杜松烷型倍半萜Salicifoliusin A及其制備方法和應(yīng)用
【專利說(shuō)明】杜松燒型倍半瞄Sa I i c i fo I i US i η A及其制備方法和應(yīng)用 (-)技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及一種杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A及其制備方法和應(yīng)用。 (二)【背景技術(shù)】
[0002] 蠟梅在我國(guó)已有1000多年的栽培歷史，作為一種香花植物，其葉和花具有揮發(fā)性 的芳香油，香氣怡人，常作為花弁盆景和鮮切花來(lái)觀賞，因此是我國(guó)著名觀賞植物之一。作 為觀賞植物，蠟梅不僅可W在公園、花地等地方孤植或者叢植，也可W栽培在建筑物前、草 坪中或者道路兩旁，還可作為盆景，栽培于室內(nèi)。
[0003] 蠟梅屬植物除了觀賞價(jià)值外還具有藥用價(jià)值?！顿F陽(yáng)民間藥草》中記載，顯示蠟梅 花可沖泡為茶，作為一種治療咳嗽的藥茶，因此蠟梅也是一種中藥材，廣泛被人們利用，在 蘇南民間就是用蠟梅花來(lái)治療感冒咳嗽。蠟梅不僅可治療感冒咳嗽，還可W治療因風(fēng)寒引 起的腹痛、腹脹、消化不良，也可W治療傷食引起的胃炎、胃痛、泛酸。
[0004] 柳葉蠟梅(學(xué)名：化imonanthus salicifolius S.Y.化)又名山蠟梅、亮葉蠟梅、毛 山茶、巖馬桑、香風(fēng)茶、石涼茶等，為蠟梅科蠟梅屬常綠灌木，是中國(guó)特有的屬、種，主要產(chǎn)于 安徽、江西、浙江。柳葉蠟梅也被應(yīng)用于醫(yī)藥研究，表明其具有抗病毒、止咳化疲、抗菌等療 效。其提取物對(duì)人宮頸癌皿LA和人胃癌SGC-7901的生長(zhǎng)有抑制作用。柳葉蠟梅葉具有濃郁 的香味，其精油成分不僅有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、桂疲作用，還能抑制食欲，明顯減緩小鼠體重增長(zhǎng)， 起到減肥作用。該藥使用歷史悠久、療效確切、副作用較少，是值得研究開發(fā)的藥茶多用品 種。經(jīng)國(guó)家有關(guān)科研單位測(cè)定，柳葉蠟梅含揮發(fā)油、搬皮素、堿、黃酬類等多種有效性成分， 鐵、巧、鋒、儀、砸等微量元素及維生素 B1、維生素 B2、維生素 C等含量豐富，并含18種氨基酸。
[0005] 本發(fā)明W柳葉蠟梅枝干等器官為研究對(duì)象，進(jìn)行提取、分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定得到8 α-徑基-T-muurolol(命名為：Salicifoliusin A)，屬于倍半祗類化合物，該化合物具有明 顯的免疫活性。 (Ξ)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A及其制備方法和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[000引一種式（I)所示的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A:
[0009]
[0010] 一種式（I)所示的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A的制備方法，所述的制備方 法按如下步驟進(jìn)行：
[0011] (1)將柳葉蠟梅的枝干進(jìn)行粉碎干燥后，用乙醇浸提提取，之后過濾除去不溶物， 取濾液減壓濃縮得到乙醇浸膏；
[0012] (2)將步驟（1)所得乙醇浸膏分散于水中，得到懸浮液，再將所得懸浮液用石油酸 進(jìn)行萃取，得到石油酸萃取液，減壓濃縮后得到石油酸浸膏；
[0013] (3)脫00~300目柱層析硅膠對(duì)步驟(2)所得石油酸浸膏進(jìn)行柱層析分離，W石油 酸/乙酸乙醋體積比為9:1~1:9的混合液為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集含目標(biāo)化合物的洗 脫液，減壓濃縮后合并得粗品，所得粗品依次經(jīng)洗涂、重結(jié)晶，得到所述的杜松燒型倍半祗 Salicifoliusin A;所述粗品的洗涂采用石油酸、乙酸乙醋中的一種或兩者W任意比例的 混合液;所述粗品的重結(jié)晶采用甲醇作為重結(jié)晶溶劑。
[0014] 本發(fā)明所述的制備方法，步驟(1)中，推薦用于浸提提取的乙醇為體積分?jǐn)?shù)95%的 乙醇;所述乙醇浸提提取的具體操作方法為:將粉碎干燥后的柳葉蠟梅枝干與乙醇W料液 質(zhì)量比1:0.8~1混合，常溫(20~30°C)浸提5~10天，過濾得到乙醇浸提提取液，重復(fù)浸提2 ~4次，合并每次所得乙醇浸提提取液，50°C減壓旋蒸回收乙醇，得到乙醇浸膏(粘稠狀，無(wú) 醇味）。
[0015] 步驟(2)中，將所述乙醇浸膏分散于水中時(shí)，推薦所述乙醇浸膏與水的質(zhì)量比為1: 2~4;所述懸浮液用石油酸進(jìn)行萃取時(shí)，推薦所述懸浮液用等體積的石油酸萃取3次。
