本申請涉及生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，涉及一種工程改造的腫瘤壞死因子β，還涉及經(jīng)聚乙二醇修飾的腫瘤壞死因子β，及其制備方法，以及上述分子作為治療劑在預(yù)防或治療腫瘤中的用途。

背景技術(shù)：

腫瘤壞死因子β(TNFβ)是一種能夠引發(fā)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡的多功能細(xì)胞因子。TNFβ由活化的單核巨噬細(xì)胞分泌，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子家族(TNFα和TNFβ)中具有強烈抗腫瘤活性的細(xì)胞因子之一，其對多種惡性腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺死細(xì)胞(tumorcidal)作用(Carswell,EA等人,1975,An endotoxin induced serum factor that causes necrosis of tumors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72；3666-3670)。

TNFβ在1970年代末期由美國科學(xué)家所發(fā)現(xiàn)。TNFβ的生物活性作用，主要是通過與一個較低分子量的受體(TNFR2)，及與一個高分子量受體(TNFR1)結(jié)合，來傳導(dǎo)所有的生理學(xué)、病理學(xué)、以及殺死惡性腫瘤細(xì)胞的藥理學(xué)作用(Andrews JS等人,1990.Characterization of the receptors for tumor necrosis factor(TNF)and lymphotoxin(LT)on human lymphocytes.J.Immunol.144；2582-2591.Dembic Z等人,1990.Two human TNF receptors have similar extracellular,but distinct intracellular,domain sequences.Cytokine 2；231-237)。

已經(jīng)發(fā)表的臨床治療早期黑色素癌癥和治療軟組織惡性肉瘤的藥效實驗數(shù)據(jù)顯示：野生型TNFβ在人體內(nèi)循環(huán)時間太短，并且血液循環(huán)系統(tǒng)器官毒性過高，因此它用于惡性黑色素瘤、軟組織肉瘤的非腸道注射形式的臨床療效不佳(Fiers W,1995.Biologic therapy with TNF:preclinical studies.In Biologic Therapy of Cancer.第二版；DeVita Jr.VT,等人，Philadelphia:J.B.Lippincott Co.295-328)。由于這個原因，TNFβ治療人體惡性腫瘤的醫(yī)療效果，未曾在人體臨床試驗之中系統(tǒng)性的被證實或排除。

鑒于TNFβ在人體內(nèi)半衰期短的缺點，本領(lǐng)域仍然需要一種生物體內(nèi)半衰期更長的新型TNFβ類似物或衍生物，從而使其能夠更廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的全身性臨床治療。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，根據(jù)本申請的一些實施方式，提供一種經(jīng)工程改造的腫瘤壞死因子β，其是野生型TNFβ的類似物(在文中也作TNFβ類似物)。

在一些實施方式中，根據(jù)本申請的TNFβ類似物和野生型TNFβ在一個氨基酸殘基位點上存在差異。在一個具體的實施方式中，所述氨基酸殘基位點是第4位；在另一個具體的實施方式中，所述氨基酸殘基位點是第22位。在一個具體的實施方式中，第4位氨基酸殘基Val(V)被替換為Thr(T)；本領(lǐng)域技術(shù)人員習(xí)慣上將這種替換表示為V4T；那么，具有這種替換的TNFβ類似物在文中以“TNFβV4T”表示。在另一個具體的實施方式中，第22位氨基酸殘基Leu(L)被替換為Ser(S)；本領(lǐng)域技術(shù)人員習(xí)慣上將這種替換表示為L22S；那么，具有這種替換的TNFβ類似物在文中以“TNFβL22S”表示。在一個具體的實施方式中，TNFβV4T如SEQ ID No.2所示。在另一個具體的實施方式中，TNFβL22S如SEQ ID No.3所示。

在另一些實施方式中，根據(jù)本申請的TNFβ類似物和野生型TNFβ在一個以上(例如，但不限于2個)氨基酸殘基位點上存在差異。在一個具體的實施方式中，所述氨基酸殘基位點是第4位和第22位。在一個具體的實施方式中，第4位氨基酸殘基V被替換為T，且第22位氨基酸殘基L被替換為S；具有這種替換的TNFβ類似物在文中以“TNFβV4TL22S”表示。在另一個具體的實施方式中，TNFβV4TL22S如SEQ ID No.4所示。

本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，野生型TNFβ(文中以TNFβ表示)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。人類野生型TNFβ的序列是本領(lǐng)域公知的，例如Pennica D,1984,Human tumor necrosis factor:precursor structure，expression and homology to lymphotoxin Nature 312；724-729中可以獲得其信息。

根據(jù)本申請的一些實施方式，提供一種偶聯(lián)物，它是聚乙二醇化的TNFβ類似物；也可以理解為聚乙二醇分子和本申請的TNFβ類似物共價結(jié)合形成的偶聯(lián)物。

根據(jù)本申請的另一些實施方式，提供一種偶聯(lián)物，它是聚乙二醇化的TNFβ；也可以理解為聚乙二醇分子和野生型TNFβ共價結(jié)合形成的偶聯(lián)物。

在本申請上下文中，根據(jù)本申請的偶聯(lián)物以“TNFβPEG”表示。如無特別說明，TNFβPEG既包含聚乙二醇化的TNFβ類似物，也包含聚乙二醇化的野生型TNFβ。

