大特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行DNA擴(kuò)增，最理想的狀態(tài)下每個(gè)小水滴中只含有一個(gè)DNA模板，因此小水滴中的PCR反應(yīng)不會(huì)受到競(jìng)爭(zhēng)干擾。但當(dāng)目的片段的模板量較少時(shí)只有少量的乳液顆粒中有模板，如只有萬分之一的乳液顆粒中有模板時(shí)，那么最后的產(chǎn)物總量只有常規(guī)PCR的萬分之一，不能通過常規(guī)電泳等手段進(jìn)行檢測(cè)。

Chai C等（Food Science & Biotechnology, 2015, 24:1559-1563.111）通過聯(lián)合乳液PCR和常規(guī)PCR解決乳液PCR在擴(kuò)增低濃度目的片段時(shí)產(chǎn)物量少的問題，提高了檢測(cè)靈敏度。但該法在第二步擴(kuò)增前需要先對(duì)第一步乳液PCR產(chǎn)物進(jìn)行乙醚破乳化、試劑盒提純等操作，這些操作不僅繁瑣，而且回收效率等不到保障，產(chǎn)物易丟失，特別是第一步乳液PCR產(chǎn)物量極少時(shí)，有可能回收不到產(chǎn)物。

本發(fā)明建立的兩步乳液PCR方法，第一步通過油包水的乳液PCR把不同的模板分開擴(kuò)增特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，第二步把油包水的乳液轉(zhuǎn)換成水包油的PCR進(jìn)行二次擴(kuò)增，進(jìn)一步提高產(chǎn)量，提高基因檢測(cè)的靈敏度。該法不僅具備乳液PCR抗干擾、特異性高的特點(diǎn)，還具備乳液PCR結(jié)合常規(guī)PCR法高產(chǎn)量的特點(diǎn)，同時(shí)還沒有應(yīng)用乙醚破乳化、提純等過程，不僅簡(jiǎn)單方便，還更經(jīng)濟(jì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于微量目的基因片段擴(kuò)增的兩步乳液PCR方法，該法先通過油包水的乳液PCR特異性擴(kuò)增，少量增加目的片段，接著通過加入不含模板的反應(yīng)液使油包水轉(zhuǎn)換成水包油的乳液PCR再次擴(kuò)增，大量增加目的片段，從而提高檢測(cè)特異性和靈敏度。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供兩步乳液PCR檢測(cè)方法，按照下述步驟進(jìn)行：

（1）油包水乳液顆粒的制備：

水相為PCR反應(yīng)液，油相組成為在礦物油中加入占總體積為4.5% (v/v) 司盤80、占總體積為0.4% (v/v) 吐溫80、占總體積為0.05% (v/v) 聚乙二醇辛基苯基醚，其余為礦物油，3000 rpm漩渦震蕩5 min；油包水乳液顆粒的制作：把0.1 mL含模板的PCR反應(yīng)液，以每滴8~10 μL的速度勻速滴入含0.2 mL油相的2 mL平底冷凍管中，滴入時(shí)間控制在1 min左右，同時(shí)用攪拌子為8×1.5 mm的磁力攪拌器以1300 rpm的速度攪拌，當(dāng)水相加完后繼續(xù)攪拌5 min，得到0.3 mL的油包水乳液，分裝入PCR反應(yīng)管中；

（2）第一步PCR擴(kuò)增：

把步驟（1）中的分裝的裝有油包水乳液的PCR反應(yīng)管，置入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，如擴(kuò)增乙型肝炎病毒核酸則擴(kuò)增條件為94 ℃變性2分鐘，然后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)94 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸3 min。；

（3）水包油乳液顆粒的制備：

把步驟（2）中的擴(kuò)增產(chǎn)物14000g/min，0℃，離心10min，棄上層油相，加入適量步驟（1）中不含模板的PCR反應(yīng)液，3000 rpm漩渦震蕩，當(dāng)油相充分散開，2000 rpm繼續(xù)震蕩2 min，1000 rpm離心20 s，制成水包油乳化液。

（4）第二步PCR擴(kuò)增：

把步驟（3）中的水包油乳化液的PCR反應(yīng)管，置入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，如擴(kuò)增乙型肝炎病毒核酸則擴(kuò)增條件為94 ℃變性2分鐘，然后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)94 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸3 min。

（5）2%瓊脂糖電泳檢測(cè)：

60V，40min電泳，凝膠成像儀拍照記錄。

其中步驟（1）中水相為，用來檢測(cè)乙型肝炎病毒核酸時(shí)為6.67 μL從人血清提取的病毒核酸模板和上?？迫A生物工程股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒中的93.33 μL預(yù)混反應(yīng)液。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明建立的兩步乳液PCR方法，第一步通過油包水的乳液PCR把模板和干擾物分開，提高擴(kuò)增特異性，第二步把油包水的乳液轉(zhuǎn)換成水包油的PCR進(jìn)行二次擴(kuò)增，進(jìn)一步提高產(chǎn)量，提高基因檢測(cè)的靈敏度。該法不僅具備乳液PCR抗干擾、特異性高的特點(diǎn)，還具備乳液PCR結(jié)合常規(guī)PCR法高產(chǎn)量的特點(diǎn)，同時(shí)整個(gè)過程中還沒有應(yīng)用乙醚破乳化、提純等過程，不經(jīng)簡(jiǎn)單方便，還更經(jīng)濟(jì)。

