本申請要求保護(hù)2014年6月6日提交的美國臨時專利申請系列號62/009,058的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容在本文通過提述并入。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)方法、細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)方法和重組蛋白的制造方法。背景含有編碼重組蛋白的核酸的哺乳動物細(xì)胞經(jīng)常用于生產(chǎn)治療上或商業(yè)上重要的蛋白質(zhì)。雖然數(shù)種高通量(highthroughput，HT)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)已在生物技術(shù)工業(yè)中用于補(bǔ)料分批方法數(shù)年，但是沒有已知存在的使用多孔板用于基于灌注的細(xì)胞培養(yǎng)的HT模型。概述本發(fā)明(至少部分上)基于如下發(fā)現(xiàn)：在多孔板中以本文描述的具體方式培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞導(dǎo)致實質(zhì)性改進(jìn)的活細(xì)胞密度和重組蛋白產(chǎn)生，并提供了大規(guī)模灌注、生產(chǎn)生物反應(yīng)器中培養(yǎng)表現(xiàn)的精確模型。鑒于這一發(fā)現(xiàn)，本文提供培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的方法、產(chǎn)生重組蛋白的方法和用于測試制備重組蛋白的制造工藝的方法。還提供多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)，其能夠用于例如實施任何本文所述的方法。本發(fā)明提供培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的方法，其包括：提供多孔板，所述多孔板包含至少一個含有置于第一液體培養(yǎng)基中的哺乳動物細(xì)胞的孔，其中所述第一液體培養(yǎng)基占據(jù)約5％至約70％的孔體積；在約31℃至約40℃并伴隨約320轉(zhuǎn)每分鐘(RPM)至約500RPM旋轉(zhuǎn)攪拌將所述多孔板溫育一段時間；和在該段時間過程中，連續(xù)地或周期性地去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基并向所述第一液體培養(yǎng)基添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基，其中所述第一和第二體積大致相等。在這些方法的一些實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在這些方法的一些實施方案中，所述CHO細(xì)胞含有編碼重組蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白)的核酸。還提供產(chǎn)生重組蛋白的方法，其包括：提供多孔板，所述板包含至少一個包含置于第一液體培養(yǎng)基中的一哺乳動物細(xì)胞的孔，其中所述第一液體培養(yǎng)基占據(jù)約5％至約70％的孔體積，并且所述哺乳動物細(xì)胞含有編碼重組蛋白的核酸；在約31℃至約40℃并伴隨約320轉(zhuǎn)每分鐘(RPM)至約500RPM旋轉(zhuǎn)攪拌將所述多孔板溫育一段時間；在該段時間過程中，連續(xù)地或周期性地去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基并向所述第一液體培養(yǎng)基添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基，其中所述第一和第二體積大致相等；和從所述哺乳動物細(xì)胞或從所述第一或第二培養(yǎng)基回收所述重組蛋白。在這些方法的一些實施方案中，所述重組蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白)回收自所述哺乳動物細(xì)胞。在這些方法的一些實施方案中，所述重組蛋白(例如，分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生長因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白)回收自所述第一或第二液體培養(yǎng)基。還提供用于測試用于制備重組蛋白的制造工藝的方法，其包括：提供一多孔板，其包含至少一個包含置于第一液體培養(yǎng)基中的哺乳動物細(xì)胞的孔，其中所述第一液體培養(yǎng)基占據(jù)約5％至約70％的孔體積，并且所述哺乳動物細(xì)胞含有編碼重組蛋白的核酸；在約31℃至約40℃并伴隨約320轉(zhuǎn)每分鐘(RPM)至約500RPM旋轉(zhuǎn)攪拌將所述多孔板溫育一段時間；在該段時間過程中，連續(xù)地或周期性地去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基并向所述第一液體培養(yǎng)基添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基，其中所述第一和第二體積大致相等；檢測所述哺乳動物細(xì)胞中或所述第一或第二液體培養(yǎng)基中的所述重組蛋白；和將所述哺乳動物細(xì)胞中或所述第一或第二液體培養(yǎng)基中存在的重組蛋白的量與重組蛋白的參考水平進(jìn)行比較。