本發(fā)明涉及顯示水平降低的表面暴露抗原的細胞。更具體地，本發(fā)明涉及細胞的基因工程改造，以減少細胞表面上主要組織相容性復合體I類（MHC-I）的表達。特別地，本發(fā)明涉及這種細胞在包膜病毒顆粒生產(chǎn)中的用途。

發(fā)明背景

基因治療包括將遺傳物質(zhì)摻入細胞以治療或預防疾病。遺傳物質(zhì)可以用那些基因的功能性拷貝補充缺損基因，使不適當功能的基因失活或?qū)⑿碌闹委熁蛞爰毎?/p>

遺傳物質(zhì)向細胞的遞送可以通過使用促進核酸轉移的載體來實現(xiàn)。病毒可以被工程改造以將目標核苷酸（NOI）遞送到靶細胞，并且通常在基因治療中用作載體。迄今為止用于基因治療的病毒包括逆轉錄病毒、腺病毒（AdV）、腺相關病毒（AAV）、單純皰疹病毒（HSV）和牛痘病毒。

逆轉錄病毒，例如α-逆轉錄病毒、γ-逆轉錄病毒、慢病毒和泡沫病毒，對于基因治療特別有用，因為它們允許校正遺傳物質(zhì)穩(wěn)定整合到靶細胞中。在基于用于以下的源自γ-逆轉錄病毒的載體的臨床試驗中已經(jīng)實現(xiàn)了治療益處：腺苷脫氨酶嚴重聯(lián)合免疫缺陷（ADA-SCID; Aiuti，A.等人（2009）N. Engl. J. Med. 360：447- 58）、X-連鎖性嚴重聯(lián)合免疫缺陷（SCID-X1; Hacein-Bey-Abina，S.等人（2010）N. Engl. J. Med. 363：355-64）和Wiskott-Aldrich綜合征（WAS; Boztug，K.等人（2010）N. Engl. J. Med. 363：1918-27）。此外，慢病毒載體已經(jīng)用作治療X-連鎖性腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良的遞送載體（ALD; Cartier，N.等人（2009）Science 326：818-23），和最近用于異染色性腦白質(zhì)障礙癥（MLD; Biffi，A.等人（2013）Science 341：1233158）和WAS（Aiuti，A.等人（2013）Science 341：1233151）。在臨床前研究中，也已經(jīng)靜脈內(nèi)施用慢病毒載體用于血友病的小鼠和狗模型中的該疾病的肝臟定向基因治療（Cantore A.等人，Blood 2012; Matsui H.等人，Mol Ther 2011; Cantore A.等人，Science Translational Medicine 2015 7：277ra28）。然而，與在基因治療中使用病毒載體相關的顯著問題是它們被靶生物體的免疫系統(tǒng)識別。在包膜病毒載體顆粒（例如逆轉錄病毒載體顆粒）的情況下，可以識別顯示在病毒包膜表面上的膜結合蛋白，并且可以中和病毒顆粒本身。此外，在感染靶細胞時，病毒包膜與細胞膜整合，并因此病毒包膜蛋白可以顯示在細胞表面上或保持與細胞表面的緊密結合。因此，免疫系統(tǒng)也可以靶向病毒載體顆粒已經(jīng)感染的細胞。這兩種效應可能導致通過病毒載體的NOI遞送的功效的降低。

病毒顆粒包膜通常源于生產(chǎn)細胞的膜。因此，在病毒顆粒從其中芽生的細胞膜上表達的膜蛋白可以摻入病毒包膜中。主要組織相容性復合體I類（MHC-I）是一種這樣的細胞膜蛋白，并且因為其在性質(zhì)上是高度多態(tài)性的，此外它是身體免疫應答的主要靶標（McDevitt H.O.（2000）Annu. Rev. Immunol. 18：1-17）。

暴露于產(chǎn)生逆轉錄病毒載體的細胞的質(zhì)膜上的MHC-I分子在載體芽殖過程中摻入病毒顆粒包膜中。源自生產(chǎn)細胞并摻入病毒顆粒中的這些MHC-I分子又可以轉移到轉導細胞的質(zhì)膜上?；蛘撸捎诓《绢w粒吸收并保持結合到靶細胞膜的趨勢，MHC-I分子可保持與轉導細胞膜緊密結合。

外源MHC-I分子在轉導細胞的質(zhì)膜上存在或與其鄰近可以在人和實驗動物模型中引發(fā)同種異體反應性免疫應答。這可以在離體基因轉移隨后將轉導細胞施用于受試者或者在直接體內(nèi)施用病毒顆粒時，導致轉導細胞的免疫介導的殺傷或吞噬作用。此外，在將帶有MHC-I的病毒顆粒體內(nèi)施用到血流中的情況下，病毒顆粒可在到達其靶細胞之前被預先存在的MHC-I特異性抗體中和。

技術實現(xiàn)要素：

我們已經(jīng)產(chǎn)生了可以用于生產(chǎn)基本上沒有表面暴露的MHC-I分子的包膜病毒顆粒（例如逆轉錄病毒載體顆粒）的基因工程改造細胞。令人驚訝的是，我們已經(jīng)顯示，表面暴露的MHC-I分子的不存在不顯著影響這些細胞產(chǎn)生包膜病毒顆粒的能力。特別地，我們已意料不到地顯示，與展示表面暴露的MHC-I的生產(chǎn)細胞相比，包膜病毒顆粒以相當?shù)牡味群彤a(chǎn)率產(chǎn)生，并且不表現(xiàn)出降低的感染性。用這些細胞產(chǎn)生的包膜病毒顆粒將在基因治療期間引起較少的不期望的免疫應答，并提供更大的功效和安全性。

一方面，本發(fā)明提供了包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞，其中所述細胞被基因工程改造以減少細胞表面上的MHC-I的表達。

在另一方面，本發(fā)明提供了包膜病毒顆粒包裝細胞，其中所述細胞被基因工程改造以減少細胞表面上的MHC-I的表達。

在一個實施方案中，包膜病毒顆粒包裝或生產(chǎn)細胞包含編碼β2-微球蛋白（β2M）的基因的基因工程改造破壞。在另一個實施方案中，所述細胞包含編碼MHC-I α鏈的一個或多個基因的基因工程改造破壞。所述細胞可以在編碼β2-微球蛋白的基因的所有拷貝中包含基因工程改造破壞。所述細胞可以在編碼MHC-I α鏈的基因的所有拷貝中包含基因工程改造破壞。所述細胞可以包含編碼β2-微球蛋白的基因的基因工程改造破壞和編碼MHC-I α鏈的基因的基因工程改造破壞兩者。

可以減少細胞表面上MHC-I的表達，使得所述細胞基本上沒有表面暴露的MHC-I分子。

術語病毒顆?！吧a(chǎn)細胞”包括在產(chǎn)生病毒顆粒所必需的所有元件的瞬時轉染、穩(wěn)定轉染或載體轉導后產(chǎn)生病毒顆粒的細胞，或工程改造成穩(wěn)定包含產(chǎn)生病毒顆粒所必需的元件的任何細胞。

術語“包裝細胞”包括含有包裝感染性重組病毒所需的一些或所有元件的細胞。包裝細胞可以缺少重組病毒載體。通常，這種包裝細胞含有能夠表達病毒結構蛋白的一種或多種載體。通過隨后的每個額外所需元件的瞬時轉染、轉導或穩(wěn)定整合的步驟，僅包含用于產(chǎn)生包膜病毒顆粒所需要的一些元件的細胞可用作產(chǎn)生病毒顆粒生產(chǎn)細胞系的中間反應物。這些中間反應物包括在術語“包裝細胞”中。隨后用于產(chǎn)生包膜病毒顆粒生產(chǎn)者或包裝細胞系的親本細胞也包括在本發(fā)明中，其中細胞表面上的MHC-I的表達已經(jīng)減少。

本文提及的病毒顆粒包括具有復制能力或復制缺陷型病毒，由其獲得的病毒載體，并且其可以或可以不包含目標核苷酸。

在一個實施方案中，包膜病毒顆粒生產(chǎn)者或包裝細胞源自HEK-293細胞。

在一個實施方案中，包膜病毒載體顆粒源自逆轉錄病毒、單純皰疹病毒、牛痘病毒、嗜肝DNA病毒、披膜病毒、黃病毒、沙粒病毒、冠狀病毒、正粘病毒、副粘病毒、布尼亞病毒、波納病毒、彈狀病毒或線狀病毒。

