本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種尿促卵泡素的提取制備方法。

背景技術(shù)：

尿促卵泡素（urine Follicle Stimulating Hormone，u-FSH）是主要成分為卵泡刺激素 （Follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）的組合物，高純度尿促卵泡素中FSH含量可以達(dá)到95%以上，幾乎不含黃體生成素（Luteotropic Hormone，LH）。FSH是一種糖蛋白激素，分子量約為30KD。FSH能促進(jìn)顆粒細(xì)胞增生，刺激類固醇生成，調(diào)節(jié)配子細(xì)胞的發(fā)育和成熟，是下丘腦-垂體-性腺軸中的主要激素之一。FSH對人類具有調(diào)控月經(jīng)周期、排卵和調(diào)節(jié)雄性睪丸功能的作用，臨床上常用它治療女性不孕癥和男性促性腺激素分泌不足、精小管缺陷等。

在人的腦垂體和絕經(jīng)期與絕經(jīng)后的婦女尿中兩者的含量較高，因此也是提取FSH 的主要來源。用于生產(chǎn)u-FSH的原料人絕經(jīng)期促性腺激素（Human Menopausal Gonadotropin，HMG）主要包含卵泡刺激素與黃體生成素（Luteotropic Hormone，LH）。FSH與LH效價的比值約為1:1。制備高純度尿促卵泡素需要除去HMG 中的LH 和其他尿蛋白質(zhì)，保留高純度單一活性組分的FSH。

目前，國外高純度的u-FSH 生產(chǎn)技術(shù)主要由Serono 公司掌握， 其工藝流程為先用乙醇抽提HMG 粗品，再經(jīng)硅酸鋁吸附，然后經(jīng)陰離子交換層析，再使用抗FSH 單克隆抗體層析柱捕獲FSH，最后通過反相層析獲得高純度u-FSH。國內(nèi)高純度的u-FSH主要由麗珠和天偉兩家公司生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝中均使用了抗LH抗體吸附除去LH的工藝步驟。利用抗原抗體特異性反應(yīng)來除去LH，具有純化效率高等優(yōu)點(diǎn)。但目前大多數(shù)抗體為鼠源或兔源，本身屬于蛋白質(zhì)，在層析過程中，偶聯(lián)于基質(zhì)上的抗體脫落會造成異源蛋白的污染，影響產(chǎn)品品質(zhì)。同時，抗體免疫親和層析柱價格昂貴，使用壽命短，維護(hù)及工業(yè)放大生產(chǎn)困難，這些不足都嚴(yán)重阻礙了其應(yīng)用推廣。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)出一種能夠制備出低含量LH及高純度FSH產(chǎn)品的操作簡便、生產(chǎn)成本低的生產(chǎn)工藝。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)LH的疏水性強(qiáng)于FSH，可通過疏水層析技術(shù)將其分離，因此可以采用疏水層析代替抗體免疫親和層析，以解決上述問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對以上工藝的不足，本發(fā)明的目的是提供一種尿促卵泡素的制備方法，與已有工藝相比，該制備方法操作簡便、生產(chǎn)成本低，獲得的尿促卵泡素純度更高，無外源蛋白的污染。 FSH比活性大于10000IU/mg 蛋白質(zhì)，LH:FSH效價低于1:100。

本發(fā)明提供的尿促卵泡素的制備方法包括以下步驟：

(1) 人絕經(jīng)期促性腺激素粗制品經(jīng)陰離子交換層析純化，得到尿促卵泡素中間體I；

(2) 尿促卵泡素中間體I經(jīng)陽離子交換層析純化，得到尿促卵泡素中間體II；

(3) 尿促卵泡素中間體II經(jīng)染料親和層析純化，得到尿促卵泡素中間體III；

(4) 尿促卵泡素中間體Ⅲ經(jīng)疏水層析純化，得到高純度尿促卵泡素的溶液；

根據(jù)以上所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括將步驟（4）所得尿促卵泡素進(jìn)行超濾換鹽，換鹽所用溶液為0.01M PB緩沖溶液，優(yōu)選地，其pH為5.5-7.0。

優(yōu)選地，上述制備方法還包括將步驟（4）所得尿促卵泡素溶液與凍干保護(hù)劑混合后凍干，凍干保護(hù)劑為乳糖，優(yōu)選地，其添加量為3%-6%（g/ml）。