在這些方法的一些實施方案中，所述重組蛋白的參考水平是使用不同的培養(yǎng)方法產(chǎn)生的重組蛋白的水平。在這些方法的一些實施方案中，所述不同培養(yǎng)的方法利用不同的第一或第二液體培養(yǎng)基、不同的哺乳動物細(xì)胞、不同的溫度、不同的攪拌水平或不同的多孔板。在這些方法的一些實施方案中，所述不同的培養(yǎng)方法利用不同的原材料、抗結(jié)塊劑或化學(xué)上限定的液體培養(yǎng)基。在一些實施方案中，這些方法用于例如進(jìn)行高通量細(xì)胞培養(yǎng)實驗來執(zhí)行實驗設(shè)計(design-of-experiment；DOE)或質(zhì)量源于設(shè)計(quality-by-design；QDB)研究。在這些方法的一些實施方案中，在所述第一或第二液體培養(yǎng)基中檢測所述重組蛋白(例如，分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生長因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白)。在這些方法的一些實施方案中，在所述細(xì)胞中檢測所述重組蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白)。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述第一體積的第一液體培養(yǎng)基基本上不含哺乳動物細(xì)胞。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述第一液體培養(yǎng)基占據(jù)約10％至約60％的孔體積。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述旋轉(zhuǎn)攪拌為約320RPM至約400RPM。在本文描述的任何方法中，去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基和添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基同時進(jìn)行。在本文描述的任何方法中，去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基和添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基連續(xù)或周期性進(jìn)行。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，去除的第一液體培養(yǎng)基的第一體積和添加的第二培養(yǎng)基的第二體積隨時間增加。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，將所述多孔板溫育超過7天的一段時間，并且在溫育的第1至3天中的每24小時的時間段內(nèi)，去除的第一液體培養(yǎng)基的第一體積和添加的第二培養(yǎng)基的第二體積是第一液體培養(yǎng)基的體積的約30％至約50％；在培養(yǎng)的第4至6天中的每24小時的時間段內(nèi)，去除的第一液體培養(yǎng)基的第一體積和添加的第二培養(yǎng)基的第二體積是第一液體培養(yǎng)基的體積的約40％至約70％；并且從培養(yǎng)的第7天起的每24小時的時間段內(nèi)，去除的第一液體培養(yǎng)基的第一體積和添加的第二培養(yǎng)基的第二體積是第一液體培養(yǎng)基的體積的約90％至約150％。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述孔具有約1mL至約18mL的體積(例如，約1mL至約7mL或約1mL至約3.5mL)。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板是6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板是深孔板(deep-wellplate)。在本文描述的任何方法的一些實施方案中所述孔的底部直徑為約6.0mm至約35mm(例如，約12mm至約50mm)。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述孔的高度為約12mm至約50mm。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞懸浮在約150μL至約15mL(例如，約150μL至約10mL，約150μL至約5mL或約150μL至約150μL)的第一培養(yǎng)基中。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述第一液體培養(yǎng)基和/或第二液體培養(yǎng)基選自下組：化學(xué)上限定的液體培養(yǎng)基、無血清液體培養(yǎng)基、含血清液體培養(yǎng)基、無動物來源組分的液體培養(yǎng)基和無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，在約最初的24至48小時的時間段之后，在每24小時的時間段內(nèi)，去除的第一液體培養(yǎng)基的第一體積和添加的第二培養(yǎng)基的第二體積是第一液體培養(yǎng)基的體積的約30％至約150％。