本發(fā)明主要用于低濃度核酸的檢測(cè)，如臨床實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量檢測(cè)乙型肝炎病毒核酸時(shí)，如果結(jié)果<500 IU/ml時(shí)，不能判定病人血清中是否有乙肝病毒。而本發(fā)明具有更高的靈敏度，可作為常規(guī)定量PCR的補(bǔ)充，進(jìn)一步檢測(cè)乙肝病毒核酸定量檢測(cè)結(jié)果果<500 IU/ml的患者，是否有乙肝病毒。如圖1兩步乳液PCR方法流程圖；如圖2常規(guī)定量PCR擴(kuò)增陰性的1號(hào)和2號(hào)乙肝患者，用兩步乳液PCR方法可擴(kuò)增出明顯條帶，提示病人血清仍有乙型肝炎病毒。

附圖說明

圖1為兩步乳液PCR方法流程圖。

圖2為實(shí)施例 1 中乙肝病毒核酸檢測(cè)的兩步乳液PCR方法與常規(guī)PCR對(duì)比，其中1和2為常規(guī)PCR檢測(cè)的1和2號(hào)乙肝患者，3和4為兩步乳液PCR方法檢測(cè)1和2號(hào)乙肝患者，5和6分別為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

本實(shí)施例1提供檢測(cè)乙肝病毒核酸檢測(cè)的兩步乳液PCR方法與常規(guī)PCR法對(duì)比，包括如下步驟：

（1）標(biāo)本來源：選取鹽城市第一人民醫(yī)院PCR室2015年10月26日至2015年10月30日之間，定量結(jié)果<500 IU/mL且無擴(kuò)增曲線的病人血清標(biāo)本40例。陰陽(yáng)性對(duì)照采用乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒內(nèi)陰陽(yáng)性對(duì)照血清。

（2）核酸提?。簯?yīng)用上?？迫A生物工程股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒提取核酸，-20℃保存。

（3）常規(guī)PCR法檢測(cè)：3 μL模板和上?？迫A生物工程股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒中的42 μL預(yù)混反應(yīng)液，加入PCR反應(yīng)管中，置入PCR儀中，反應(yīng)條件為94 ℃變性2分鐘，然后進(jìn)入45個(gè)循環(huán)94 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，最后延伸3 min。

（4）兩步乳液PCR檢測(cè)：

1）油包水乳液顆粒的制備：

水相為100μL反應(yīng)體系為6.67 μL模板加上海科華生物工程股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒中的93.33 μL預(yù)混反應(yīng)液。油相組成為4.5% (v/v) 司盤80、0.4% (v/v) 吐溫80、0.05% (v/v) 聚乙二醇辛基苯基醚，其余為礦物油。油包水乳液顆粒的制作：把0.1 mL的PCR反應(yīng)液，以每滴8~10 μL的速度勻速滴入含0.2 mL油相的2 mL平底冷凍管中，滴入時(shí)間控制在1分鐘左右，同時(shí)用攪拌子為8×1.5 mm的磁力攪拌器以1300 rpm的速度攪拌，當(dāng)水相加完后繼續(xù)攪拌5 min，得到0.3 mL的乳化液，分裝入3管PCR反應(yīng)管中；

2）第一步PCR擴(kuò)增：

把步驟1）中的分裝的裝有油包水乳化液的PCR反應(yīng)管，置入PCR儀中，反應(yīng)條件為94 ℃變性2分鐘，然后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)94 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，最后延伸3 min；

3）水包油乳液顆粒的制備：

把步驟2中的擴(kuò)增產(chǎn)物14000 g/min，0℃，離心10min，棄上層油相，加入33μL預(yù)混反應(yīng)液，3000 rpm漩渦震蕩，當(dāng)油相充分散開，2000 rpm繼續(xù)震蕩2 min，1000 rpm離心20 s，制成水包油乳化液。

4）第二步PCR擴(kuò)增：

把步驟3）中的水包油乳化液的PCR反應(yīng)管，置入PCR儀中，反應(yīng)條件為94 ℃變性2分鐘，然后進(jìn)入40個(gè)循環(huán)94 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，最后延伸3 min，進(jìn)行擴(kuò)增；

（5）2%瓊脂糖電泳檢測(cè)：80V，40min電泳，凝膠成像儀拍照記錄。

結(jié)果分析：

電泳分析結(jié)果：從圖2可以看出實(shí)施例1中檢測(cè)的兩例病人常規(guī)PCR擴(kuò)增均為陰性，而兩步乳液PCR方法擴(kuò)增均為陽(yáng)性；進(jìn)一步檢測(cè)全部40例標(biāo)本，兩步乳液PCR方法有14例（35 %）為陽(yáng)性，而常規(guī)PCR法均為陰性。說明兩步乳液PCR方法能進(jìn)一步提高乙肝病毒核酸的檢測(cè)率，是臨床熒光定量方法很好的補(bǔ)充方法。