在一些實施方式中，聚乙二醇(PEG)包括直鏈型和支鏈型。在具體的實施方式中，聚乙二醇是線性聚乙二醇，即直鏈型。

在一些實施方式中，聚乙二醇的平均分子量是5000至25000，例如5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000以及上述任意兩個數(shù)值之間的范圍。在一個具體的實施方式中，聚乙二醇的平均分子量是10000至20000。在一個具體的實施方式中，聚乙二醇的平均分子量是15000至20000。在一個具體的實施方式中，聚乙二醇的平均分子量是20000。

在本領(lǐng)域中，技術(shù)人員習(xí)慣上將平均分子量為5000的PEG表示為PEG5000。以此類推，PEG10000、PEG20000等。

在一些實施方式中，用于制備本申請偶聯(lián)物的PEG是活化形式的聚乙二醇。在具體的實施方式中，適用于本申請的活化形式的聚乙二醇選自：甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸酯(Methoxy Succinimidyl Glutarate NHS ester，SG-PEG)、聚乙二醇琥珀酰亞胺基羧甲基酯(Succinimidyl Carboxymethyl NHS ester，SCM-PEG)。在優(yōu)選的實施方式中，活化形式的聚乙二醇選自：甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸酯、聚乙二醇琥珀酰亞胺基羧甲基酯、及其組合。

PEG修飾可以發(fā)生在很多基團(tuán)上，比如多肽的氨基、巰基、羧基上面。本申請中PEG化在pH>8.2的反應(yīng)條件下進(jìn)行，因此PEG修飾特異性地發(fā)生賴氨酸的氨基上。

根據(jù)一些實施方式，提供了一種藥物組合物，其含有根據(jù)本申請的TNFβ類似物。

根據(jù)另一些實施方式，提供了一種藥物組合物，其含有根據(jù)本申請的偶聯(lián)物。

根據(jù)另一些實施方式，提供了一種藥物組合物，其還包含藥學(xué)上可接受的載體。

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，本申請的藥物組合物可以根據(jù)具體的施用方式被配制成各種本領(lǐng)域熟知的制劑形式，例如口服劑型(粉劑、片劑、膠囊、軟膠囊、液體藥物、糖漿、酏丸、散劑、囊劑、粒劑)，或表皮制劑(乳膏、軟膏、洗劑、凝膠、香脂、膏藥、糊劑、噴霧劑、氣霧劑等等)，或注射制劑(溶液、懸浮劑、乳劑)。在一個具體的實施方式中，本申請的藥物組合物被制備成注射制劑。

根據(jù)本申請的藥物組合物可以包含藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體選自：佐劑、稀釋劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質(zhì)、及其組合。

在一些實施方式中，填充劑選自：淀粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖、及其組合。

在一些實施方式中，助懸劑選自：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素、及其組合。

本申請的組合物可以通過利用本領(lǐng)域任何現(xiàn)有的或未來的方法制成，例如但不限于使患者或受試者用藥后能提供快速、持久或緩慢釋放的活性成分。

本申請活性成分(本申請的TNFβ類似物和/或偶聯(lián)物)的給藥劑量可以根據(jù)個體的情況、重量、病情的嚴(yán)重程度、藥物形式、給藥途徑以及給藥周期的不同而不同。給藥劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行選擇。施用頻率可以是每天單次給藥或每天分多次給藥。在一些具體的實施方式中，當(dāng)應(yīng)用于成人人體時，本申請的偶聯(lián)物的臨床有效藥劑量為10至3000ng/m²/7至14天。

本申請的藥物組合物通過各種途徑給藥至個體(如哺乳動物(大鼠、小鼠、馴化動物或人類))。所有的給藥方式均是預(yù)期的，例如，給藥可以是皮下、皮內(nèi)、膜間、栓劑和氣霧劑給藥形式。

根據(jù)一些實施方式，提供了一種腫瘤壞死因子β類似物，其用于預(yù)防和/或治療腫瘤。根據(jù)一些實施方式，提供了本申請的腫瘤壞死因子β類似物在制備用于預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物中的用途。

根據(jù)一些實施方式，提供了一種偶聯(lián)物，其用于預(yù)防和/或治療腫瘤。根據(jù)一些實施方式，提供了本申請的偶聯(lián)物在制備用于預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物中的用途。

在一些實施方式中，所述腫瘤是癌癥。在一些實施方式中，所述腫瘤選自：淋巴癌、肺癌、腎癌、肝癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌和黑色素瘤。所述肺癌例如選自小細(xì)胞性肺癌和非小細(xì)胞性肺癌。

根據(jù)一些實施方式，提供了一種用于制備本申請偶聯(lián)物的方法，包括步驟：

將腫瘤壞死因子β(或腫瘤壞死因子β類似物)與活化的聚乙二醇接觸。

在一些實施方式中，所述腫瘤壞死因子β(或腫瘤壞死因子β類似物)與所述活化的聚乙二醇的比例按重量計為1:20至1:30。例如，1:20；1:21；1:22；1:23；1:24；1:25；1:26；1:27；1:28；1:29；1:30。

在一些實施方式中，所述接觸在8.5至9.5的pH中進(jìn)行。在具體的實施方式中，所述pH為8.8至9.2。在具體的實施方式中，所述pH為8.9至9.1。

在一些實施方式中，所述接觸在25℃至37℃的溫度中進(jìn)行。在具體的實施方式中，所述溫度為28℃至35℃。在具體的實施方式中，所述溫度為29℃至31℃。在具體的實施方式中，所述溫度為29.8℃至30.2℃。