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，在去除所述第一體積的第一液體培養(yǎng)基之前，使攪拌中止至少30秒的一段時間。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板用透氣性拋棄式膜或透氣性硅酮層(gas-permeablesiliconelayer)密封。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述孔具有平底或圓底。本文描述的任何方法的一些實施方案包括周期性地添加額外體積的第二液體培養(yǎng)基至多個孔中的每個，從而抵消因蒸發(fā)所致的第一液體培養(yǎng)基體積的任何減少。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基和向第一液體培養(yǎng)基添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基使用自動化設(shè)備進(jìn)行。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板是本文描述的任何多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述方法在孔中產(chǎn)生15x106細(xì)胞/mL至60x106細(xì)胞/mL的活細(xì)胞密度。還提供培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的方法，其包括：在梯度灌注方法中培養(yǎng)懸浮在置于多孔板的孔中的液體培養(yǎng)基中的哺乳動物細(xì)胞，所述培養(yǎng)條件為在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生的流體剪切力(fluidsheerforce)和溶解氧(O2)濃度與在占據(jù)具有約6.0mm至約35mm的直徑和約40mm至約50mm的高度的方底孔約15％至約25％體積的培養(yǎng)基中當(dāng)所述方底孔在約31℃至約40℃的溫度溫育并且以約320轉(zhuǎn)每分鐘(RPM)至約360RPM的頻率旋轉(zhuǎn)攪拌時所實現(xiàn)的基本上相同。在這些方法的一些實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(例如，含有編碼重組蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白)的核酸的CHO細(xì)胞)。還提供產(chǎn)生重組蛋白的方法，其包括：在梯度灌注方法方法中培養(yǎng)懸浮在置于多孔板的孔中的液體培養(yǎng)基中的哺乳動物細(xì)胞，所述培養(yǎng)條件為在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生的流體剪切力和溶解氧(O2)濃度與在占據(jù)具有約6.0mm至約35mm的直徑和約40mm至約50mm的高度的方底孔約15％至約25％體積的培養(yǎng)基中當(dāng)所述方底孔在約31℃至約40℃的溫度溫育并且以約320轉(zhuǎn)每分鐘(RPM)至約360RPM的頻率旋轉(zhuǎn)攪拌時所實現(xiàn)的基本上相同；和從所述哺乳動物細(xì)胞或所述液體培養(yǎng)基回收所述重組蛋白。在任何這些方法的一些實施方案中，所述重組蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白)回收自所述哺乳動物細(xì)胞。在任何這些方法的一些實施方案中，所述重組蛋白(例如，分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生長因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白)回收自所述液體培養(yǎng)基。在這些方法的一些實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板選自6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板是深孔板。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述液體培養(yǎng)基選自下組：化學(xué)上限定的液體培養(yǎng)基、無血清液體培養(yǎng)基、含血清液體培養(yǎng)基、無動物來源組分的液體培養(yǎng)基和無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板用透氣性拋棄式膜或透氣性硅酮層密封。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板包含具有平底或圓底的孔。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板是本文描述的多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)之一。