[0016] 步驟(3)中，用200~300目柱層析硅膠對(duì)石油酸浸膏進(jìn)行柱層析分離時(shí)，所述梯度 洗脫的具體操作方法為：W石油酸/乙酸乙醋體積比分別為9:1、7:1、5:1、3.5:1、2:1、1:1、 1:2、1:3.5、1:5、1:7、1:9的混合液為洗脫劑，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑的流速為5~7mL/min (優(yōu)選6mL/min)，每種不同比例洗脫劑的洗脫時(shí)間為300min~400min，收集含目標(biāo)化合物的 洗脫液，減壓濃縮后合并得粗品。
[0017] 本發(fā)明中，所述的目標(biāo)化合物(杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A)進(jìn)行薄層層析 (TLC)時(shí)，通常W石油酸：乙酸乙醋= 1:1為展開劑，其Rf值為0.5。所述的制備方法步驟(3) 中，可通過化C檢測(cè)收集含目標(biāo)化合物的洗脫液。
[001引本發(fā)明所述杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A在制備免疫活性藥物中具有應(yīng)用 前景。根據(jù)免疫活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A與Con A對(duì)照組相 比較，對(duì)小鼠脾細(xì)胞的增值表現(xiàn)出了明確的抑制作用，且具有劑量依賴性，顯示了該化合物 是潛在的降低免疫活性的藥物。
[0019] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0020] 本發(fā)明所述杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A的提取、分離、純化方法簡(jiǎn)單，免疫 活性明確，具有潛在的工業(yè)化制備和開發(fā)為免疫調(diào)節(jié)藥物的價(jià)值，該化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)及其 絕對(duì)構(gòu)型經(jīng)過波譜學(xué)數(shù)據(jù)和X-射線單晶衍射分析得到確認(rèn)，不存在光學(xué)異構(gòu)體，可W避免 光學(xué)異構(gòu)體潛在的風(fēng)險(xiǎn)。 (四）
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1是實(shí)施例1得到的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A的單晶衍射圖。 (五)
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限 于此。
[0023] 實(shí)施例 1 :Salicifoliusin A的制備：
[0024] 提取:將柳葉蠟梅的枝干進(jìn)行粉碎干燥后，得到干燥的柳葉蠟梅枝干粉末879g，用 1.化95 %乙醇常溫浸提一周，過濾得到浸提液，重復(fù)浸提3次，合并每次所得浸提液，減壓蒸 饋得到乙醇浸膏765g，將所得乙醇浸膏分散于3000mL水中，得到懸浮液，再將所得懸浮液用 等體積的石油酸萃取3次，合并得到石油酸萃取液，減壓濃縮后得到石油酸浸膏187g。
[0025] 分離：用200~300目柱層析硅膠(500g)對(duì)石油酸浸膏進(jìn)行柱層析分離，W石油酸/ 乙酸乙醋體積比分別為9:1、7:1、5:1、3.5:1、2:1、1:1、1:2、1:3.5、1:5、1:7、1:9 的混合液為 洗脫劑，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑的流速為6mL/min，每種不同比例洗脫劑的洗脫時(shí)間為 350min，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓濃縮后得到粗品38.6g。
[0026] 提純：所得粗品用石油酸洗去雜質(zhì)，然后用甲醇進(jìn)行重結(jié)晶，得到無(wú)色晶體 0.603g，即為所述的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A。
[0027] 實(shí)施例2:Salicifoliusin A的制備：
[0028] 提取:將柳葉蠟梅的枝干進(jìn)行粉碎干燥后，得到干燥的柳葉蠟梅枝干粉末856g，用 0. 化95 %乙醇常溫浸提一周，過濾得到浸提液，重復(fù)浸提3次，合并每次所得浸提液，減壓蒸 饋得到乙醇浸膏648g，將所得乙醇浸膏分散于2500M^水中，得到懸浮液，再將所得懸浮液用 等體積的石油酸萃取3次，合并得到石油酸萃取液，減壓濃縮后得到石油酸浸膏159g。