在一些實施方式中，所述接觸的時間為10至40分鐘。在具體的實施方式中，所述接觸的時間為15至35分鐘。在具體的實施方式中，所述接觸的時間為20至35分鐘。在具體的實施方式中，所述接觸的時間為25至35分鐘。在具體的實施方式中，所述接觸的時間為28至32分鐘。在具體的實施方式中，所述接觸的時間為30分鐘。

聚乙二醇化學(xué)反應(yīng)是本申請中的重要控制程序?；罨木垡叶紝NFβ蛋白修飾反應(yīng)是通過控制反應(yīng)pH值在9.0±0.1，反應(yīng)時間控制在30分鐘左右，蛋白與聚乙二醇的用量比為1:20至1:30(w:w)，反應(yīng)溫度控制在25至37℃，使TNFβ蛋白表面的賴氨酸能夠充分的與活化聚乙二醇進(jìn)行反應(yīng)，以獲得聚乙二醇修飾的偶聯(lián)產(chǎn)物。

聚乙二醇化學(xué)反應(yīng)完成后，可以用截留分子量50000的濾膜裝置，將剩余未完成化學(xué)反應(yīng)的蛋白，及剩余未反應(yīng)的線性聚乙二醇用高速離心分離，即可獲得高純度的聚乙二醇-蛋白物的偶聯(lián)物。

這是一種溫和的生物化學(xué)反應(yīng)，通過與酸酐或羧酸反應(yīng)形成酯鍵或酰胺鍵而得到的偶聯(lián)物，在通常的生理條件下相對穩(wěn)定，并不會發(fā)生斷裂。

在本申請的上下文中，本申請所述的“聚乙二醇化腫瘤壞死因子”、“聚乙二醇修飾的腫瘤壞死因子”的意思是等同的，其等同于聚乙二醇和腫瘤壞死因子β的偶聯(lián)物或聚乙二醇和腫瘤壞死因子β類似物的偶聯(lián)物。

在本申請的上下文中，不應(yīng)對表述“一種”進(jìn)行限制性理解。根據(jù)上下文的語境，“一種”可以指“一類”，而非“一個”。

表1.本申請中所用縮寫及其含義

以下將通過具體實施例和附圖詳細(xì)說明書本申請。

附圖說明

圖1為顯示pET28b(+)表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。

圖2為SDS聚丙烯酰胺凝焦電泳測定TNFβ、TNFβ類似物及其偶聯(lián)物的純度圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本申請，但這些實施例僅用來說明本申請，而不以任何方式限制本申請的范圍。以下實施例中的SCM-PEG5000、SCM-PEG10000、SCM-PEG20000、SG-PEG5000、SG-PEG10000、和SG-PEG20000購自北京鍵凱科技公司。

實施例

實施例1.野生型TNFβ及TNFβ類似物的構(gòu)建和表達(dá)

一、操作步驟：

1.核苷酸序列的優(yōu)化和構(gòu)建：

1.1運用全化學(xué)合成方法，將人野生型TNFβ基因的氨基酸序列SEQ ID No.1，改編為SEQ ID No.5以利于置入原核表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng))中順利表達(dá)和純化(方法參考Pennica,D.Nedwin,G.E.,Hayflick,J.S.,等人Nature,1984,312(20/27),724-729,Human tumour necrosis factor:precursor structure,expression and homology to lymphotoxin)。

所述的改編過程包括：將SEQ ID No.1第2位脯氨酸改成賴氨酸；將第26位蘇氨酸改成天冬酰胺；將第28位賴氨酸改成丙氨酸，而完成改編TNFβ基因氨基酸序列如上述序列。

1.2此外，又將SEQ ID No.5進(jìn)行如下優(yōu)化：

將第4位纈氨酸改變?yōu)樘K氨酸(命名為TNFβ類似物TNFβV4T，SEQ ID NO.2)；

將第22位賴氨基酸改變?yōu)榻z氨酸(命名為TNFβ類似物TNFβL22S，SEQ ID NO.3)；

同時將第4位纈氨酸改變?yōu)樘K氨酸，第22位亮氨基酸改變?yōu)榻z氨酸(命名為TNFβ類似物TNFβV4TL22S，SEQ ID NO.4)。

2.野生型TNFβ及TNFβ類似物的表達(dá)

運用全化學(xué)合成方法，合成上述野生型TNFβ或TNFβ類似物(氨基酸序列見下文)；

將其置入表達(dá)質(zhì)粒例如pET28b(+)(方法參見pET System Novagen手冊，第11版，User Protocol TB055Rev.C 0611JN，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖1)中；

根據(jù)Novagen公司本方法手冊中的常規(guī)程序(Novagen User Protocol TB055Rev.C 0611JN)，將質(zhì)粒穿入大腸桿菌BL21(DE3)、BL21(DE3)sS(Novagen pET System手冊，第11版)中；

從將上述表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌的瓊脂培養(yǎng)皿中挑選單一菌落，置入5mL的無菌LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基中(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，于37℃，按標(biāo)準(zhǔn)操作手冊方式培養(yǎng)；

按照1％比例逐步放大到5升的培養(yǎng)基，至菌密度OD₂₆₀為0.6至0.8時，降溫至18℃；

加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)TNFβ蛋白表達(dá)16小時；

大腸桿菌體用5000rpm離心沉淀收集，然后用預(yù)冷(4℃)裂解緩沖液，于超聲破碎儀中破菌。

二、野生型TNFβ及TNFβ類似物的氨基酸序列：

1.野生型TNFβ(SEQ ID NO：1)

為適應(yīng)原核表達(dá)系統(tǒng)而優(yōu)化后的序列(SEQ ID NO：5)