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述培養(yǎng)在孔中產(chǎn)生15x106細(xì)胞/mL至60x106細(xì)胞/mL的活細(xì)胞密度。還提供多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)，其包括：一體支持板(unitarysupportplate)，其包含包括多個孔(aperture)的第一平面；置于所述支持板內(nèi)并配置以放置在體積方面具有約200μL至約18mL體積的細(xì)胞培養(yǎng)物的多個培養(yǎng)容器，其中每個孔與每個培養(yǎng)容器配對并且限定進(jìn)入每個培養(yǎng)容器中的開口，并且其中每個培養(yǎng)容器進(jìn)一步包含至少一個配置用于容納流入和/或流出所述培養(yǎng)容器的流體流的端口。在本文描述的任何系統(tǒng)的一些實施方案中，配置所述一體支持板以包含用于放置液體和向所述端口供應(yīng)液體的貯液器。在本文描述的任何系統(tǒng)的一些實施方案中，所述培養(yǎng)容器包含至少第一和第二端口，其中配置所述第一端口以容納流體的單向流流入所述培養(yǎng)容器，并且配置所述第二端口以容納流體的單向流流出所述培養(yǎng)容器。在本文描述的任何系統(tǒng)的一些實施方案中，所述端口包含配置用于選擇性防止細(xì)胞流入和流出所述培養(yǎng)容器的過濾器。在本文描述的任何系統(tǒng)的一些實施方案中，所述第一和第二端口各自包含配置以選擇性防止細(xì)胞流入和流出所述培養(yǎng)容器的過濾器。本文描述的任何系統(tǒng)的一些實施方案進(jìn)一步包含至少一個置于所述一體支持板內(nèi)并且與所述端口流體連接的導(dǎo)管，其中配置所述導(dǎo)管以使流體流至和/或流自所述培養(yǎng)容器。本文描述的任何系統(tǒng)的一些實施方案進(jìn)一步包含至少一個與至少一個端口可操作地連接的流體流調(diào)節(jié)器。本文描述的任何系統(tǒng)的一些實施方案進(jìn)一步包含至少一個與至少一個導(dǎo)管可操作地連接的流體流量計。如用于本文，名詞前的詞語“一”代表一個或多個該特定名詞。例如，短語“(一個)哺乳動物細(xì)胞”代表“一個或多個哺乳動物細(xì)胞”。術(shù)語“哺乳動物細(xì)胞”意為任何來自或源自任何哺乳動物(例如，人、倉鼠、小鼠、綠猴、大鼠、豬、?；蛲?的細(xì)胞。在一些實施方案中，哺乳動物細(xì)胞可以是永生化細(xì)胞。在一些實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞是分化細(xì)胞。在一些實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞是未分化細(xì)胞。術(shù)語“第0天”意為將哺乳動物細(xì)胞接種到第一液體培養(yǎng)基中的時間點。術(shù)語“第1天”意為在將哺乳動物細(xì)胞接種到第一液體培養(yǎng)基中后在第0天與約24個小時之間的時間段。術(shù)語“第2天”意為在將哺乳動物細(xì)胞接種到第一液體培養(yǎng)基中后在約24小時至約48個小時之間的時間段。術(shù)語“第3天”意為在將哺乳動物細(xì)胞接種到第一液體培養(yǎng)基中后在約48小時至約72個小時之間的時間段。術(shù)語“第4天”意為在將哺乳動物細(xì)胞接種到第一液體培養(yǎng)基中后在約72小時至約96個小時之間的時間段。對于每多一天的術(shù)語(“第5天”、“第6天”、“第7天”等)意為從緊鄰的前一天結(jié)束起范圍在額外約24小時期間的時間段。術(shù)語“基本上不含”意為至少或約90％不含(例如，至少或約95％、96％、97％、98％，或至少或約99％不含或約100％不含)特定物質(zhì)(例如，哺乳動物細(xì)胞)的組合物。術(shù)語“0.5x體積”意為體積的約50％。術(shù)語“0.6x體積”意為體積的約60％。類似地，0.7x、0.8x、0.9x和1.0x分別意為體積的約70％、80％、90％，或100％。術(shù)語“培養(yǎng)”或“細(xì)胞培養(yǎng)”意為在一組受控的物理條件下哺乳動物細(xì)胞的維持或生長。術(shù)語“液體培養(yǎng)基”意為含有允許哺乳動物細(xì)胞在體外生長的充足營養(yǎng)物的流體。例如，液體培養(yǎng)基可含有下列一種或多種：氨基酸(例如，20種氨基酸)、嘌呤(例如，次黃嘌呤)，嘧啶(例如，胸苷)、膽堿、肌醇、硫胺素、葉酸、生物素、鈣、煙酰胺、吡哆醇、核黃素、胸苷、氰鈷胺素、丙酮酸(鹽)、硫辛酸、鎂、葡萄糖、鈉、鉀、硫酸鐵、硫酸銅、硫酸鋅和碳酸氫鈉。在一些實施方案中，液體培養(yǎng)基可含有來自哺乳動物的血清。在一些實施方案中，液體培養(yǎng)基不含血清或另一種來自哺乳動物的提取物(確定的液體培養(yǎng)基)。在一些實施方案中，液體培養(yǎng)基可含有痕量金屬、哺乳動物生長激素和/或哺乳動物生長因子。液體培養(yǎng)基的非限制性實例在本文中描述。液體培養(yǎng)基的另外的實例是本領(lǐng)域已知的，并且是市售的。液體培養(yǎng)基可含有任何密度的哺乳動物細(xì)胞。例如，如本文所使用的，從孔中去除的第一體積的第一培養(yǎng)基可基本上不含哺乳動物細(xì)胞。術(shù)語“第一液體培養(yǎng)基”意為適合用于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的一定體積的液體培養(yǎng)基。