在一個實施方案中，包膜病毒載體顆粒源自逆轉錄病毒、單純皰疹病毒或牛痘病毒。

在一個實施方案中，包膜病毒顆粒源自HIV。

在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞或包裝細胞群體。

在一個實施方案中，該群體中至少約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的細胞已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明進行基因工程改造。

在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞或包裝細胞用于生產(chǎn)包膜病毒顆粒的用途。優(yōu)選地，所述包膜病毒顆粒基本上沒有表面暴露的MHC-I分子。

在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生包膜病毒顆粒的方法，包括以下步驟：

a）提供根據(jù)本發(fā)明的包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞；和

b）在適于產(chǎn)生包膜病毒載體顆粒的條件下培養(yǎng)所述細胞。

在另一方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的包膜病毒顆粒生產(chǎn)方法生產(chǎn)的包膜病毒顆粒。

在另一方面，本發(fā)明提供包含數(shù)目減少的表面暴露的MHC-I分子的包膜病毒顆粒。表面暴露的MHC-I分子的數(shù)目可以減少，使得對MHC-I的免疫應答降低至治療相關程度。

優(yōu)選地，包膜病毒載體顆?；旧蠜]有表面暴露的MHC-I分子。

本發(fā)明的包膜病毒顆?？梢栽醋阅孓D錄病毒、單純皰疹病毒、牛痘病毒、嗜肝DNA病毒、披膜病毒、黃病毒、沙粒病毒、冠狀病毒、正粘病毒、副粘病毒、布尼亞病毒、波納病毒、彈狀病毒或線狀病毒。

所述包膜病毒載體顆粒可以源自逆轉錄病毒、單純皰疹病毒或牛痘病毒。

所述包膜病毒載體顆?？梢栽醋訦IV。

優(yōu)選地，本發(fā)明的包膜病毒顆粒用于蛋白轉移（Bobis-Wozowicz S. 等人，Sci Rep. 2014; Voelkel C.等人，Proc Natl Acad Sci USA 2010; Maetzig T. 等人，Curr Gene Ther. 2012）。

優(yōu)選地，所述包膜病毒顆粒包含目標核苷酸（NOI）。優(yōu)選地，所述包膜病毒顆粒是減毒病毒，例如復制缺陷型病毒。

在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的包膜病毒顆粒群體。

在一個實施方案中，群體中至少約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的顆粒源自本發(fā)明的包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞。在一個實施方案中，群體中100％的顆粒源自本發(fā)明的包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞。在一個實施方案中，群體中的顆?；旧喜话砻姹┞兜腗HC-I。

另一方面，本發(fā)明提供了由本發(fā)明的包膜病毒顆粒轉導的細胞。所述細胞可以是哺乳動物細胞，例如靈長類動物細胞或人細胞。

另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的包膜病毒顆?；虮景l(fā)明的轉導細胞和藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。

在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的包膜病毒顆粒用于治療。本發(fā)明的包膜病毒顆?？捎糜诨蛑委煛?/p>

在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的轉導細胞用于治療。本發(fā)明的轉導細胞可用于基因治療。

在另一方面，本發(fā)明提供了基因治療的方法，包括用本發(fā)明的包膜病毒顆粒轉導細胞。

在一個實施方案中，所述轉導離體進行。

另一方面，本發(fā)明提供了基因治療的方法，包括將本發(fā)明的包膜病毒顆?；虮景l(fā)明的轉導細胞施用于有其需要的受試者。

在另一方面，本發(fā)明提供了用作疫苗的本發(fā)明的包膜病毒顆粒。

在另一方面，本發(fā)明提供了接種疫苗的方法，包括將本發(fā)明的包膜病毒顆粒施用于有其需要的受試者。

附圖說明

圖1

在FACS分選后一個月進行的慢病毒載體（LV）包裝細胞系（A-D）或HEK-293T細胞（E-H）流式細胞術分析（具有異常值的輪廓圖），未處理的、CRISPR/Cas9-處理的、β2M+或β2M-分選如所示。用PE-綴合的抗人β2M和APC-綴合的全抗人MHC-I對細胞染色。

圖2

具有非同源末端連接（NHEJ）的β2M等位基因的百分比，在FACS分選后一個月進行的在慢病毒載體（LV）包裝細胞（A）或HEK-293T細胞（B）中通過錯配選擇性內(nèi)切核酸酶測定法（Cel1 測定）測定的未處理的（UNT）、CRISPR/Cas9-處理的、β2M+或β2M-分選如所示的。

圖3

如所示，通過瞬時轉染，在β2M+或β2M-HEK-293T細胞中產(chǎn)生的慢病毒載體（LV）的滴度（A）、顆粒（B）和感染性（C）（n = 3，對于滴度p = 0.1000，對于顆粒p = 0.3758，對于感染性p = 0.1157）。用1μg/ mL多西環(huán)素（n = 4，p = 0.1010）誘導3天后，由β2M+或β2M-包裝細胞產(chǎn)生的LV的顆粒（D）。

圖4

來自由β2M+（+）或β2M-（-）生產(chǎn)細胞產(chǎn)生的數(shù)批慢病毒載體（LV）的蛋白提取物的蛋白印跡分析。

圖5

基于以每分鐘計數(shù)（CPM）定量的氚化胸苷摻入的增殖測定（A）。數(shù)據(jù)是平均值和SEM（n = 3）。作為實驗條件（用由β2M+（+）或β2M-（-）細胞產(chǎn)生的慢病毒載體（LV）轉導的樹突細胞（DC）孵育的CD4⁺ T細胞）與對照條件（用未轉導的DC孵育的CD4⁺ T細胞）的CPM之間的比率計算的刺激指數(shù)（B）。

發(fā)明詳述

現(xiàn)在將通過非限制性實施例描述本發(fā)明的各種優(yōu)選特征和實施方案。

除非另有說明，本發(fā)明的實踐將采用本領域普通技術人員能力范圍內(nèi)的化學、生物化學、分子生物學、微生物學和免疫學的常規(guī)技術。這樣的技術在文獻中解釋。參見例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F., 和Maniatis，T.（1989）Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. 等人（1995 和定期增刊）Current Protocols in Molecular Biology，第9、13和16章，John Wiley＆Sons; Roe，B.，Crabtree，J.，和Kahn，A.（1996）DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley＆Sons; Polak，J.M.，和McGee，J.O’D.（1990）In Situ Hybridization：Principles and Practice，Oxford University Press; Gait，M.J.（1984）Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press; 和Lilley，D.M. 和Dahlberg，J.E.（1992）Methods in Enzymology：DNA Structures Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNA，Academic Press。這些總體文本中的每一篇通過引用并入本文。

一方面，本發(fā)明提供了包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞，其中所述細胞被基因工程改造以減少細胞表面上的MHC-I的表達。

在另一方面，本發(fā)明提供了包膜病毒顆粒包裝細胞，其中所述細胞被基因工程改造以減少細胞表面上的MHC-I的表達。

MHC-I在細胞表面上的表達減少是指與缺乏基因工程改造的細胞的表面上表達的MHC-I分子的數(shù)目相比，在已被基因工程改造的細胞的表面上表達的MHC-I分子數(shù)目減少，但在其它基本上相同的條件下。

可以減少細胞表面上MHC-I的表達，使得表面暴露的MHC-I分子的數(shù)目例如少于約50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的在不存在基因工程改造時顯示的表面暴露的MHC-I分子的數(shù)目。在一個實施方案中，細胞表面上的MHC-I的表達減少，使得表面暴露的MHC-I分子的數(shù)目為在不存在基因工程改造時顯示的表面暴露的MHC-I分子的數(shù)目的0％。

優(yōu)選減少細胞表面上MHC-I的表達，使得所述細胞基本上沒有表面暴露的MHC-I分子。

“基本上沒有”應理解為與在缺乏基因工程改造的細胞表面上表達的MHC-I分子的數(shù)目相比，在已經(jīng)基因工程改造的細胞的表面上表達的MHC-I分子的數(shù)目顯著減少，使得對由所述細胞產(chǎn)生的包膜病毒顆粒上的MHC-I的免疫應答降低至治療有用的程度。

在另一方面，本發(fā)明提供了包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞或包裝細胞，其中所述細胞包含編碼β2-微球蛋白的基因的基因工程改造破壞。