2.TNFβV4T(SEQ ID NO：2)

3.TNFβL22S(SEQ ID NO：3)

4.TNFβV4TL22S(SEQ ID NO：4)

實施例2.TNFβ蛋白及其類似物的純化

如上實施例1中得到的裂解緩沖液破菌后的上清液包含著大量的水溶性表達(dá)蛋白。將破菌后的上清液以1.0毫升/每分鐘流速，緩慢通過速流通鎳離子(Ni-Sepharose^TM6FastFlow)親和柱(GE Healthcare Bioscience AB,Sweden)，將蛋白留置于鎳離子柱上，然后用洗脫溶液0.6M咪唑組胺(imidazole)水溶液洗脫，可得初步純化的(＞95％)蛋白。

將由此得到的蛋白通過速流通陰離子(SPSepharose^TMFast Flow)樹脂交換柱(GE Healthcare Bioscience AB)，將蛋白留置于此樹脂離子交換柱上，然后用含0.5M NaCl的磷酸鹽緩沖液(pH 8.5)洗脫，得到進(jìn)一步高度純化的(＞99.5％)蛋白。

實施例3.聚乙二醇化腫瘤壞死因子β(TNFβSCMPEG20)的制備

取1.0ml 0.1M pH 8.5的磷酸鈉緩沖液，于水浴中預(yù)熱至30℃。取2.5微克經(jīng)過純化后的野生型TNFβ蛋白(實施例2)，置入磷酸鈉緩沖液中。取62.0微克分子量為20000的聚乙二醇琥珀酰亞胺羧甲基酯(SCM-PEG20000)(北京鍵凱科技)，將其迅速加入至上述溶液中，并適當(dāng)攪拌而使活化聚乙二醇在30秒內(nèi)完全溶解，同時要避免氣泡產(chǎn)生。此時TNFβ與聚乙二醇用量比為1：25(w/w)。然后，于30℃輕微攪拌下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘，然后加入100.0微克甘氨酸終止反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)溶液置入具備分子量50,000的濾膜裝置的離心管裝置內(nèi)，用高速旋轉(zhuǎn)離心(3000×g，30分鐘)濾除剩余未完成反應(yīng)的蛋白和剩余未反應(yīng)的線性聚乙二醇，得到高純度的聚乙二醇-腫瘤壞死因子β偶聯(lián)物(命名為TNFβSCMPEG20)。TNFβSCMPEG20的濾液在0.2μm的無菌濾膜上進(jìn)行無菌過濾，得最終無菌蛋白注射液藥物，置于4℃密封無菌避光保存。

實施例4.TNFβSGPEG20的制備

取1.0ml 0.1M pH 8.5的磷酸鈉緩沖液，于水浴中預(yù)熱至30℃。取2.5微克經(jīng)過純化表達(dá)的TNFβ，置至磷酸鈉緩沖液中。取62.5微克分子量20000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸酯(SG-PEG20000)，將其迅速加入至上述溶液中，并適當(dāng)攪拌而使活化聚乙二醇在30秒內(nèi)完全溶解，同時要避免大量氣泡產(chǎn)生。此時TNFβ與聚乙二醇用量比為1：25(w/w)。然后，于25℃攪拌下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘，然后加入100.0微克甘氨酸終止反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)溶液置入具備分子量50,000的濾膜裝置的離心管裝置內(nèi)，用高速旋轉(zhuǎn)離心(3000×g，30分鐘)濾除剩余未完成反應(yīng)的蛋白和剩余未反應(yīng)的線性聚乙二醇，得到高純度的聚乙二醇-腫瘤壞死因子β類似物偶聯(lián)物(TNFβSGPEG20)。TNFβGPEG20的濾液在0.2μm的無菌濾膜上進(jìn)行無菌過濾，得最終無菌蛋白注射液藥物，置于4℃密封無菌避光保存。

實施例5.聚乙二醇化腫瘤壞死因子β(TNFβV4TSCMPEG20)的制備

取1.0ml 0.1M pH 8.5的磷酸鈉緩沖液，于水浴中預(yù)熱至30℃。取2.5微克經(jīng)過純化表達(dá)的TNFβV4T蛋白，置于磷酸鈉緩沖液中。取62.5微克分子量20000的聚乙二醇琥珀酰亞胺羧甲基酯(SCM-PEG20000)，將其迅速加入至上述溶液中，并適當(dāng)攪拌而使活化聚乙二醇在30秒內(nèi)完全溶解，同時要避免氣泡產(chǎn)生。此時TNFβV4T與聚乙二醇用量比為1：25(w/w)。然后，于30℃攪拌下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘，然后加入100.0微克甘氨酸終止反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)溶液置入具備分子量50,000的濾膜裝置的離心管裝置內(nèi)，用高速旋轉(zhuǎn)離心(3000×g，30分鐘)濾除剩余未完成反應(yīng)的蛋白和剩余未反應(yīng)的線性聚乙二醇，得到高純度的聚乙二醇-腫瘤壞死因子βV4T偶聯(lián)物(TNFβV4TSCMPEG20)。TNFβV4TSCMPEG20的濾液在0.2μm的無菌濾膜上進(jìn)行無菌過濾，得最終無菌蛋白注射液藥物，置于4℃密封無菌避光保存。