術(shù)語“第二液體培養(yǎng)基”意為在第一和第二液體培養(yǎng)基進(jìn)行任何混合之前與一定體積的第一液體培養(yǎng)基分開的適合用于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的一定體積的液體培養(yǎng)基。術(shù)語“無動物來源組分的液體培養(yǎng)基”意為不含任何源自哺乳動物的組分(例如，蛋白質(zhì)或血清)的液體培養(yǎng)基。術(shù)語“無血清液體培養(yǎng)基”意為不含哺乳動物血清的液體培養(yǎng)基。術(shù)語“含血清液體培養(yǎng)基”意為含有哺乳動物血清的液體培養(yǎng)基。術(shù)語“化學(xué)上限定的液體培養(yǎng)基”意為其中全部化學(xué)成分均已知的液體培養(yǎng)基。例如，化學(xué)上限定的液體培養(yǎng)基不含胎牛血清、牛血清白蛋白、或人血清白蛋白，因為這些制備物通常含有白蛋白和脂質(zhì)的復(fù)雜混合物。術(shù)語“無蛋白質(zhì)液體培養(yǎng)基”意為不含任何蛋白質(zhì)(例如，任何可檢測蛋白)的液體培養(yǎng)基。術(shù)語“攪拌”意為為了增加液體培養(yǎng)基中的溶解O2濃度而使含有至少一個包含所述液體培養(yǎng)基的孔的多孔板進(jìn)行的運動。攪拌，如旋轉(zhuǎn)攪拌，可以使用任何本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行，例如，以圓形或橢圓形移動多孔板的設(shè)備，如旋轉(zhuǎn)振蕩器(rotaryshaker)。能夠用于攪拌多孔板的示例性裝置在本文描述。這些裝置的其他實例是本領(lǐng)域已知的，并且是市售的。術(shù)語“免疫球蛋白”意為含有免疫球蛋白的至少15個氨基酸(例如，至少20、30、40、50、60、70、80、90或100個氨基酸)的氨基酸序列的多肽(例如，可變結(jié)構(gòu)域序列、框架序列或恒定結(jié)構(gòu)域序列)。例如，免疫球蛋白可包括輕鏈免疫球蛋白的至少15個氨基酸，例如重鏈免疫球蛋白的至少15個氨基酸。免疫球蛋白可為分離的抗體(例如，IgG、IgE、IgD、IgA或IgM)。免疫球蛋白可為IgG的亞類(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。免疫球蛋白可以是抗體片段，例如，F(xiàn)ab片段、F(ab′)2片段或scFv片段。免疫球蛋白也可以是雙特異性抗體或三特異性抗體，或二聚體、三聚體或多聚體抗體，或雙抗體、或免疫球蛋白還可為含有至少一個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的工程化蛋白(例如，融合蛋白)。免疫球蛋白的非限制性實例在本文描述，并且免疫球蛋白的其他實例是本領(lǐng)域已知的。術(shù)語“蛋白片段”或“多肽片段”意為多肽序列的一部分，其長度為至少或約4個氨基酸、至少或約5個氨基酸、至少或約6個氨基酸、至少或約7個氨基酸、至少或約8個氨基酸、至少或約9個氨基酸、至少或約10個氨基酸、至少或約11個氨基酸、至少或約12個氨基酸、至少或約13個氨基酸、至少或約14個氨基酸、至少或約15個氨基酸、至少或約16個氨基酸、至少或約17個氨基酸、至少或約18個氨基酸、至少或約19個氨基酸或至少或約20個氨基酸，或長度超過20個氨基酸。重組蛋白片段可使用任何本文描述的方法產(chǎn)生。術(shù)語“工程化蛋白”意為不是由生物體(例如，哺乳動物)內(nèi)存在的內(nèi)源核酸天然編碼的多肽。工程化蛋白的實例包括酶(例如，具有導(dǎo)致工程化的酶的穩(wěn)定性和/或催化活性增加的一個或多個氨基酸取代、缺失、插入或添加)、融合蛋白、抗體(例如，二價抗體、三價抗體或雙抗體)和包含至少一種重組支架序列的抗原結(jié)合蛋白。術(shù)語“流體剪切力”意為由與表面(例如，細(xì)胞的表面或孔的表面)大致上平行流動的液體引起的應(yīng)力。流體剪切力通常被定義為所施加的力除以材料的截面積和與施加的力向量平行的面積。計算流體剪切力的示例性方法在本文中描述并且是本領(lǐng)域已知的。術(shù)語“溶解O2濃度”或“溶解氧濃度”意為氧氣溶解在液體培養(yǎng)基中的量(例如，任何本文描述的或本領(lǐng)域已知的液體培養(yǎng)基)。非限制性的用于測量液體培養(yǎng)基中溶解O2濃度的方法在本文中描述，并且其它的方法是本領(lǐng)域已知的。術(shù)語“回收”意為從細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的一種或多種其他組分(例如，哺乳動物細(xì)胞或培養(yǎng)基蛋白質(zhì))或哺乳動物細(xì)胞裂解物中存在的一種或多種其他組分(例如，DNA，RNA或其他蛋白質(zhì))部分地純化或分離(例如，按重量計至少或約5％，例如，至少或約10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少或約95％純的)重組蛋白。用于從液體培養(yǎng)基或從哺乳動物細(xì)胞裂解物回收蛋白質(zhì)的非限制性方法在本文中描述，并且其它的方法是本領(lǐng)域已知的。