在另一方面，本發(fā)明提供了包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞或包裝細胞，其中所述細胞包含編碼MHC-I α鏈的基因的基因工程改造破壞。

在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞或包裝細胞的群體。

優(yōu)選地，群體中的細胞的至少約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100%不包含表面暴露的MHC-I。

用于定量細胞群體中細胞表面暴露的蛋白的蛋白表達的方法是本領域已知的。合適的方法包括流式細胞術、熒光激活細胞分選（FACS）和熒光顯微鏡。

例如，細胞群體可以與對MHC-I有特異性的抗體接觸。所述抗體可以被標記以使其能夠檢測。所述抗體可以直接綴合至報道部分（例如熒光標記）?；蛘?，可使綴合至報道部分并對第一抗體有特異性的第二抗體與細胞群體接觸。合適的報道部分是本領域已知的，并且包括例如基于Alexa Fluor和BODIPY的熒光標記。一旦細胞群體已經(jīng)與該抗體接觸，就可以使用適合于允許定量個體細胞上的蛋白表達的技術（例如流式細胞術）來分析群體。在不裂解細胞的情況下進行分析。

用于定量細胞表面暴露的蛋白的蛋白表達的方法還可以使得能夠?qū)毎后w進行分選以產(chǎn)生富集特定特征的細胞群體（例如產(chǎn)生富集的不包含表面暴露的MHC-I的細胞的細胞群體）。例如，熒光激活細胞分選（FACS）使得能夠進行這樣的富集。

類似的方法可以應用于定量單個細胞上細胞表面暴露的蛋白的蛋白表達。例如，該方法可以使用微流體方法。

主要組織相容性復合體I類

主要組織相容性復合體I類（MHC-I）是顯示在細胞膜的外部小葉上的異二聚體膜蛋白（Penn，D.J.（2002）Major Histocompatibility Complex（MHC）eLS，John Wiley＆Sons，http://www.els.net/[DOI：10.1038/npg.els.0000919]）。MHC-I起到結合和顯示蛋白的肽片段至細胞外環(huán)境的作用，在此它們可被CD8⁺細胞毒性T細胞識別。由于中樞和外周耐受機制，從正常細胞蛋白產(chǎn)生的肽片段不會激活細胞毒性T細胞。然而，外源肽（例如源自病毒蛋白的那些）將引起免疫應答的激活以破壞細胞。

同種異體MHC-I蛋白本身可以被免疫系統(tǒng)識別。例如，抗體可以直接結合MHC-I表位。結果，包含來源于同種異體源的MHC-I蛋白的細胞和包膜病毒可以被免疫系統(tǒng)靶向和中和。

人MHC-I也被稱為人白細胞抗原I類（HLA-I），并且在幾乎所有具核細胞上表達。HLA-I由兩條多肽鏈：HLA-I重鏈（α鏈）和β2微球蛋白（β2M）組成。HLA-I α鏈和β2M非共價連接。

HLA-I α鏈是多態(tài)性的。迄今為止已經(jīng)鑒定出6種HLA-I α鏈，包括3種經(jīng)典的高度多態(tài)性的α鏈（HLA-A、HLA-B和HLA-C）和3種非經(jīng)典的，較少多態(tài)性（HLA-E、HLA-F和HLA-G）α鏈。技術人員將能夠容易地確定HLA-I α鏈的核酸序列。例如，可以使用其在染色體的主要組織相容性復合體區(qū)域內(nèi)的位置在基因組序列中鑒定HLA-I α鏈（Penn，D.J.（2002）Major Histocompatibility Complex（MHC）eLS，John Wiley＆Sons，http://www.els.net/[DOI：10.1038/npg.els.0000919]）。

編碼β2M的核酸序列是本領域已知的。例如，人β2M的核酸序列保藏為GenBank登錄號NM_004048。

技術人員將理解，本發(fā)明可適用于MHC-I序列的變體，例如這些序列的多態(tài)性（例如HLA-I α鏈序列和β2M序列）。例如，MHC-I序列的變體可以包括單核苷酸多態(tài)性（SNP）或多個SNP。

MHC-I的基因工程改造

本發(fā)明的包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞或包裝細胞被基因工程改造以減少細胞表面上的MHC-I的表達。

基因工程改造減少蛋白表達的方法是本領域已知的。例如，這可以通過靶向基因敲除來實現(xiàn)。為了減少蛋白表達，可以敲除編碼蛋白本身或其調(diào)節(jié)序列（例如其啟動子）的基因。敲除可以通過缺失編碼核酸序列的一部分來實現(xiàn)，其可以刪除對于表達或穩(wěn)定性必需的蛋白的部分，或改變編碼序列的閱讀框。靶向基因敲除的合適方法包括使用鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄激活物樣效應物核酸酶（TALEN）和基于CRISPR/Cas的RNA指導的核酸酶（Gaj，T.等人（2013）Trends Biotechnol. 31：397-405）。

例如，如果提供設計用于結合基因組中特定基因座的合適的RNA指導，則CRISPR/Cas9 RNA-指導的核酸酶可以用于催化該基因座處的雙鏈斷裂。Cas9和指導RNA可以通過轉染編碼蛋白和RNA的載體而遞送至靶細胞。細胞嘗試使用非同源末端連接（NHEJ）途徑修復其DNA中的任何雙鏈斷裂。這是一種容易出錯的機制，其插入隨機核苷酸并且通常破壞靶基因的閱讀框。

或者，可以使用RNAi技術，或微小RNA或反義RNA以抑制靶基因表達來完成基因工程改造以減少蛋白表達。

一旦進行了靶基因敲除或表達抑制的方法，可以篩選所得的細胞群體，以選擇和富集表現(xiàn)出目標表型的那些細胞，例如表面暴露的MHC-I的表達減少。用于篩選和富集的合適技術是本領域已知的，并包括流式細胞術和熒光激活細胞分選（FACS）。

在一個實施方案中，包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞或包裝細胞包含編碼β2-微球蛋白的基因的基因工程改造破壞。β2-微球蛋白穩(wěn)定MHC-I，因此β2-微球蛋白缺陷的細胞將表現(xiàn)出MHC-I在細胞表面上的表達減少。該細胞可以在編碼β2-微球蛋白的基因的所有拷貝中包含基因工程改造破壞。

在另一個實施方案中，所述細胞包含編碼MHC-I α鏈的基因的基因工程改造破壞。該細胞可以在編碼MHC-I α鏈的基因的所有拷貝中包含基因工程改造破壞。

該細胞可以包含編碼β2-微球蛋白的基因的基因工程改造破壞和編碼MHC-I α鏈的基因的基因工程改造破壞兩者。

載體

載體是允許或促進實體從一個環(huán)境到另一個環(huán)境的轉移的工具。本發(fā)明的病毒顆?？梢允禽d體。

本發(fā)明的病毒載體顆粒是包膜病毒顆粒。

包膜病毒顆粒包含外部脂質(zhì)雙層膜。許多包膜病毒是本領域已知的，包括逆轉錄病毒、單純皰疹病毒、牛痘病毒、嗜肝DNA病毒、披膜病毒、黃病毒、沙粒病毒、冠狀病毒、正粘病毒、副粘病毒、布尼亞病毒、波納病毒、彈狀病毒和線狀病毒。

逆轉錄病毒和慢病毒載體

逆轉錄病毒載體可以源自任何合適的逆轉錄病毒或可以從任何合適的逆轉錄病毒獲得。已經(jīng)鑒定了大量不同的逆轉錄病毒。實例包括鼠白血病病毒（MLV）、人T細胞白血病病毒（HTLV）、小鼠乳腺瘤病毒（MMTV）、勞斯肉瘤病毒（RSV）、Fujinami肉瘤病毒（FuSV）、莫洛尼鼠白血病病毒（Mo-MLV）、FBR鼠骨肉瘤病毒（FBR MSV）、莫洛尼鼠肉瘤病毒（Mo-MSV）、Abelson鼠白血病病毒（A-MLV）、禽類髓細胞瘤病病毒-29（MC29）和禽類成紅細胞白血病病毒（AEV）。逆轉錄病毒的詳細列表可以在Coffin，J.M.等人（1997）Retroviruses，Cold Spring Harbor Laboratory Press，758-63中找到。