實施例6.聚乙二醇化腫瘤壞死因子β(TNFβV4TSGPEG20)的制備

取1.0ml 0.1M pH 8.5的磷酸鈉緩沖液，于水浴中預(yù)熱至30℃。取2.5微克純化表達(dá)的TNFβV4T蛋白，置于磷酸鈉緩沖液中。取62.5微克分子量20000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸酯(SG-PEG20000)將其迅速加入至上述溶液中，并適當(dāng)攪拌而使活化聚乙二醇在30秒內(nèi)完全溶解，同時要避免氣泡產(chǎn)生。此時TNFβV4T與聚乙二醇用量比為1：25(w/w)。然后，于25℃攪拌下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘，然后加入100.0微克甘氨酸終止反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)溶液置入具備分子量50,000的濾膜裝置的離心管裝置內(nèi)，用高速旋轉(zhuǎn)離心(3000×g，30分鐘)濾除剩余未完成反應(yīng)的蛋白和剩余未反應(yīng)的線性聚乙二醇，得到高純度的聚乙二醇-腫瘤壞死因子β偶聯(lián)物(TNFβV4TSGPEG20)。TNFβV4TSGPEG20的濾液在0.2μm的無菌濾膜上進(jìn)行無菌過濾，得最終無菌蛋白注射液藥物，置于4℃密封無菌避光保存。

實施例7.聚乙二醇化腫瘤壞死因子β(TNFβL22SSCMPEG20)的制備

取1.0ml 0.1M pH 8.5的磷酸鈉緩沖液，于水浴中預(yù)熱至30℃。取2.5微克經(jīng)過純化后的TNFβL22S蛋白(如前實施例1)，加入至磷酸鈉緩沖液中，使其充分溶解。取62.5微克分子量20000的聚乙二醇琥珀酰亞胺羧甲基酯(SCM-PEG20000)，將其迅速加入至上述溶液中，并適當(dāng)攪拌而使活化聚乙二醇在30秒內(nèi)完全溶解，同時要避免大量氣泡產(chǎn)生。此時TNFβL22S與聚乙二醇用量比為1：25(w/w)。然后，于30℃攪拌下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘，然后加入100.0微克甘氨酸終止反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)溶液置入具備分子量50,000的濾膜裝置的離心管裝置內(nèi)，用高速旋轉(zhuǎn)離心(3000×g，30分鐘)濾除剩余未完成反應(yīng)的蛋白和剩余未反應(yīng)的線性聚乙二醇，得到高純度的聚乙二醇-腫瘤壞死因子TNFβL22S偶聯(lián)物(TNFβL22SSCMPEG20)。TNFβL22SSCMPEG20的濾液在0.2μm的無菌濾膜上進(jìn)行無菌過濾，得最終無菌蛋白注射液藥物，置于4℃密封無菌避光保存。

實施例8.聚乙二醇化腫瘤壞死因子β(TNFβL22SSGPEG20)的制備

取1.0ml 0.1M pH 8.5的磷酸鈉緩沖液，于水浴中預(yù)熱至30℃。取2.5微克經(jīng)過純化表達(dá)的TNFβL22S蛋白，置于磷酸鈉緩沖液中。取62.5微克分子量20,000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸酯(SG-PEG20000)，將其迅速加入至上述溶液中，并適當(dāng)攪拌而使活化聚乙二醇在30秒內(nèi)完全溶解，同時要避免氣泡產(chǎn)生。此時TNFβL22S與聚乙二醇用量比為1：25(w/w)。然后，于30℃攪拌下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘，然后加入100.0微克甘氨酸終止反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)溶液置入具備分子量50,000的濾膜裝置的離心管裝置內(nèi)，用高速旋轉(zhuǎn)離心(3000×g，30分鐘)濾除剩余未完成反應(yīng)的蛋白和剩余未反應(yīng)的線性聚乙二醇，得到高純度的聚乙二醇-腫瘤壞死因子TNFβL22Sβ偶聯(lián)物(TNFβL22SSGPEG20)。TNFβL22SSGPEG20的濾液在0.2μm的無菌濾膜上進(jìn)行無菌過濾，得最終無菌蛋白注射液藥物，置于4℃密封無菌避光保存。

實施例9.聚乙二醇化腫瘤壞死因子β(TNFβL22SSGPEG5)的制備

取1.0ml 0.1M pH 8.5的磷酸鈉緩沖液，于水浴中預(yù)熱至30^℃。取2.5微克經(jīng)過純化表達(dá)的TNFβL22S，置于磷酸鈉緩沖液中，使其充分溶解。取62.5微克分子量5000的甲氧基PEG琥珀酰亞胺戊二酸酯(SG-PEG5000)，將其迅速加入至上述溶液中，并適當(dāng)攪拌而使活化聚乙二醇在30秒內(nèi)完全溶解，同時要避免大量氣泡產(chǎn)生。此時TNFβL22S與聚乙二醇用量比為1：25(w/w)。然后，于30℃攪拌下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘，然后加入100.0微克甘氨酸終止反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)溶液置入具備分子量50,000的濾膜裝置的離心管裝置內(nèi)，用高速旋轉(zhuǎn)離心(3000×g，30分鐘)濾除剩余未完成反應(yīng)的蛋白和剩余未反應(yīng)的線性聚乙二醇，得到高純度的聚乙二醇-腫瘤壞死因子β偶聯(lián)物(TNFβL22SSGPEG5)。TNFβL22SSGPEG5的濾液在0.2μm的無菌濾膜上進(jìn)行無菌過濾，得最終無菌蛋白注射液藥物，置于4℃密封無菌避光保存。