術(shù)語“分泌的蛋白”或“分泌的重組蛋白”意為這樣的蛋白質(zhì)或重組蛋白，當(dāng)其在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)被翻譯時原始含有至少一個分泌信號序列，并且在哺乳動物細(xì)胞中(至少部分)通過酶促切割分泌信號序列釋放到胞外空間(例如，液體培養(yǎng)基)中。短語“梯度灌注”指在培養(yǎng)期間的時間段內(nèi)(例如，約24小時的時間段、約1分鐘至約24小時的時間段或超過24小時的時間段)去除和添加的培養(yǎng)基體積的增量變化(例如，增加或減少)(例如，每日的培養(yǎng)基再補(bǔ)料速率)。例如，梯度灌注方法的一個實施方案可能需要如下的再補(bǔ)料方案：第1-3天約0.5x反應(yīng)器體積的培養(yǎng)基(RV)/天的再補(bǔ)料，第4-6天約0.7xRV/天的再補(bǔ)料，并且第7天起約1.0xRV/天的再補(bǔ)料。這個特定實例可在具有某些再補(bǔ)料速率的天數(shù)方面和/或在任何特定的24小時時間段內(nèi)的再補(bǔ)料速率方面有所變化。每天去除和替換的培養(yǎng)基所占分?jǐn)?shù)可根據(jù)培養(yǎng)的特定細(xì)胞、初始接種密度和特定時間的細(xì)胞密度而改變?！癛V”或“反應(yīng)器體積”意為在培養(yǎng)過程開始時存在的培養(yǎng)基體積(例如，接種之后的培養(yǎng)基總體積)。術(shù)語“補(bǔ)料分批培養(yǎng)”意為向初始細(xì)胞培養(yǎng)物遞增或連續(xù)添加第二液體培養(yǎng)基，而不實質(zhì)或顯著地從細(xì)胞培養(yǎng)物去除第一液體培養(yǎng)基。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的一些實施方案中，所述第二液體培養(yǎng)基與所述第一液體培養(yǎng)基相同。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的一些實施方案中，所述第二液體培養(yǎng)基濃縮自所述第一液體培養(yǎng)基。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的一些實施方案中，所述第二液體培養(yǎng)基作為干粉添加?！氨壬a(chǎn)率(specificproductivityrate)”或“SPR”如用于本文指每天每個哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白的量或酶活性。重組抗體的SPR通常作為量/細(xì)胞/天測量。重組酶的SPR通常作為單位/細(xì)胞/天或(單位/量)/細(xì)胞/天測量?！绑w積生產(chǎn)率”或“VPR”如用于本文指每天每體積的培養(yǎng)物(例如，每L的生物反應(yīng)器、容器或管體積)產(chǎn)生的重組蛋白的質(zhì)量或酶活性。重組抗體的VPR通常作為量/L/天測量。重組酶的VPR通常作為單位/L/天或量/L/天測量。術(shù)語“微載劑”意為具有20μm至約1000μm的尺寸的顆粒(例如，有基聚合物)，其含有容許性(permissive)的表面或促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞的附著(例如，本文描述的或本領(lǐng)域已知的任何哺乳動物細(xì)胞)。微載劑可含有一個或多個孔(例如，具有約10μm至約100μm平均直徑的孔)。微載劑的非限定性實例在本文描述。微載劑的其他實例是本領(lǐng)域已知的。例如，微載劑可含有聚合物(例如，纖維素、聚乙二醇或聚乳酸-羥基乙酸共聚物)。除非另行限定，本文使用的科技術(shù)語具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。在本文描述了用于本發(fā)明中的用途的方法和材料；也可使用其他本領(lǐng)域已知的合適的方法和材料。所述材料、方法和實例僅為說明性的而不意圖進(jìn)行限制。本文提及的全部出版物、專利申請、專利、序列、數(shù)據(jù)庫條目和其他參考文獻(xiàn)通過提述以其整體并入。如有沖突，以包括定義在內(nèi)的本發(fā)明說明書為準(zhǔn)。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢從如下詳述和附圖以及從權(quán)利要求中將是顯而易見的。附圖說明圖1是示例性多孔板系統(tǒng)的頂視圖的示意圖。圖2是示例性多孔板系統(tǒng)的側(cè)視圖的示意圖。圖3是另一多孔板系統(tǒng)的側(cè)視圖的示意圖。圖4是另一多孔板系統(tǒng)的側(cè)視圖的示意圖。圖5是在歷時兩天的細(xì)胞灌注中的活細(xì)胞密度圖，所述細(xì)胞灌注培養(yǎng)在含有10-mL培養(yǎng)基并以160RPM攪拌的50-mL搖管中或含有200μL或300μL培養(yǎng)基并以330RPM攪拌的圓底96深孔板中，并且以不同分批再補(bǔ)料速率培養(yǎng)。誤差棒表示n＝2的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖6是細(xì)胞灌注的兩天培養(yǎng)物的終點活細(xì)胞密度圖，所述培養(yǎng)物培養(yǎng)在含有200μL或300μL培養(yǎng)基并以330RPM攪拌的圓底96深孔板中，并且以不同分批再補(bǔ)料速率培養(yǎng)(2x0.5反應(yīng)器體積/天或1反應(yīng)器體積/天)。