逆轉錄病毒可以大致分為兩類，“簡單”和“復雜”。逆轉錄病毒甚至可以進一步分成七組。這些組中的五個表示具有致癌潛力的逆轉錄病毒。其余兩組是慢病毒和泡沫病毒。這些逆轉錄病毒的綜述在Coffin，J.M.等人（1997）Retroviruses，Cold Spring Harbor Laboratory Press，758-63中呈現(xiàn)。

逆轉錄病毒和慢病毒基因組的基本結構具有許多共同的特征，例如5’長末端重復（LTR）和3’LTR。以下位于它們之間或之內(nèi)：能夠包裝基因組的包裝信號、引物結合位點、能夠整合入宿主細胞基因組的整合位點，以及編碼包裝組分的gag、pol和env基因 - 這些是病毒顆粒的裝配所需的多肽。慢病毒具有額外的特征，例如HIV中的rev和RRE序列，其使得能夠?qū)⒄系脑《镜腞NA轉錄物從細胞核有效輸出到感染的靶細胞的細胞質(zhì)。

在原病毒中，這些基因在兩端通過稱為LTR的區(qū)域側接。LTR負責原病毒整合和轉錄。LTR也用作增強子-啟動子序列并且可以控制病毒基因的表達。

LTR本身是相同的序列，其可以被劃分為三個元件：U3、R和U5。U3源自RNA的3'末端獨特的序列。R來源于在RNA兩個末端重復的序列。U5源自RNA的5'末端獨特的序列。三種元件的大小可在不同的逆轉錄病毒之間顯著變化。

在缺陷型逆轉錄病毒載體基因組中，gag、pol和env可以不存在或不起作用。

在典型的逆轉錄病毒載體中，可以從病毒中去除對于復制必需的一個或多個蛋白編碼區(qū)的至少一部分。這使得病毒載體成為復制缺陷型。病毒基因組的部分也可以被文庫取代，所述文庫編碼與載體基因組中的調(diào)節(jié)控制區(qū)和報道部分可操作地連接的候選調(diào)節(jié)部分，以便產(chǎn)生包含能夠轉導靶宿主細胞和/或?qū)⑵浠蚪M整合到宿主基因組中的候選調(diào)節(jié)部分的載體。

慢病毒載體是更大組的逆轉錄病毒載體的一部分。慢病毒的詳細列表可以在Coffin，J.M.等人（1997）Retroviruses，Cold Spring Harbor Laboratory Press，758-63中找到。簡而言之，慢病毒可以分為靈長類組和非靈長類組。靈長類慢病毒的實例包括但不限于人免疫缺陷病毒（HIV），其是人獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）的病原體；和猿猴免疫缺陷病毒（SIV）。非靈長類慢病毒的實例包括原型“慢病毒”腦膜腦炎/呼吸困難病毒（VMV）以及相關的山羊關節(jié)炎-腦炎病毒（CAEV）、馬感染性貧血病毒（EIAV）和最近描述的貓免疫缺陷病毒（FIV）和牛免疫缺陷病毒（BIV）。

慢病毒家族與逆轉錄病毒不同，其在于慢病毒具有感染分裂和非分裂細胞的能力（Lewis，P等人（1992）EMBO J. 11：3053-8；Lewis，P.F.等人（1994）J. Virol. 68：510-6）。相反，其它逆轉錄病毒如MLV不能感染非分裂或緩慢分裂的細胞，例如構成例如肌肉、腦、肺和肝組織的那些。

如本文所用的慢病毒載體是包含至少一個可源自慢病毒的組成部分的載體。優(yōu)選地，該組成部分參與載體感染細胞、表達基因或復制的生物機制。

慢病毒載體可以是“靈長類”載體。慢病毒載體可以是“非靈長類”載體（即源自不主要感染靈長類動物，特別是人的病毒）。非靈長類慢病毒的實例可以是不天然感染靈長類動物的慢病毒科的任何成員。

作為基于慢病毒的載體的實例，下文描述了基于HIV-1和HIV-2的載體。

HIV-1載體含有順式作用元件，其也存在于簡單的逆轉錄病毒中。已經(jīng)表明，延伸到gag開放閱讀框中的序列對于HIV-1的包裝是重要的。因此，HIV-1載體通常含有gag的相關部分，其中翻譯起始密碼子已突變。此外，大多數(shù)HIV-1載體還含有包括RRE的env基因的一部分。Rev結合到RRE，其允許全長或單股剪接（singly spliced）的mRNA從細胞核轉運到細胞質(zhì)。在不存在Rev和/或RRE的情況下，全長HIV-1 RNA在細胞核中積累?；蛘?，來自某些簡單逆轉錄病毒如Mason-Pfizer猴病毒的組成型轉運元件可用于減少對Rev和RRE的需要。從HIV-1 LTR啟動子的有效轉錄需要病毒蛋白Tat。

大多數(shù)基于HIV-2的載體在結構上與HIV-1載體非常類似。與基于HIV-1的載體相似，HIV-2載體也需要RRE來有效轉運全長或單股剪接的病毒RNA。

在一個系統(tǒng)中，所述載體和輔助構建體來自兩種不同的病毒，并且降低的核苷酸同源性可以降低重組的概率。除了基于靈長類慢病毒的載體外，基于FIV的載體也已經(jīng)被開發(fā)作為源自病原性HIV-1基因組的載體的替代。這些載體的結構也與基于HIV-1的載體類似。

優(yōu)選地，用于本發(fā)明的病毒載體具有最小的病毒基因組。

“最小病毒基因組”應理解為已經(jīng)操作病毒載體以去除非必需元件并保留必需元件，以便提供所需的功能以感染、轉導和遞送目標核苷酸序列至靶宿主細胞。該策略的進一步細節(jié)可以在WO 1998/017815中找到。

優(yōu)選地，用于在宿主細胞/包裝細胞內(nèi)產(chǎn)生病毒基因組的質(zhì)粒載體將具有足夠的慢病毒遺傳信息，以允許在包裝組分存在下將RNA基因組包裝到能夠感染靶細胞的病毒顆粒中，但不能獨立復制以在最終靶細胞內(nèi)產(chǎn)生感染性病毒顆粒。優(yōu)選地，載體缺少功能性gag-pol和/或env基因和/或?qū)τ趶椭票匦璧钠渌颉?/p>

然而，用于在宿主細胞/包裝細胞內(nèi)產(chǎn)生病毒基因組的質(zhì)粒載體還將包括與慢病毒基因組可操作地連接以引導基因組在宿主細胞/包裝細胞中轉錄的轉錄調(diào)節(jié)控制序列。這些調(diào)節(jié)序列可以是與轉錄的病毒序列（即5'U3區(qū)）相關的天然序列，或者它們可以是異源啟動子，例如另一種病毒啟動子（例如CMV啟動子）。

所述載體可以是其中病毒增強子和啟動子序列已被缺失的自我失活（SIN）載體。可以以與野生型載體相似的效力在體內(nèi)產(chǎn)生SIN載體并轉導非分裂細胞。SIN原病毒中長末端重復（LTR）的轉錄失活應當阻止具有復制能力的病毒的動員。這還應該能夠通過消除LTR的任何順式作用效應來從內(nèi)部啟動子調(diào)節(jié)基因表達。

所述載體可以是整合缺陷的。整合缺陷型慢病毒載體（IDLV）可以例如通過用催化失活的整合酶包裝載體（例如在催化位點具有D64V突變的HIV整合酶; Naldini，L.等人（1996）Science 272：263-7; Naldini，L.等人（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：11382-8; Leavitt，A.D.等人（1996）J. Virol. 70：721-8）或通過修飾或缺失來自載體LTR的重要att序列（Nightingale，S.J.等人（2006）Mol. Ther. 13：1121-32），或通過上述的組合來產(chǎn)生。

源自HIV的載體

用于本發(fā)明的源自HIV的載體在HIV毒株方面沒有特別限制。可以在HIV序列數(shù)據(jù)庫（http://www.hiv.lanl.gov/content/index）中找到HIV毒株序列的許多實例。

源自單純皰疹病毒（HSV）的載體

單純皰疹病毒（HSV）是天然感染神經(jīng)元的包膜雙鏈DNA病毒。HSV可以容納大部分的外源DNA，這使其作為載體系統(tǒng)是有吸引力的，并且已經(jīng)用作基因遞送到神經(jīng)元的載體。