實施例10.聚乙二醇化腫瘤壞死因子β(TNFβV4TSCMPEG20)制備方法的放大

取100ml 0.1M pH 8.5的磷酸鈉緩沖液，于水浴中預(yù)熱至30℃。取300微克經(jīng)過速流通陰離子(SPSepharose^TMFastFlow)樹脂交換柱，高度純化而得TNFβV4T蛋白，稀釋溶解入上磷酸鈉緩沖液中。取9000.0微克分子量20,000的聚乙二醇琥珀酰亞胺羧甲基酯(SCM-PEG20000)，將其迅速加入至上述反應(yīng)溶液中，并適當(dāng)攪拌而使活化聚乙二醇在30秒內(nèi)完全溶解，同時要避免氣泡產(chǎn)生。此時TNFβV4T與聚乙二醇用量比為1：30(w/w),于30℃攪拌下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘，然后加入300.0微克甘氨酸終止反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)溶液通過具分子量50,000過濾膜的中空纖維分離柱超濾(Holofiber filtration C06-E050-10-SmPESSpectrum LABS.USA)濃縮至原體積的1/10(10ml)，并將TNFβV4TSCMPEG20與未反應(yīng)的聚乙二醇、甘氨酸分離。向該10ml濃縮液中再次加入0.1M pH7.5的磷酸鈉緩沖液至150ml，通過同樣中空纖維分離柱，再次將體積濃縮至10ml。如此同樣的操作重復(fù)9次，使得0.1M pH7.5的磷酸鈉緩沖液完全取代聚乙二醇化反應(yīng)中的0.1M pH8.5的磷酸鈉緩沖液。濾除剩余未完成反應(yīng)的蛋白，濾除剩余中止反應(yīng)用的甘氨酸，及濾除剩余未反應(yīng)的線性聚乙二醇。第10次濃縮后，取50ml 0.1M pH7.5的磷酸鈉緩沖液清洗中空纖維分離柱以及分離管。清洗液與15ml的濃縮液合并后所得濾液經(jīng)0.2μm的無菌濾膜進(jìn)行無菌過濾，得最終產(chǎn)物TNFβV4TSCMPEG20。最終產(chǎn)物分裝為1.0毫升滅菌無菌安培瓶，并置于4℃密封無菌避光保存。

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測試?yán)?.蛋白濃度、純度分析

蛋白濃度分析方法：采用Bradford-Lowry方法來測定蛋白質(zhì)的濃度。首先以已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白所結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染料的量繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，通過測定蛋白的染料結(jié)合量推斷出該蛋白質(zhì)樣品濃度。

蛋白純度分析方法：蛋白生物大分子，由于分子量不同，在同一電場條件下，可由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將不同分子量、不同種類的蛋白生物大分子分開。在確定雜蛋白是否存在的同時，也可以確定未知蛋白質(zhì)的純度和蛋白分子的大小。

圖2為SDS-聚丙烯酰胺凝焦電泳測定TNFβ、TNFβSCMPEG20、TNFβSGPEG20等的純度圖。由圖2可知，實施例2中，裂解緩沖液破菌后的上清液水溶性表達(dá)蛋白，經(jīng)過鎳離子親和柱純化后，可得到大量的低純度(＞95％)TNFβ蛋白。再進(jìn)一步用離子交換樹脂純化可以得到高純度(＞99.5％)的蛋白。經(jīng)過PEG修飾后所得的TNFβSCMPEG20、TNFβSGPEG20分子量增大而留滯于高分子量區(qū)域。

按照如上方法分析了各個TNFβ類似物(TNFβV4T、TNFβL22S)的純度，結(jié)果均得到了高純度的TNFβ類似物(TNFβV4TL22S的電泳圖結(jié)果相同，數(shù)據(jù)未顯示)。

測試?yán)?.本申請偶聯(lián)物對小鼠成纖維瘤細(xì)胞L929的致死活性分析

小鼠成纖維瘤細(xì)胞L929購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，體外培養(yǎng)于補充有10％小牛血清配制的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)體外細(xì)胞培養(yǎng)液(簡稱DMEM+10％FCS)，孵育生長于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中(Humphreys DT1,Wilson MR Cytokine.1999Oct；11(10):773-82.Modes of L929cell death induced by TNF-alpha and other cytotoxic agents)。處于對數(shù)生長期的L929細(xì)胞，用1％胰蛋白酶消化后計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5x10⁴/ml，按100μl/孔將L929細(xì)胞加入96孔板中，每組4個復(fù)孔，每板設(shè)定6個藥物濃度組。回置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24小時后，用DMEM培養(yǎng)液，按以下濃度依次倍比稀釋由前述實施例制得的蛋白或偶聯(lián)物：0(對照孔)、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/ml、10.0μg/mL。

加入蛋白或偶聯(lián)物后將96孔板回置于培養(yǎng)箱中，持續(xù)培養(yǎng)96小時。次日，取出96孔板，依照Monoclonal antibody targeting of N-cadherin inhibits prostate cancer growth,metastasis and castration resistance.Nature Medicine,2010，16(12),1414-1420描述的方法向每孔加入10μL CCK8酶底物溶液，并將培養(yǎng)板在37℃、5％CO₂恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時。然后，用酶標(biāo)儀(TECAN infinite200PRO)測定在450nm處的吸光度，然后計算，并繪制曲線得到IC₅₀數(shù)據(jù)。