優(yōu)選地，上述制備方法所述陰離子交換層析填料配基為三乙基氨基乙基、二乙基氨基乙基、氨基乙基或三乙醇基氨基，基質(zhì)為纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、苯乙烯；所述陽離子交換層析填料配基為羧甲基、磺酸基、磷酸基、亞磷酸基、酚基，基質(zhì)為纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、聚苯乙烯；所述染料親和層析填料配基為Cibacron Blue、Red、Green、Orange，基質(zhì)為瓊脂糖、葡聚糖或殼聚糖；所述疏水層析填料為以丁基、辛基、苯基或新戊基為配基的乙烯醇和甲基丙烯酸酯共聚物、瓊脂糖、纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯或殼聚糖。

具體來說，所述步驟（1）包括以下步驟：

用水溶解HMG粗制品，調(diào)節(jié)溶液的pH值至5.5-8.0；將HMG粗制品溶液上樣至已平衡好的陰離子交換層析柱；以pH 值為5.5-8.0 的0.02M PB溶液洗滌，并檢測洗滌液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降；以pH 值為5.5-8.0 的含0.05-0.2M NaCl的0.02M PB溶液洗脫，并檢測洗脫液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降，所得洗脫液即為尿促卵泡素中間體I；

具體來說，所述步驟（2）包括以下步驟：

將卵泡刺激素中間體I的溶液上樣至已平衡好的陽離子交換層析柱；以pH 值為4.0-5.5 的0.1M HAc-NaAc溶液洗滌，并檢測洗滌液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降；再用pH 值為4.0-5.5的含0.1-0. 5M NaCl的0.1M HAc-NaAc溶液洗脫，并檢測洗脫液在280nm 處的吸光值，直至吸光值不再下降，所得洗脫液即為尿促卵泡素中間體II；

具體來說，所述步驟（3）包括以下步驟：

將卵泡刺激素中間體II的溶液上樣至已平衡好的Cibacron Blue染料親和層析柱；以pH 值為6.0-9.0 的0.1M NaAc溶液洗滌，并檢測洗滌液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降；再以pH 值為8.0-10.0 的含0.8-2.5M KCl 的0.02M PB溶液洗脫，并檢測洗脫液在280nm 處的吸光值，直至吸光值不再下降，所得洗脫液即為尿促卵泡素中間體III；

具體來說，所述步驟（4）包括以下步驟：

將卵泡刺激素中間體III的溶液上樣至已平衡好的疏水層析柱；用pH值為7.0-9.0 的含有1.0-1.5M 硫酸銨的0.02M PB溶液洗滌，并檢測洗滌液在280nm 處的吸光值，直至吸光值不再下降；再以pH 值為7.0-9.0 的含有0.2-0.4M 硫酸銨的0.02M PB溶液洗脫，并檢測洗脫液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降，所得洗脫液即為高純度尿促卵泡素的溶液；

本發(fā)明以HMG為起始原料，依次采用陰離子交換層析、陽離子交換層析、染料親和層析以及疏水層析工藝，提取純化制得高純度FSH。其中，利用蛋白質(zhì)兩性電離的性質(zhì)，通過改變?nèi)芤簆H，使蛋白質(zhì)帶上不同電荷，經(jīng)過陰離子交換層析與陽離子交換層析，F(xiàn)SH純化倍數(shù)可達(dá)50倍以上。利用FSH能與染料親和吸附的性質(zhì)，進(jìn)一步去除雜質(zhì)蛋白，使FSH純化倍數(shù)達(dá)到150倍以上。最后利用LH與FSH疏水性差異，去除LH，獲得高純的幾乎不含LH的尿促卵泡素。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。

圖2為實(shí)施例1制備的高純度尿促卵泡素成品的HPLC圖譜。

圖3為實(shí)施列1和實(shí)施例2制備的FSH的電泳圖譜。其中，1：實(shí)施例1制備成品；2：實(shí)施例1制備成品5%自身對照；3：實(shí)施例2制備成品5%自身對照；4：實(shí)施例2制備成品；

圖4為實(shí)施例2制備的高純度尿促卵泡素成品的HPLC圖譜。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及的生物效價、比活性及純度的測定及計(jì)算方法。