在治療過程中使用HSV需要減弱毒株，使得它們不能建立裂解循環(huán)。特別地，如果HSV載體將用于人的基因治療，則優(yōu)選將NOI插入必需基因中。這是必要的，因為如果載體病毒遇到野生型病毒，通過重組可發(fā)生將異源基因轉移到野生型病毒。但是，只要將NOI插入必需基因，重組轉移也將刪除接受體病毒中的必需基因，并防止異源基因“逃逸”到具有復制能力的野生型病毒群體中。

源自牛痘病毒的載體

牛痘病毒是具有約190kb線性、雙鏈DNA基因組的大包膜病毒。牛痘病毒可容納高達約25kb的外源DNA，這也使其可用于遞送大基因。

本領域已知許多適合于基因治療應用的減弱的牛痘病毒株，例如MVA和NYVAC毒株。

病毒顆粒生產(chǎn)

在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞用于生產(chǎn)包膜病毒顆粒的用途。

在一個實施方案中，所述包膜病毒載體顆粒包含小于約50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的在不存在基因工程改造下在由包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞產(chǎn)生的顆粒上顯示的表面暴露的MHC-I分子的數(shù)目。在另一個實施方案中，所述包膜病毒顆?；旧蠜]有表面暴露的MHC-I分子。

包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞可以包含病毒基因組。

病毒基因組是摻入病毒顆粒中的核酸序列?？梢詫⒉《净蚪M進行工程改造以包含目標核苷酸（NOI）。

因此，為了用于產(chǎn)生病毒顆粒，所述包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞可以包含病毒基因組，并隨后在適合于產(chǎn)生包膜病毒顆粒的條件下培養(yǎng)。

“包膜病毒顆粒包裝細胞”可以例如包含編碼病毒顆粒裝配所需的一些或全部結構蛋白的核酸序列。

僅包含用于產(chǎn)生包膜病毒顆粒所需要的一些元件的細胞可用作產(chǎn)生病毒顆粒生產(chǎn)細胞系的中間反應物，通過隨后的每個額外所需元件的瞬時轉染、轉導或穩(wěn)定整合的步驟。這些中間反應物包括在本發(fā)明的包裝細胞系中。隨后用于產(chǎn)生包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞或包裝細胞系的親本細胞代表本發(fā)明的另一個實施方案，其中所述親本細胞的細胞表面上的MHC-I的表達已經(jīng)減少。

編碼感染性包膜病毒顆粒生產(chǎn)所需組分的核酸序列可以瞬時轉染或轉導入或穩(wěn)定保持（例如穩(wěn)定整合入細胞基因組或游離保持）在包裝細胞或生產(chǎn)細胞內(nèi)?；蛘?，可以使用瞬時轉染或轉導和穩(wěn)定保持的組合將核酸序列引入細胞中。

因此，本發(fā)明的細胞可以被轉染或轉導或經(jīng)工程改造以通過靶向整合來穩(wěn)定整合包含病毒基因組的核酸，以能夠生產(chǎn)包含病毒基因組的包膜病毒顆粒。

編碼感染性包膜病毒顆粒生產(chǎn)所需的單獨組分的核酸序列可以作為單獨的表達盒提供給細胞。

在一個實施方案中，本發(fā)明的包裝細胞包含編碼Gag、Gag/Pol和/或Env蛋白或其功能性替代物的核酸序列。所述細胞可任選地包含編碼可能是逆轉錄病毒載體顆粒裝配所需的其它蛋白例如Rev蛋白的核酸序列。

包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞或包裝細胞可以是能夠生產(chǎn)或包裝包膜病毒顆粒的任何合適的細胞類型。所述細胞優(yōu)選是哺乳動物細胞，特別是人細胞。例如，所述包膜病毒顆粒生產(chǎn)細胞可以源自親本HEK-293細胞。

目標核苷酸

本發(fā)明的載體例如病毒顆?？梢园繕撕塑账幔∟OI）。

優(yōu)選地，目標核苷酸產(chǎn)生治療效果。

合適的NOI包括但不限于編碼如下的序列：酶、細胞因子、趨化因子、激素、抗體、抗氧化分子、工程改造的免疫球蛋白樣分子、單鏈抗體、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫調(diào)節(jié)分子、反義RNA、微小RNA、shRNA、siRNA、核酶、miRNA靶序列、靶蛋白的跨結構域負突變體、毒素、條件毒素、抗原、腫瘤抑制蛋白、生長因子、轉錄因子、膜蛋白、表面受體、抗癌分子、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物（例如具有相關報道基團的衍生物）。NOI還可以編碼前藥激活酶。

NOI的實例是凝血因子VIII或因子IX或其工程改造的衍生物，其可用于血友病的基因治療，或β-珠蛋白鏈，其可用于地中海貧血/鐮狀細胞病的基因治療。

可以通過病毒載體蛋白轉移而轉移的合適的蛋白包括但不限于核酸酶、整合酶、轉座酶、酶、細胞因子、趨化因子、激素、抗體、抗氧化分子、工程改造的免疫球蛋白樣分子、單鏈抗體、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫調(diào)節(jié)分子、靶蛋白的跨結構域負突變體、毒素、條件毒素、抗原、腫瘤抑制蛋白、生長因子、轉錄因子、膜蛋白、表面受體、抗癌分子、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物（例如具有相關報道基團的衍生物）。

藥物組合物

本發(fā)明的包膜病毒顆?；蜣D導細胞可以用藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑配制用于向受試者施用。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽水溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水，并且可能含有人血清白蛋白。

細胞治療產(chǎn)品的處理優(yōu)選根據(jù)用于細胞治療的FACT-JACIE國際標準進行。

基因治療

一方面，本發(fā)明提供包膜病毒顆粒和轉導細胞用于治療，例如用于基因治療。包膜病毒顆?？梢苑Q為包膜病毒載體顆粒。

“轉導細胞”或已經(jīng)“被包膜病毒載體顆粒轉導”的細胞，應當理解為由包膜病毒載體顆粒攜帶的核酸（例如包含NOI）已經(jīng)轉移到所述細胞。待轉導的細胞優(yōu)選是靶細胞。

本發(fā)明的包膜病毒載體顆?？梢灾苯邮┯糜谑茉囌摺？梢怨こ谈脑焖霾《据d體顆粒以將感染靶向受試者中的特定細胞。所述病毒載體顆粒也可以被工程改造以將NOI的表達靶向受試者中的特定細胞。這可以使用促進抑制特定細胞中NOI表達的組織特異性啟動子或核酸序列來實現(xiàn)。

包膜病毒載體顆粒還可以用于轉導已經(jīng)從受試者體內(nèi)除去的細胞，作為離體基因治療方法的一部分。

轉導的細胞可作為自體細胞移植方法的一部分或作為同種異體細胞移植方法的一部分施用。

“自體細胞移植方法”應當理解為，細胞的起始群體（其然后用本發(fā)明的包膜病毒載體顆粒轉導）得自與施用轉導細胞群體相同的受試者。自體移植方法是有利的，因為它們避免與免疫不相容性相關的問題并且對于受試者可利用，而不管基因匹配供體的可獲得性。

“同種異體細胞移植方法”應當理解的是，細胞的起始群體（其然后用本發(fā)明的包膜病毒載體顆粒轉導）從與施用轉導細胞群體的受試者不同的受試者獲得。優(yōu)選地，供體將與施用細胞的受試者基因匹配，以使免疫不相容性的風險最小化。

包膜病毒載體顆?；蜣D導細胞的合適劑量是使得治療和/或預后有效的。待施用的劑量可取決于待治療的受試者和病癥，并且可由技術人員容易地確定。

例如，所述用途可以作為造血干細胞和/或祖細胞移植方法的一部分。

造血干細胞移植（HSCT）是來源于骨髓（在這種情況下稱為骨髓移植）或血液的血液干細胞的移植。干細胞移植是血液學和腫瘤學領域中的醫(yī)學方法，最常用于患有血液或骨髓疾病或某些類型的癌癥的人。

HSCT的許多接受者是多發(fā)性骨髓瘤或白血病患者，其不會受益于用化療的長期治療或已經(jīng)對化療有抗性。HSCT的候選人包括兒科病例，其中患者具有先天缺陷，例如具有缺陷性干細胞的嚴重聯(lián)合免疫缺陷或先天性中性白細胞減少，以及在出生后已經(jīng)失去干細胞的具有再生障礙性貧血的兒童或成人。用干細胞移植物治療的其它病癥包括鐮狀細胞病、骨髓增生異常綜合征、成神經(jīng)細胞瘤、淋巴瘤、尤因氏肉瘤、結節(jié)性小圓細胞瘤和霍奇金病。最近，已開發(fā)非清髓性或所謂的“微型移植”方法，其需要較小劑量的制備化學療法和放射。這已允許HSCT在被認為太弱而不能承受常規(guī)治療方案的老年人和其他患者中進行。