另外，按照如上文獻(xiàn)所述的方法，測定TNFβ、TNFβV4T、TNFβL22S、TNFβSGPEG5、TNFβSGPEG10、TNFβSGPEG20、TNFβSCMPEG5、TNFβSCMPEG10、TNFβSCMPEG20、TNFβV4TSGPEG20、TNFβL22SSGPEG20對小鼠成纖維瘤L929細(xì)胞的致死活性。所得到的活性結(jié)果如下表2和表3所示。

表2.本申請的蛋白和偶聯(lián)物對小鼠成纖維瘤細(xì)胞L929的致死活性

由上表2可知，高度純化后的野生型TNFβ蛋白對于靶標(biāo)測試L929細(xì)胞具有高度的細(xì)胞致死活性，體外癌細(xì)胞致死活性IC₅₀值在6.5±2.8ng/mL。

經(jīng)過聚乙二醇20000的活化聚乙二醇酯的化學(xué)修飾后的偶聯(lián)蛋白，依然保持了高強度的L929細(xì)胞致死活性，其中TNFβSGPEG20、TNFβSCMPEG20的IC₅₀值分別是16.2±8.38ng/mL、12.5±4.2ng/mL。

相對而言，聚乙二醇SCM5000、聚乙二醇SCM10000、聚乙醇SG5000、聚乙醇SG10000的化學(xué)修飾作用后，IC₅₀值分別大幅度升高，這指示不能夠充分保留對L929腫瘤細(xì)胞致死活性。

相對野生型TNFβ而言，用蘇氨酸取代第4位纈氨酸；用絲氨酸取代第22位亮氨酸的兩個點突變的TNFβ類似物不但可增加親水性氨基酸所帶來的蛋白水溶性(根據(jù)蛋白生物學(xué)公知的常識，技術(shù)人員能夠明確地預(yù)期，將疏水性氨基酸如纈氨酸置換為親水性氨基酸如蘇氨酸；或者將疏水性氨基酸亮氨酸用親水性絲氨酸取代時，蛋白的水溶性可以大幅度升高)，而且可以維持＞30％以上的野生型TNFβ的體外癌細(xì)胞致死活性(IC₅₀值分別是13.2±4.8；21.2±6.7，降低了2倍和3.2倍)。

經(jīng)過用同樣的聚乙二醇修飾后，兩個TNFβ類似物的偶聯(lián)物TNFβV4TSCMPEG20和TNFβL22SSCMPEG20的體外癌細(xì)胞致死活性均略下降，IC₅₀值分別為31.6±15.7ng/mL和61.2±6.7ng/mL。

上述體外活性實驗數(shù)據(jù)顯示，分子量為20000的活化聚乙二醇酯化學(xué)修飾的情況下，野生型TNFβ蛋白和TNFβV4T、TNFβL22S同樣可以保持對靶標(biāo)癌細(xì)胞L929的體外高度致死活性。分子量為5000和10000的兩種聚乙二醇酯化學(xué)修飾，則不能夠充分保留對于野生型TNFβ蛋白和TNFβV4T、TNFβL22S的體外癌細(xì)胞致死活性。此外，TNFβSGPEG20可達(dá)到最高的腫瘤細(xì)胞致死活性。

表3.聚乙二醇的分子量和活化類型對偶聯(lián)物的小鼠成纖維瘤細(xì)胞L929致死活性的影響

由上表3可知，聚乙二醇鏈長對于小鼠成纖維瘤細(xì)胞L929的致死活性具有決定性的作用。當(dāng)SCM聚乙二醇或SG聚乙二醇為PEG5000時，修飾后的TNFβ-聚乙二醇偶聯(lián)物失去了105至704倍的活性。當(dāng)SCM聚乙二醇或SG聚乙二醇為PEG10000時，聚乙二醇化學(xué)修飾后的TNFβ-聚乙二醇偶聯(lián)物失去了近27至65倍的細(xì)胞致死活性。當(dāng)SCM聚乙二醇或SG聚乙二醇為PEG20000時，聚乙二醇化學(xué)修飾后的TNFβ-聚乙二醇偶聯(lián)物僅僅失去了近1.9至2.5倍的體外細(xì)胞致死活性。由此可見，最佳選擇的聚乙二醇是PEG20000，經(jīng)SCMPEG、SGPEG修飾后的偶聯(lián)物并無過度的活性降低，且可達(dá)到最低限度失活，和最高程度的小鼠成纖維瘤細(xì)胞L929體外致死活性(分別為12.5±4.2，16.2±8.8ng/mL)。

測試?yán)?.本申請偶聯(lián)物對惡性腫瘤細(xì)胞的致死活性分析

靶標(biāo)細(xì)胞為惡性人體黑色素癌A375細(xì)胞、肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞、結(jié)腸癌胞HCT116細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌A549、和乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

各靶標(biāo)細(xì)胞，體外培養(yǎng)于外加10％小牛血清配制的DMEM+10％FCS體外細(xì)胞培養(yǎng)液，孵育生長于5％CO₂、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中。處于對數(shù)生長期的靶標(biāo)細(xì)胞用1％胰蛋白酶消化后計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5x10⁴/ml，每孔100μl加入96孔板，每組4個復(fù)孔，每板設(shè)定6個濃度組，回置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中。

培養(yǎng)24小時后，用DMEM培養(yǎng)液，按以下濃度依次倍比稀釋由上述實施例制得的蛋白或偶聯(lián)物：0(對照孔)、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/ml、10.0μg/mL。

加入蛋白或偶聯(lián)物后將96孔板回置于培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)72小時。次日，取出96孔板，向每孔加入10μL CCK8酶底物溶液,再將培養(yǎng)板在37℃、5％CO₂恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時。然后，用酶標(biāo)儀(TECAN infinite200PRO)測定在450nm處的吸光度，并繪制曲線,測得IC₅₀數(shù)據(jù)如下表4。