[0029] 分離：用200~300目柱層析硅膠(500g)對(duì)石油酸浸膏進(jìn)行柱層析分離，W石油酸/ 乙酸乙醋體積比分別為9:1、6:1、4:1、1:1、1:4、1:6、1:9的混合液為洗脫劑，進(jìn)行梯度洗脫， 洗脫劑的流速為5mL/min，每種不同比例洗脫劑的洗脫時(shí)間為400min，收集含目標(biāo)化合物的 洗脫液，減壓濃縮后得到粗品33.5g。
[0030] 提純:所得粗品用石油酸：乙酸乙醋體積比1:1的混合液洗去雜質(zhì)，然后用甲醇進(jìn) 行重結(jié)晶，得到無(wú)色晶體〇.421g，即為所述的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A。
[0031] 實(shí)施例3:Salicifoliusin A的制備：
[0032] 提取:將柳葉蠟梅的枝干進(jìn)行粉碎干燥后，得到干燥的柳葉蠟梅枝干粉末867g，用 1. 化95 %乙醇常溫浸提一周，過濾得到浸提液，重復(fù)浸提3次，合并每次所得浸提液，減壓蒸 饋得到乙醇浸膏699g，將所得乙醇浸膏分散于3000M^水中，得到懸浮液，再將所得懸浮液用 等體積的石油酸萃取3次，合并得到石油酸萃取液，減壓濃縮后得到石油酸浸膏165g。
[0033] 分離：用200~300目柱層析硅膠(400g)對(duì)石油酸浸膏進(jìn)行柱層析分離，W石油酸/ 乙酸乙醋體積比分別為9:1、7:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、1:7、1:9的混合液為洗脫劑，進(jìn)行 梯度洗脫，洗脫劑的流速為7mL/min，每種不同比例洗脫劑的洗脫時(shí)間為300min，收集含目 標(biāo)化合物的洗脫液，減壓濃縮后得到粗品36.5g。
[0034] 提純：所得粗品用乙酸乙醋洗去雜質(zhì)，然后用甲醇進(jìn)行重結(jié)晶，得到無(wú)色晶體 0.071g，即為所述的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A。
[0035] 實(shí)施例4:化合物測(cè)試
[0036] 表1:實(shí)驗(yàn)所用儀器
[0037]

[0038] 試劑:溶劑均為分析純?cè)噭催M(jìn)行處理。
[0039] 對(duì)實(shí)施例1，實(shí)施例2或?qū)嵤├?制得的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A進(jìn)行理 化和波譜學(xué)分析，m.P. 113-114°C，ESI-MS測(cè)定值m/z: 239[M+扣％237[M-H]-，HR-ESI-MS測(cè)定 值m/z : 261.1833[M+Na]%計(jì)算值261.1825[打5此602化?，確定其分子式為Ci5出602,分子量為 238，不飽和度為3，比旋光度為[a]D2D-81.5(c 0.22，CHCb)。
[0040] 表2:Salicifoliusin A的NMR數(shù)據(jù)（DMS0-d6)
[0041]

[0042] 實(shí)施例5:免疫活性測(cè)試
[0043] 對(duì)實(shí)施例1制得的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A進(jìn)行了體外抗腫瘤活性測(cè) 試。
[0044] 方法：用淋己細(xì)胞增殖的方法，來(lái)檢測(cè)制得的Salicifoliusin A是否具有免疫活 性。首先制備小鼠脾細(xì)胞:雌性小鼠2只，體重為200g，將其處死，用70%乙醇的浸泡，在無(wú)菌 的環(huán)境中取其脾臟，于蒸發(fā)皿中，研磨搗碎，加入3.5mL化nk's液，混合均勻，用尼龍銅布過 濾，濾液放置于lOmL離屯、管，再加入3.5mL化nk' S液洗涂，合并洗涂液共7ιΛ;用1800r/m的 離屯、機(jī)將洗涂液離屯、5min，棄上清液，再用化nk's液洗一次，收集脾細(xì)胞。將收集的脾細(xì)胞 加入到3mL含有10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，混勻后過濾，取細(xì)胞懸液0.1 mL， 加3.9mL 1.5%冰醋酸，混勻，復(fù)2管，計(jì)數(shù)，細(xì)胞總數(shù)為1 X 108個(gè);取全部細(xì)胞懸液加含有 10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，調(diào)整濃度至5X106個(gè)/mL，4°C保存。然后取10化L處 理好的小鼠脾細(xì)胞，加入96孔板中，后加 Con A 5化L(終濃度為化g/mU和不同濃度的倍半 祗各50化，4復(fù)孔，倍半祗濃度梯度設(shè)置為:200、100、50、25、12.5μΜ。空白對(duì)照組設(shè)置為Con A 50化和50化1640完全培養(yǎng)基，將96孔板放置于37°C的C〇2解育箱中培養(yǎng)，48小時(shí)后每孔 中加入50化MTT( 2mg/mL)，培養(yǎng)4h后去上清液，加含1N HC1的DMS0溶液150μLν孔，振蕩 lOmin，使甲瑣充分溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處的每孔內(nèi)溶液的0D值。計(jì)算SI值，SI值二刺 激組的0D值/非刺激組的0D值。