本發(fā)明的包膜病毒載體顆?；蜣D導細胞可用于治療遺傳性疾病，例如血漿蛋白缺乏、代謝性疾病、溶酶體貯積病、粘多糖病、免疫缺陷、血液病，包括但不限于血友病、腺苷脫氨酶嚴重聯(lián)合免疫缺陷、Wiskott-Aldrich綜合征、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、球樣性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，β-地中海貧血、慢性肉芽腫病。

本發(fā)明的包膜病毒載體顆?；蜣D導細胞可用于治療WO1998/005635中所列的疾病。為了便于參考，現(xiàn)在提供該列表的一部分：癌癥、炎癥或炎性疾病、皮膚病、發(fā)燒、心血管效應、出血、凝血和急性期反應、惡病質(zhì)、厭食、急性感染、HIV感染、休克狀態(tài)、移植物抗宿主疾病、自身免疫性疾病、再灌注損傷、腦膜炎、偏頭痛和阿司匹林依賴性抗血栓形成；腫瘤生長、侵襲和擴散、血管生成、轉移、惡性、腹水和惡性胸腔積液；腦缺血、缺血性心臟病、骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、哮喘、多發(fā)性硬化、神經(jīng)變性、阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化、中風、血管炎、克羅恩病和潰瘍性結腸炎；牙周炎、牙齦炎；銀屑病、特應性皮炎、慢性潰瘍、大皰性表皮松解癥；角膜潰瘍，視網(wǎng)膜病變和手術傷口愈合；鼻炎、過敏性結膜炎、濕疹、過敏反應；再狹窄、充血性心力衰竭、子宮內(nèi)膜異位、動脈粥樣硬化或內(nèi)部硬化(endosclerosis)。

此外或可選地，本發(fā)明的包膜病毒載體顆?；蜣D導細胞可用于治療WO 1998/007859中所列的疾病。為了便于參考，現(xiàn)在提供該列表的一部分：細胞因子和細胞增殖/分化活性；免疫抑制劑或免疫刺激劑活性（例如用于治療免疫缺陷，包括人免疫缺陷病毒的感染；淋巴細胞生長的調(diào)節(jié)；治療癌癥和許多自身免疫疾病，以及預防移植排斥或誘導腫瘤免疫）；調(diào)節(jié)造血，例如治療骨髓或淋巴疾?。淮龠M骨、軟骨、腱、韌帶和神經(jīng)組織的生長，例如用于治療傷口，治療燒傷、潰瘍和牙周病和神經(jīng)變性；抑制或激活卵泡刺激激素（調(diào)節(jié)生育力）；趨化/化學激活活性（例如用于將特定細胞類型調(diào)動到損傷或感染部位）；止血和血栓溶解活性（例如用于治療血友病和中風）；抗炎活性（用于治療例如敗血癥性休克或克羅恩病）；作為抗菌劑；例如代謝或行為的調(diào)節(jié)劑；作為止痛劑；治療特定缺陷障礙；在治療例如銀屑病中，在人或獸醫(yī)學中。

此外，或可選地，本發(fā)明的包膜病毒載體顆?；蜣D導細胞可用于治療WO 1998/009985中所列的疾病。為了便于參考，現(xiàn)在提供部分列表：巨噬細胞抑制和/或T細胞抑制活性，和因此，抗炎活性；抗免疫活性，即對細胞和/或體液免疫應答的抑制作用，包括與炎癥無關的應答；抑制巨噬細胞和T細胞粘附于細胞外基質(zhì)組分和纖連蛋白以及T細胞中上調(diào)的fas受體表達的能力；抑制非期望的免疫反應和炎癥，包括關節(jié)炎，包括類風濕性關節(jié)炎，與超敏反應相關的炎癥，過敏反應，哮喘，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，膠原病和其它自身免疫疾病，與動脈粥樣硬化相關的炎癥、動脈硬化、動脈粥樣硬化性心臟病、再灌注損傷、心臟停搏、心肌梗塞、血管炎癥性疾病、呼吸窘迫綜合征或其它心肺疾病，與消化性潰瘍相關的炎癥，潰瘍性結腸炎和其它胃腸道疾病，肝纖維化，肝硬化或其它肝臟疾病，甲狀腺炎或其它腺體疾病，腎小球腎炎或其它腎臟和泌尿系統(tǒng)疾病，耳炎或其它耳鼻喉科疾病，皮炎或其它皮膚疾病，牙周病或其它牙科疾病，睪丸炎或附睪-睪丸炎，不孕，睪丸創(chuàng)傷或其它免疫相關性睪丸疾病，胎盤功能障礙，胎盤功能不全，習慣性流產(chǎn)，子癇，先兆子癇和其它免疫和/或炎癥相關的婦科疾病，后葡萄膜炎，中間葡萄膜炎，前葡萄膜炎，結膜炎，脈絡膜視網(wǎng)膜炎，眼色素層炎，視神經(jīng)炎，眼內(nèi)炎癥例如視網(wǎng)膜炎或囊樣黃斑水腫，交感性眼炎，鞏膜炎，色素性視網(wǎng)膜炎，退行性軟骨病的免疫和炎性成分，眼創(chuàng)傷的炎性成分，由感染引起的眼部炎癥，增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變，急性缺血性視神經(jīng)病變，過度瘢痕形成，例如在青光眼過濾操作之后，針對眼植入物的免疫和/或炎癥反應和其它免疫和炎癥相關的眼科疾病，與自身免疫性疾病或病癥或障礙相關的炎癥，其中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）或任何其它器官，免疫和/或炎癥抑制將是有益的，帕金森病，來自帕金森病治療的并發(fā)癥和/或副作用，AIDS相關性癡呆綜合征，HIV相關性腦病，德維克病，西德納姆舞蹈病，阿爾茨海默氏病和其它變性疾病，CNS的病癥或疾病，斯托克斯的炎性成分，脊髓灰質(zhì)炎后綜合征，精神疾病的免疫和炎性成分，脊髓炎，腦炎，亞急性硬化性全腦炎，腦脊髓炎，急性神經(jīng)病，亞急性神經(jīng)病，慢性神經(jīng)病，吉-巴綜合征，西德納姆舞蹈病，重癥肌無力，假性腫瘤腦，唐氏綜合征，亨廷頓病，肌萎縮性側索硬化，CNS壓迫或CNS創(chuàng)傷的炎性成分或CNS感染，肌萎縮和營養(yǎng)不良的炎性成分，以及免疫和炎癥相關的疾病，中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的病癥或疾病，創(chuàng)傷后炎癥，膿毒性休克，感染性疾病，手術的炎癥并發(fā)癥或副作用，骨髓移植或其它移植并發(fā)癥和/或副作用，基因治療的炎癥和/或免疫并發(fā)癥和副作用，例如由于感染病毒載體或與AIDS相關的炎癥，以壓制或抑制體液和/或細胞免疫應答，以治療或改善單核細胞或白細胞增殖性疾病，例如白血病，通過減少單核細胞或淋巴細胞的量，用于在移植天然或人工細胞、組織和器官例如角膜、骨髓、器官、晶狀體、起搏器、天然或人工皮膚組織的情況下預防和/或治療移植物排斥。

治療方法

應當理解，本文中對治療的所有提及包括治愈性、姑息性和預防性治療，盡管在本發(fā)明的上下文中，提及預防更通常與預防性治療相關。優(yōu)選對哺乳動物，特別是人的治療。人和家畜治療都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

疫苗

一方面，本發(fā)明提供了用作疫苗的本發(fā)明的包膜病毒顆粒。優(yōu)選地，所述包膜病毒顆粒不具有感染性，例如不能感染細胞。

減弱的病毒在本領域中通常用作疫苗，以提供針對病毒的天然、毒性形式的感染的免疫。

用作疫苗的減弱的病毒可以使用如上所述的本發(fā)明的生產(chǎn)細胞生產(chǎn)，優(yōu)選地，其中可以去除NOI。本發(fā)明的生產(chǎn)細胞能夠生產(chǎn)展示出數(shù)目減少的表面暴露的MHC-I分子的用作疫苗的包膜病毒顆粒。用作疫苗的包膜病毒載體顆粒可以基本上沒有表面暴露的MHC-I分子。