誤差棒表示n＝2的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖7是細(xì)胞灌注的11天培養(yǎng)物的百分比細(xì)胞活力圖，所述培養(yǎng)物培養(yǎng)在含有300μL培養(yǎng)基并以360RPM攪拌的圓底96深孔板中，或在含有10mL培養(yǎng)基并以160RPM攪拌的搖管中。誤差棒表示n＝2的標(biāo)準(zhǔn)偏差(對于振蕩燒瓶培養(yǎng)物)和n＝8的標(biāo)準(zhǔn)偏差(對于圓底96深孔板培養(yǎng)物)。圖8是細(xì)胞灌注的11天培養(yǎng)物的活細(xì)胞密度，所述培養(yǎng)物培養(yǎng)在含有300μL培養(yǎng)基并以360RPM攪拌的圓底96深孔板中，或在含有10mL培養(yǎng)基并以160RPM攪拌的搖管中。誤差棒表示n＝2的標(biāo)準(zhǔn)偏差(對于振蕩燒瓶培養(yǎng)物)和n＝8的標(biāo)準(zhǔn)偏差(對于圓底96深孔板培養(yǎng)物)。圖9是在修改的再補(bǔ)料速率方案中和對照再補(bǔ)料速率方案中15天培養(yǎng)的每一天所用的再補(bǔ)料速率(以反應(yīng)器體積表示)圖。圖10是在含有200μL、300μL或500μL培養(yǎng)基、以330RPM或360RPM攪拌并使用Applikon系統(tǒng)或拋棄式膜密封的方底或圓底96深孔板中培養(yǎng)的；或在對照搖管中培養(yǎng)的細(xì)胞隨時間的活細(xì)胞密度圖。誤差棒表示n＝3的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖11是在含有200μL、300μL或500μL培養(yǎng)基、以330RPM或360RPM攪拌并使用Applikon系統(tǒng)或拋棄式膜密封的方底或圓底96深孔板中培養(yǎng)的；或在對照搖管中培養(yǎng)的細(xì)胞隨時間的活細(xì)胞百分比圖。誤差棒表示n＝3的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖12是在含有200μL、300μL或500μL培養(yǎng)基、以330RPM或360RPM攪拌并使用Applikon系統(tǒng)或拋棄式膜密封的方底或圓底96深孔板中培養(yǎng)的；或在對照搖管中培養(yǎng)的細(xì)胞隨時間的活細(xì)胞密度圖。誤差棒表示n＝3的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖13是在含有200μL、300μL或500μL培養(yǎng)基、以330RPM或360RPM攪拌并使用Applikon系統(tǒng)或拋棄式膜密封的方底或圓底96深孔板中培養(yǎng)的；或在對照搖管中培養(yǎng)的細(xì)胞隨時間的活細(xì)胞百分比圖。誤差棒表示n＝3的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖14是在含有300μL或500μL培養(yǎng)基并以320RPM、330RPM或340RPM攪拌的方底96深孔板中培養(yǎng)的；或在對照搖管中培養(yǎng)的細(xì)胞隨時間的活細(xì)胞密度圖。誤差棒表示n＝3的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖15是在含有100μL、200μL或300μLCDCHO培養(yǎng)基并以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的圓底96深孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，或在搖管(帶有使用對照再補(bǔ)料速率或修改的再補(bǔ)料速率進(jìn)行的培養(yǎng)基灌注)中培養(yǎng)的細(xì)胞隨時間的活細(xì)胞密度圖。誤差棒表示n＝2的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖16是在含有200μL、400μL或600μLCDCHO培養(yǎng)基并以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的方底96深孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，或在搖管(帶有使用對照再補(bǔ)料速率或修改的再補(bǔ)料速率進(jìn)行的培養(yǎng)基灌注)中培養(yǎng)的細(xì)胞隨時間的活細(xì)胞密度圖。誤差棒表示n＝2的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖17是在含有100μL、200μL或300μLCDCHO培養(yǎng)基并以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的圓底96深孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，或在搖管(帶有使用對照再補(bǔ)料速率或修改的再補(bǔ)料速率進(jìn)行的培養(yǎng)基灌注)中培養(yǎng)的細(xì)胞的整體/積分的活細(xì)胞密度圖。