生物效價測定：

FSH、LH生物效價測定按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則1216及1217檢測。

比活性測定：

精密稱取本品約10mg，精密加入水1ml使溶解；另精密稱取牛血清白蛋白對照品，加水溶解制成每1ml中分別含1.0mg、0.8mg、0.6mg、0.4mg、0.2mg、0mg的溶液，照紫外-可見分光光度法（《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0401），分別在280nm的波長處測定吸光度，以牛血清白蛋白溶液的濃度為橫坐標(biāo)，在280nm的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光度和濃度關(guān)系應(yīng)呈線性。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得供試品溶液的蛋白濃度，按下式計(jì)算比活：

HPLC純度測定：

取本品適量，加水制成每1ml中約含500IU FSH的溶液作為供試品溶液。照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0512高效液相色譜法試驗(yàn)。采用凝膠色譜柱 Superdex 75；以磷酸鹽緩沖液（取85%H3PO46.74ml，加水800ml，再加Na2SO4 14.2g，用50%NaOH調(diào)pH 至6.7，用水定容為1000ml）；柱溫30℃；流速0.5ml/min；檢測波長214nm；進(jìn)樣量100μl。

電泳有關(guān)物質(zhì)測定：

照（《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0541第五法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法）檢查。供試品溶液濃度為30000IU FSH/ml，將其稀釋20倍作為對照溶液，上樣量為10μl。

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

如圖１所示，將HMG粗制品（本公司生產(chǎn)，批號Z0203150901）作為起始原料，其FSH生物效價為30IU/mg，LH生物效價為28IU/mg，F(xiàn)SH比活性為43IU/mg蛋白質(zhì)。

1. Capto DEAE 陰離子交換層析

用200ml水溶解8.0g HMG粗制品，調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.5，將此溶液上樣至柱體積為250ml的Capto DEAE層析柱（購自GE公司），層析柱預(yù)先用平衡液（0.02M PB，pH7.5）平衡好；上樣結(jié)束后用平衡液洗滌未吸附的蛋白，并檢測洗滌液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脫液（0.02M PB+0.15MNaCl）洗脫FSH，并檢測洗脫液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脫流出液1.0L，用截留分子量為6KD的超濾膜濃縮至約100ml，加入預(yù)冷至-20℃的95%乙醇至乙醇濃度為85%，攪拌均勻后靜置過夜沉淀蛋白，次日離心收集沉淀，加入無水乙醇脫水3次后真空干燥，得到尿促卵泡素中間體I 0.73g。

2. CM-Sepharose 陽離子交換層析

尿促卵泡素中間體I 0.7g 用30ml平衡液（0.1M HAc-NaAc，pH4.5）溶解后上樣至柱體積為20ml的 CM-Sepharose 層析柱（購自GE公司），層析柱預(yù)先用平衡液平衡好；上樣結(jié)束后用平衡液洗滌未吸附的蛋白，并檢測洗滌液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脫液（0.1M HAc-NaAc+0.5M NaCl，pH4.5）洗脫FSH，并檢測洗脫液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脫流出液100ml，即為尿促卵泡素中間體II。

3. Capto Blue (high sub)染料親和層析

將尿促卵泡素中間體II 98ml調(diào)節(jié)pH及電導(dǎo)率與平衡液（0.1M NaAc，pH7.0）一致，上樣至已平衡好的柱體積為15ml的Capto Blue (high sub) 層析柱（購自GE公司）；上樣結(jié)束后用平衡液洗滌未吸附的蛋白，并檢測洗滌液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脫液（0.02M PB+2.0M KCl，pH 9.0）洗脫FSH，并檢測洗脫液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脫流出液70ml，即為尿促卵泡素中間體III。

4. Phenyl-650M疏水層析

往尿促卵泡素中間體III 68ml中添加固體硫酸銨，攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH及電導(dǎo)率與平衡液（0.02M PB+1.4M (NH₄)₂SO₄，pH7.0）一致，上樣至已平衡好的柱體積為10ml的Phenyl Phenyl-650M層析柱（購自TOSOH公司）；上樣結(jié)束后用平衡液洗滌未吸附的蛋白，并檢測洗滌液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脫液（0.02M PB+0.3M (NH₄)₂SO₄，pH7.0）洗脫FSH，并檢測洗脫液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脫流出液40ml，即為高純度尿促卵泡素溶液。

將高純度尿促卵泡素溶液用截留分子量為6KD的超濾膜超濾濃縮后，用0.01M PB緩沖溶液(pH 6.0)換鹽3次，按照4%（w/v）的比例添加乳糖配制成凍干原液，冷凍干燥后得到0.91g高純度尿促卵泡素成品，成品相關(guān)參數(shù)見表1，F(xiàn)SH的HPLC及電泳純度圖譜分別如圖2及圖3所示。