表面暴露的MHC-I分子的數(shù)目減少或缺乏在用作疫苗的病毒中是有利的，因為該病毒將不太可能被與MHC-I結合的抗體中和。

另外，免疫應答可以對同種異體MHC-I而不是針對病毒抗原反應，因此通過更有效地誘導保護性免疫，基本上沒有同種異體MHC-I分子的病毒顆?？梢允歉行У囊呙?。

用作疫苗的病毒可進一步經(jīng)工程改造以在其表面或感染細胞內(nèi)表達其它蛋白。這樣的蛋白可以作為用于產(chǎn)生抗體或細胞免疫的抗原，其可以進一步增加機體的免疫防御。

實施例

實施例1

材料和方法

β2M基因破壞

為了產(chǎn)生編碼Cas9的真核表達質(zhì)粒，使用XbaI和PmeI從hCas9質(zhì)粒（Addgene，質(zhì)粒第41815號）切除人密碼子優(yōu)化形式的化膿性鏈球菌（streptococcus pyogenes）Cas9序列。然后將該片段克隆到先前用XbaI和EcoRV消化的pcDNA3.1質(zhì)粒（Invitrogen）中。

為了產(chǎn)生編碼β2M RNA指導的質(zhì)粒，使用DNA合成來產(chǎn)生含有人U6啟動子序列，隨后是反式激活RNA序列（GeneWix）的質(zhì)粒。然后用BsaI消化該質(zhì)粒，以便產(chǎn)生對應于識別β2M的外顯子1的CRISPR RNA（crRNA）的以下退火的寡核苷酸的相容的DNA末端：5'-ACCGAGTAGCGCGAGCACAGCTA-3'; 5 -AAACTAGCTGTGCTCGCGCTACT-3'。

通過磷酸鈣DNA轉染將質(zhì)粒遞送入細胞（250ng Cas9表達質(zhì)粒加上50或100ng指導RNA表達質(zhì)粒）。

流式細胞術

將所有細胞懸浮液用FcR封閉試劑（Miltenyi）和在磷酸鹽緩沖鹽水、0.5%牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸（2mM）中的PE-綴合的抗人β2M（BioLegend，克隆2M2）和APC-綴合的全抗人MHC-I（Santa Cruz Biotechnology）（染色溶液）在4℃孵育20分鐘。抗體染色后，洗滌細胞，再懸浮于染色溶液中，并通過流式細胞術（FACSCanto，BD Biosciences）分析。

錯配選擇性內(nèi)切核酸酶測定

使用錯配選擇性內(nèi)切核酸酶測定來測量在Cas9靶位點處的非同源末端連接（NHEJ）導致的突變的程度。簡言之，使用在β2M基因中側接crRNA位點的引物（Fw：5'-TACAGACAGCAAACTCACCCAGTC-3'; Rv：5-AGAACTTGGAGAAGGGAAGTCACG-3'）進行PCR。使PCR產(chǎn)物變性，使其重新退火并用Surveyor核酸酶測定（Transgenomic）消化。因為該酶在雙鏈體扭曲位點切割DNA，所以野生型和突變等位基因（攜帶核酸酶活性導致的突變或缺失）之間的再退火產(chǎn)物被特異性消化。將反應產(chǎn)物在Spreadex EL1200 Wide Mini凝膠（Elchrom Scientific）上分離，用溴化乙錠染色，并且通過ImageQuant TL軟件對條帶的強度進行定量。使用公式(1-(親本片段)^1/2)×100計算未切割的親本片段與兩個較低遷移切割產(chǎn)物的比率（Lombardo，A. 等人，（2011）Nat. Methods 8：861-9。

慢病毒載體（LV）生產(chǎn)

通過用pCCLsin.cPPT.PGK.GFP.pre轉移載體，包裝質(zhì)粒pMDLg/p.RRE、pCMV.REV，VSV-G包膜質(zhì)粒pMD2.G的磷酸鈣瞬時轉染293T細胞產(chǎn)生第三代慢病毒載體（LV），如先前所述（Follenzi，A. 等人（2002）Methods Mol. Med. 69：259-74）。在轉染前24小時將293T細胞接種在15cm培養(yǎng)皿中。轉染前2小時，用新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。對于每個培養(yǎng)皿，分別使用35μg、12.5μg、6.25μg和9μg質(zhì)粒DNA制備含有LV基因組質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒pMDLg/pRRE和pCMV.REV和pMD2.G的混合物的溶液。向DNA混合物中添加0.1×TE溶液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0，在dH₂O中）和水（1:2）至1250μL的最終體積。將溶液留在旋轉輪上20-30分鐘，然后加入125μL的2.5M CaCl₂。就在轉染之前，通過添加1250μL的2×HBS（281mM NaCl，100mM HEPES，1.5mM Na₂HPO₄，pH 7.12）形成沉淀，同時將溶液在渦旋上保持攪拌。立即將沉淀物加入培養(yǎng)基中并留在細胞上14-16小時，并隨后更換培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基更換后30小時收集上清液，并使上清液通過0.22μm過濾器（Millipore）。

包裝細胞先前由穩(wěn)定表達四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉錄阻遏物的293-T-REx（Invitrogen）開始產(chǎn)生，在與CMV啟動子連接的Tet操縱子的控制下，用表達HIV-1 Rev、Gag/Pol和VSV-G的質(zhì)粒穩(wěn)定轉染。通過向培養(yǎng)基中加入多西環(huán)素（1μg/mL）誘導LV顆粒的產(chǎn)生，和72小時后收集上清液，并使上清液通過0.22μm過濾器（Millipore）。

LV滴定

在聚凝胺（8μg/mL）的存在下，用系列載體稀釋物轉導十萬個293T細胞。GFP陽性（GFP +）細胞的百分比在轉導后7天通過流式細胞術測量。滴度表示為轉導單位_293T（TU）/mL，并使用下式計算：

TU/mL = [（％GFP +細胞/ 100）×10⁵×1/稀釋因子]

根據(jù)制造商的方案（NEN Life Science Products）通過HIV-1 Gag p24抗原免疫捕獲測量載體顆粒。載體感染性計算為滴度和顆粒之間的比率（TU/ng p24）。

統(tǒng)計學分析

使用Mann-Whitney檢驗在p <0.05顯著性水平下進行統(tǒng)計學分析。

結果

為了產(chǎn)生沒有表面暴露的MHC-I分子的細胞系用于生產(chǎn)缺乏表面暴露的MHC-I分子的慢病毒載體（LV），我們開始永久破壞編碼β-2-微球蛋白的基因（β2M）。因為β2M是MHC-I的通用組分，為MHC-I在細胞膜上表達所需，通過基因失活β2M基因，我們旨在損害所有高度多態(tài)MHC-I分子的表面表達，而不需要單獨地破壞構建MHC-I的各基因（Shiina，T. 等人（2009）J. Hum. Genet. 54：15-39；Adams，E.J. 等人（2013）Annu. Rev. Immunol. 31：529-6）。為此，我們使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)（Hsu，P.D.（2014）Cell 157：1262-78）。Cas9是RNA-指導的核酸酶，如果提供設計用于結合所需基因座的適當?shù)腞NA指導，其能夠在基因組中的預定基因座處進行DNA雙鏈斷裂（DSB）。因此，其中發(fā)生DSB的細胞通過非同源末端連接（NHEJ）途徑修復DNA，所述非同源末端連接（NHEJ）途徑為插入隨機核苷酸并常常破壞靶基因的閱讀框架的易錯機制（Lombardo，A. 等人（2011）Nat. Methods 8：861-9）。我們遞送兩種質(zhì)粒，一種編碼Cas9核酸酶，和另一種表達指導RNA，其設計為通過瞬時轉染到基于HEK-293的誘導型細胞系（之前經(jīng)工程改造以產(chǎn)生LV顆粒）和HEK-293T細胞（其常規(guī)地用于通過利用LV包裝和基因組構建體的瞬時轉染產(chǎn)生LV）兩者，與β2M基因的第一外顯子中的序列進行堿基配對。我們通過流式細胞術分析顯示，雖然未處理的細胞對于β2M和MHC-I是100％陽性的（圖1A和1E），高達44％的用Cas9處理的細胞和適當?shù)闹笇NA松散β2M，并因此MHC-I在其膜上表達（圖1B和1F）。然后我們通過熒光激活細胞分選（FACS）富集β2M陰性（β2M-）細胞至幾乎完全純度（95％）。我們已經(jīng)顯示這些細胞在培養(yǎng)中是穩(wěn)定的，并且對β2M和MHC-I兩者保持陰性（圖1D和1H）。盡管在HEK-293T細胞中β2M破壞的效率最初較低（6％，圖1F），但是我們能夠通過FACS分選容易地富集β2M-HEK-293T細胞（圖1G和1H）。