[0045] 結(jié)果：實(shí)施例1所制得的倍半祗Salicifoliusin A與Con A對(duì)照組相比較，對(duì)小鼠 脾細(xì)胞的增值表現(xiàn)出了明確的抑制作用，且具有劑量依賴性。運(yùn)提示該化合物可能是潛在 的降低免疫活性的藥物(如表3所示）。
[0046] 表3:制得的倍半祗體外免疫活性
[0047]


【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種式(I)所示的杜松燒型倍半砲Salicifoliusin A:2. -種式(I)所示的杜松燒型倍半砲Salicifoliusin A的制備方法，其特征在于，所述 的制備方法按如下步驟進(jìn)行： (1) 將柳葉蠟梅的枝干進(jìn)行粉碎干燥后，用乙醇浸提提取，之后過濾除去不溶物，取濾 液減壓濃縮得到乙醇浸膏； (2) 將步驟（1)所得乙醇浸膏分散于水中，得到懸浮液，再將所得懸浮液用石油醚進(jìn)行 萃取，得到石油醚萃取液，減壓濃縮后得到石油醚浸膏； (3) 用200~300目柱層析硅膠對(duì)步驟(2)所得石油醚浸膏進(jìn)行柱層析分離，以石油醚/ 乙酸乙酯體積比為9:1~1:9的混合液為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集含目標(biāo)化合物的洗脫 液，減壓濃縮后合并得粗品，所得粗品依次經(jīng)洗滌、重結(jié)晶，得到所述的杜松烷型倍半萜 Salicifoliusin A;所述粗品的洗滌采用石油醚、乙酸乙酯中的一種或兩者以任意比例的 混合液;所述粗品的重結(jié)晶采用甲醇作為重結(jié)晶溶劑。3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，用于浸提提取的乙醇為體積 分?jǐn)?shù)95 %的乙醇。4. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，所述乙醇浸提提取的具體操 作方法為:將粉碎干燥后的柳葉蠟梅枝干與乙醇以料液質(zhì)量比1:0.8~1混合，常溫浸提5~ 10天，過濾得到乙醇浸提提取液，重復(fù)浸提2~4次，合并每次所得乙醇浸提提取液，50°C減 壓旋蒸回收乙醇，得到乙醇浸膏。5. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述乙醇浸膏與水的質(zhì)量比 為1:2~4〇6. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述懸浮液用等體積的石油 醚萃取3次。7. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述梯度洗脫的具體操作方 法為：以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為9 :1、7:1、5:1、3.5:1、2:1、1 :1、1:2、1:3.5、1:5、1: 7、1:9的混合液為洗脫劑，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑的流速為5~7 111171^11，每種不同比例洗脫 劑的洗脫時(shí)間為300min~400min，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓濃縮后合并得粗品。8. 如權(quán)利要求1所述的杜松烷型倍半萜Salicifoliusin A在制備免疫活性藥物中的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種式(I)所示的杜松烷型倍半萜Salicifoliusin A及其制備方法，本發(fā)明所述杜松烷型倍半萜Salicifoliusin A的提取、分離、純化方法簡(jiǎn)單，免疫活性明確，具有潛在的工業(yè)化制備和開發(fā)為免疫調(diào)節(jié)藥物的價(jià)值，該化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)及其絕對(duì)構(gòu)型經(jīng)過波譜學(xué)數(shù)據(jù)和X?射線單晶衍射分析得到確認(rèn)，不存在光學(xué)異構(gòu)體，可以避免光學(xué)異構(gòu)體潛在的風(fēng)險(xiǎn)；
【IPC分類】C07C29/76, A61P37/02, C07C35/36
【公開號(hào)】CN105712844
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610045940
【發(fā)明人】王奎武, 李丹
【申請(qǐng)人】浙江工商大學(xué)