表1 實(shí)施例1制備的高純度尿促卵泡素成品參數(shù)

實(shí)施例2

將低純度HMG（本公司生產(chǎn)，批號Z0203150901）作為起始原料，其FSH生物效價為30IU/mg，LH生物效價為28IU/mg，F(xiàn)SH比活性為43IU/mg蛋白質(zhì)。

1. Capto DEAE 陰離子交換層析

用500ml水溶解20g HMG，調(diào)節(jié)溶液1的pH值至7.5，將此溶液上樣至柱體積為630ml的Capto DEAE層析柱（購自GE公司），層析柱預(yù)先用平衡液（0.02M PB，pH7.5）平衡好；上樣結(jié)束后用平衡液洗滌未吸附的蛋白，并檢測洗滌液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脫液（0.02M PB+0.15M NaCl）洗脫FSH，并檢測洗脫液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脫流出液2.5L，用截留分子量為6KD的超濾膜濃縮至約100ml，加入預(yù)冷至-20℃的95%乙醇至乙醇濃度為85%，攪拌均勻后靜置過夜沉淀蛋白，次日離心收集沉淀，加入無水乙醇脫水3次后真空干燥，得到尿促卵泡素中間體I 1.85g。

2. CM-Sepharose 陽離子交換層析

尿促卵泡素中間體I 1.8g 用80ml平衡液（0.1M HAc-NaAc，pH4.5）溶解后上樣至柱體積為50ml的 CM-Sepharose 層析柱（購自GE公司），層析柱預(yù)先用平衡液平衡好；上樣結(jié)束后用平衡液洗滌未吸附的蛋白，并檢測洗滌液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脫液（0.1M HAc-NaAc+0.5M NaCl，pH4.5）洗脫FSH，并檢測洗脫液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脫流出液250ml，即為尿促卵泡素中間體II；用截留分子量為6KD的超濾膜濃縮至約100ml，加入預(yù)冷至-20℃的95%乙醇至乙醇濃度為85%，攪拌均勻后靜置過夜沉淀蛋白，次日離心收集沉淀，加入無水乙醇脫水3次后真空干燥，得到尿促卵泡素中間體II干燥品 0.24g。

3. Capto Blue (high sub) 染料親和層析

尿促卵泡素中間體II干燥品 0.21g用平衡液（0.1M NaAc，pH7.0）溶解，上樣至已平衡好的柱體積為40ml的Capto Blue (high sub) 層析柱（購自GE公司）；上樣結(jié)束后用平衡液洗滌未吸附的蛋白，并檢測洗滌液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脫液（0.02M PB+2.0M KCl，pH 9.0）洗脫FSH，并檢測洗脫液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脫流出液174ml，即為尿促卵泡素中間體III；加入預(yù)冷至-20℃的95%乙醇至乙醇濃度為85%，攪拌均勻后靜置過夜沉淀蛋白，次日離心收集沉淀，加入無水乙醇脫水3次后真空干燥，得到尿促卵泡素中間體II干燥品 0.13g。

4. Phenyl-650M疏水層析

尿促卵泡素中間體II干燥品 0.11g用平衡液（0.02M PB+1.4M (NH₄)₂SO₄，pH7.0）溶解，上樣至已平衡好的柱體積為25ml的Phenyl-650M層析柱（購自TOSOH公司）；上樣結(jié)束后用平衡液洗未吸附的蛋白，并檢測洗滌液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脫液（0.02M PB+0.3M (NH₄)₂SO₄，pH7.0）洗脫FSH，并檢測洗脫液在280nm處的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脫流出液94ml，即為高純度尿促卵泡素。

將高純度尿促卵泡素用截留分子量為6KD的超濾膜超濾濃縮后，用0.01M PB緩沖溶液(pH 6.0)置換原緩沖溶液3次，按照4%（w/v）的比例添加乳糖配制成凍干原液，冷凍干燥后得到2.31g 高純度尿促卵泡素成品，成品相關(guān)參數(shù)見表2，F(xiàn)SH的電泳及HPLC純度圖譜分別如圖3及圖4所示。

表2 實(shí)施例2制備的高純度尿促卵泡素成品參數(shù)

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