表4.本申請的蛋白或偶聯(lián)物對惡性腫瘤細(xì)胞的致死活性IC₅₀值(ng/mL)

如上表4所示，TNFβ、TNFβV4T、TNFβV4TSCMPEG20、TNFβSCMPEG20對人體惡性腫瘤細(xì)胞展示了不同程度的致死細(xì)胞活性，但相于三種惡性腫瘤細(xì)胞活性敏感度均比對于小鼠成纖維瘤L929細(xì)胞略低。IC₅₀值顯示對惡性非小細(xì)胞肺癌敏感性最高，成為臨床第一目標(biāo)適應(yīng)癥。

測試?yán)?.裸小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性分析

建立荷瘤裸鼠模型

將小鼠成纖維瘤細(xì)胞L929(11)于外加10％胎牛血清的DMEM基培養(yǎng)液中培養(yǎng)生長，達(dá)到處于對數(shù)生長期。用1％胰蛋白酶消化后計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×10⁷/ml，然后將0.3mL細(xì)胞懸浮液(3.0×10⁶細(xì)胞)接種注射入Balb/c裸小鼠(購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司)背部。

L929靶標(biāo)細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長，定期用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積，體積達(dá)到100至150mm³后，用于活性測試。

將上述裸鼠分為對照或治療組，每組5只，分別尾靜脈注射PBS(溶劑對照組)和TNFβ或TNFβSCMPEG20(治療組)。以0.3μg和1.0μg每日注射一次，連續(xù)給藥21天(qd x 21)；或者以0.3μg和1.0μg每周注射一次，連續(xù)給藥3周(q7d x 3)。

給藥后逐日記錄動物的毒性反應(yīng)情況，每周測量一次腫瘤體積，兩次測量裸小鼠體重變化，計錄動物死亡情況，計算中位存活天數(shù)，并制作體重變化曲線和動物存活曲線(Kaplan-Meier plot)。用改良寇氏法計算測試藥物對裸鼠的半數(shù)致死量(50％Lethal Dose,LD₅₀)，研究本申請的蛋白和偶聯(lián)物殺死惡性腫瘤的活性，定量分析TNFβ和TNFβSGPEG20的抗腫瘤效應(yīng)。所得到的結(jié)果如下表5所示。

表5.裸鼠L929腫瘤模型中的抗腫瘤活性

如上表5所示，本申請的蛋白和偶聯(lián)物在本實驗動物模型中，以每天尾靜脈給藥0.3μg連續(xù)給藥21天情況下，能夠抑制55％的L929腫瘤體積生長，能夠延長荷瘤裸鼠存活時間186％。

當(dāng)TNFβ給藥劑量提高至1.0μg，連續(xù)21天經(jīng)尾靜脈注射給藥情況下，雖然能夠抑制75％腫瘤L929體積，但是并不能夠延長荷瘤裸鼠生命時間(-8％)，充分證明高劑量(1.0μg)TNFβ可以導(dǎo)致裸鼠全身毒性，甚至于縮短荷瘤裸鼠8％的存活時間。

以每周(7天)尾靜脈給藥一次，每次0.3μg，連續(xù)給藥3周(總共三次，共21天)情況下，TNFβ僅僅能夠抑制1.9％裸鼠體內(nèi)L929腫瘤體積生長，也并不能夠延長荷瘤裸鼠存活時間(0％)。

用TNFβSCMPEG20經(jīng)尾靜脈給藥，每周(7天)尾靜脈給藥一次，每次注射給藥0.3μg，連續(xù)給藥3周(總共三次，共21天)情況下，TNFβSCMPEG20能夠抑制58％裸鼠體內(nèi)L929腫瘤體積生長，同時也能夠顯著延長荷瘤裸鼠存活時間(209％)。這個每周給藥實驗數(shù)據(jù)充分顯示，中劑量(0.3μg)尾靜脈給藥情況下，TNFβSCMPEG20可以避免高劑量(1.0μg/只/每天)注射TNFβ對于裸鼠的體內(nèi)毒性造成的提前死亡，并顯示出最佳抑制腫瘤生長，延長荷瘤裸鼠的存活時間209％的治療效果。在此實驗條件下，使用較高劑量TNFβSCMPEG20(1.0μg/只/q7d x3；或者使用較高劑量TNFβSCMPEG20(1.0μg/只/qdx21)在次小鼠體內(nèi)試驗上產(chǎn)生全身系統(tǒng)性藥物毒性，造成動物提前死亡，因而無法測定抑制腫瘤生長效果。

用中劑量TNFβSCMPEG20(0.3μg/只)q7d x3活性明顯優(yōu)于中劑量TNFβ(0.3μg/只)q7d x 3、中劑量TNFβ(0.3μg/只)qd x 21以及高劑量TNFβ(1.0μg/只)qd x 21的體內(nèi)活性。

每周給藥實驗結(jié)果顯示了，20,000活化聚乙二醇修飾的TNFβ偶聯(lián)蛋白能夠延長藥效時間，而能夠達(dá)到每周給藥一次的治療惡性腫瘤的目的。

本申請利用聚乙二醇修飾技術(shù)，改善了非腸道給藥TNFβ蛋白藥物半衰期短的缺點，從而有助于在人體上利用非腸道給藥方式抑制惡性腫瘤細(xì)胞生長。