為了在基因水平上證實這些結果，我們通過錯配選擇性內(nèi)切核酸酶測定法（Cel1 測定; Lombardo，A. 等人（2011）Nat. Methods 8：861-9）分析了β2M基因處NHEJ的事件。我們已經(jīng)顯示，在CRISPR/Cas9處理的細胞中高達35％的β2M等位基因被破壞，其在293T細胞和LV包裝細胞系中在β2M-分選的細胞中增加（圖2）。

然后我們評價β2M-細胞是否保持其產(chǎn)生LV的能力。為此目的，我們比較了在標準瞬時轉染方法中在β2M陽性（β2M+）和β2M-293T細胞中產(chǎn)生的LV的感染滴度、顆粒輸出和感染性。我們的數(shù)據(jù)顯示，在β2M-293T細胞中產(chǎn)生的LV與在β2M+ 293T細胞中產(chǎn)生的那些沒有顯著不同（圖3A、3B和3C）。我們還誘導β2M+和β2M-包裝細胞中LV的產(chǎn)生，并且在從2個包裝細胞系收集的LV中顯示類似的顆粒輸出（圖3D）。

總體而言，這些結果顯示了用CRISPR/Cas9處理的細胞中的β2M等位基因的有效破壞以及MHC-I分子從β2M-細胞的質(zhì)膜幾乎完全消失。此外，我們已經(jīng)顯示，源自這些β2M-細胞的LV在其感染性方面沒有損傷。

實施例2

材料和方法

根據(jù)當?shù)貍惱砦瘑T會批準（Protocol TIGET03）和赫爾辛基宣言，在知情同意的情況下從健康供體獲得人外周血。通過Lymphoprep（Fresenius Kabi）的密度梯度離心分離外周血單核細胞（PBMC）。

T細胞純化和樹突細胞（DC）分化

使用Pan T細胞分離試劑盒II（Miltenyi Biotech）根據(jù)制造商的說明通過陰性選擇從PBMC純化CD3⁺ T細胞，并冷凍。通過使用CD14 MicroBeads（Miltenyi Biotech）根據(jù)制造商的說明進行陽性選擇，從相同供體的PBMC中分離CD14⁺單核細胞。將細胞在37℃下在補充有10％胎牛血清（FBS）（Euroclone）、100U/mL青霉素/鏈霉素（Lonza）、2mM L-谷氨酰胺（Lonza）的RPMI 1640（Corning）中在10ng/mL rhIL-4（R＆D Systems）和100ng/mL rhGM-CSF（Genzyme）的存在下培養(yǎng)7天以分化DC。細胞在第2天用1μg p24/mL由β2M+或β2M-細胞產(chǎn)生的慢病毒載體（LV）轉導。細胞在第6天用1μg/mL的LPS（Sigma）成熟額外1天，以產(chǎn)生成熟DC。在第7天，收集DC并用于刺激T細胞。

T細胞的增殖

將CD3⁺ T細胞解凍并在補充有10％FBS（Euroclone）、100U/mL青霉素/鏈霉素（Lonza）、2mM L-谷氨酰胺（Lonza）和20U/mL rhIL-2（Chiron）的RPMI 1640（Corning）中過夜培養(yǎng)。然后在最終體積為200μL的IMDM（Sigma）中用未轉導的DC或用由β2M+或β2M-細胞產(chǎn)生的LV轉導的DC（10:1和5:1 T細胞:DC比）刺激T細胞3天，該IMDM補充有10％FBS（Euroclone）、100U/mL青霉素/鏈霉素（Lonza）、2mM L-谷氨酰胺（Lonza），然后用1μCi/孔3H-胸苷脈沖處理16小時。

蛋白印跡

用補充有PIC（蛋白酶抑制劑混合物；Roche）的膜蛋白裂解緩沖液（150mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM EDTA，1％脫氧膽酸鹽，0.1％SDS，1％Triton-X100）提取各批LV中的總蛋白。將樣品再懸浮于裂解溶液中并在4℃下孵育10分鐘。使用Bradford測定（BioRad）測定裂解物的蛋白濃度。在還原條件下通過SDS-PAGE分析20μg蛋白。對于免疫印跡，使用iBIot Gel Transfer stack（Novex）將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用特異性抗體孵育，然后用過氧化物酶綴合的二抗（ECL小鼠或兔IgG; GE Healthcare）孵育，并使用化學發(fā)光試劑（ECL; GE Healthcare）檢測并在放射自顯影膠片上曝光。使用以下抗體：兔單克隆抗人MHC-I（OriGene Technologies，在TBS，Tween-20 0.1％，脫脂奶粉5％中以1:1000加入）、小鼠單克隆抗Gag p24（NIH AIDS試劑程序＃3537，在TBS，Tween-20 0.1％，脫脂奶粉5％中以1:1000加入）。

結果

為了檢測MHC-I在來自LV-生產(chǎn)細胞的質(zhì)膜的慢病毒載體（LV）顆粒中的摻入，我們對蛋白進行蛋白印跡分析，所述蛋白從通過超速離心從β2M+或β2M-生產(chǎn)細胞的條件培養(yǎng)基收集的LV中提取。

我們在由β2M+細胞產(chǎn)生的LV中檢測到對應于MHC-I的分子量的清晰條帶，但在由β2M-細胞產(chǎn)生的LV中沒有檢測到。如預期的，兩個樣品對于衣殼Gag p24蛋白類似地是陽性的（圖4）。

然后我們開始測量免疫細胞響應暴露于由β2M+或β2M-細胞產(chǎn)生的LV顆粒的自體樹突細胞的激活。

我們從健康供體的外周血單核細胞中純化CD3⁺ T淋巴細胞和CD14⁺單核細胞，并隨后將CD14⁺ 細胞暴露于由β2M+或β2M-細胞產(chǎn)生的相同量的LV顆粒。然后我們在樹突細胞（DC）中分化轉導的單核細胞，并與來自相同供體的CD3⁺ 淋巴細胞共培養(yǎng)它們。我們通過氚化胸苷摻入測量T淋巴細胞增殖，并觀察到與響應暴露于由β2M+細胞產(chǎn)生的LV的DC相比，響應暴露于由β2M-產(chǎn)生的LV的DC的T淋巴細胞增殖顯著更少（圖5）。

總的來說，這些數(shù)據(jù)證實了MHC-I在由親本β2M+細胞產(chǎn)生的LV顆粒中的存在和由β2M-細胞有效產(chǎn)生無MHC的LV。此外，這些數(shù)據(jù)表明無MHC的LV顆粒和轉導細胞不太可能誘導并且被同種異體特異性免疫應答靶向。

在上述說明書中提及的所有出版物通過引用并入本文。在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，本發(fā)明的所述細胞、病毒載體顆粒、用途和方法的各種修飾和變化對本領域技術人員是顯而易見的。盡管已經(jīng)結合具體的優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，但是應當理解，所要求保護的本發(fā)明不應該不適當?shù)叵抻谶@些具體實施方案。實際上，對于生物化學和生物技術或相關領域的技術人員顯而易見的用于實施本發(fā)明的所述模式的各種修改旨在在所附權利要求的范圍內(nèi)。

序列表

<110> 圣拉法埃萊醫(yī)院有限公司

泰萊托恩基金會

<120> 載體生產(chǎn)

<130> P105283PCT

<150> GB1412494.5

<151> 2014-07-14

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對應于識別beta2M的外顯子1的CRISPR RNA (crRNA)的寡核苷酸

<400> 1

accgagtagc gcgagcacag cta 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對應于識別beta2M的外顯子1的CRISPR RNA (crRNA)的寡核苷酸

<400> 2

aaactagctg tgctcgcgct act 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 在beta2M基因中側接crRNA位點的引物

<400> 3

tacagacagc aaactcaccc agtc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 在beta2M基因中側接crRNA位點的引物

<400> 4

agaacttgga gaagggaagt cacg 24