誤差棒表示n＝2的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖18是在含有200μL、400μL或600μLCDCHO培養(yǎng)基并以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的方底96深孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，或在搖管(帶有使用對照再補(bǔ)料速率或修改的再補(bǔ)料速率進(jìn)行的培養(yǎng)基灌注)中培養(yǎng)的細(xì)胞的整體/積分的活細(xì)胞密度圖。誤差棒表示n＝2的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖19是在含有100μL、200μL或300μLCDCHO培養(yǎng)基并以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的圓底96深孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，或在搖管(帶有使用對照再補(bǔ)料速率或修改的再補(bǔ)料速率進(jìn)行的培養(yǎng)基灌注)中培養(yǎng)的細(xì)胞的體積生產(chǎn)率圖。誤差棒表示n＝2的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖20是在含有200μL、400μL或600μLCDCHO培養(yǎng)基并以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的方底96深孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，或在搖管(帶有使用對照再補(bǔ)料速率或修改的再補(bǔ)料速率進(jìn)行的培養(yǎng)基灌注)中培養(yǎng)的細(xì)胞的體積生產(chǎn)率圖。誤差棒表示n＝2的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖21是在含有100μL、200μL或300μLCDCHO培養(yǎng)基并以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的圓底96深孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，或在搖管(帶有使用對照再補(bǔ)料速率或修改的再補(bǔ)料速率進(jìn)行的培養(yǎng)基灌注)中培養(yǎng)的細(xì)胞的比生產(chǎn)率圖。誤差棒表示n＝2的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖22是在含有200μL、400μL或600μLCDCHO培養(yǎng)基并以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的方底96深孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，或在搖管(帶有使用對照再補(bǔ)料速率或修改的再補(bǔ)料速率進(jìn)行的培養(yǎng)基灌注)中培養(yǎng)的細(xì)胞的比生產(chǎn)率圖。誤差棒表示n＝2的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖23是實時數(shù)據(jù)擬合至活細(xì)胞密度的模型預(yù)測的圖。圖24是實時數(shù)據(jù)擬合至體積生產(chǎn)率的模型預(yù)測的圖。圖25是一組12幅圖，顯示了基于輸入考慮了標(biāo)準(zhǔn)偏差的統(tǒng)計學(xué)模型的經(jīng)驗數(shù)據(jù)的最佳操作條件。圖26是產(chǎn)生重組單克隆抗體的哺乳動物細(xì)胞系在置于方底96深孔板中并以330RPM的頻率攪拌的500μL的多種不同培養(yǎng)基之一中的活細(xì)胞密度概貌圖。對照數(shù)據(jù)代表CDCHO培養(yǎng)基。圖27是產(chǎn)生重組酶的哺乳動物細(xì)胞系在置于方底96深孔板中并以330RPM的頻率攪拌的活細(xì)胞密度概貌圖。對照數(shù)據(jù)代表CDCHO培養(yǎng)基。圖28是產(chǎn)生重組單克隆抗體的哺乳動物細(xì)胞系在置于方底96深孔板中并以330RPM的頻率攪拌的500μL的多種不同培養(yǎng)基之一中的培養(yǎng)物的滴度/效價(mg/mL)圖。對照數(shù)據(jù)代表CDCHO培養(yǎng)基。圖29是產(chǎn)生重組酶的哺乳動物細(xì)胞系在置于方底96深孔板中并以330RPM的頻率攪拌的500μL的多種不同培養(yǎng)基之一中的培養(yǎng)物的滴度/效價(mg/mL)圖。對照數(shù)據(jù)代表CDCHO培養(yǎng)基。詳述本文提供在多孔板中培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的改進(jìn)的方法。所述培養(yǎng)方法可以實現(xiàn)與較大規(guī)模生產(chǎn)灌注生物反應(yīng)器所實現(xiàn)的類似的活哺乳動物細(xì)胞濃度(例如，在液體培養(yǎng)基，例如第一液體培養(yǎng)基，或第一和第二液體培養(yǎng)基的組合中)，例如，大于10x106細(xì)胞/mL、大于15x106細(xì)胞/mL、大于20x106細(xì)胞/mL、大于25x106細(xì)胞/mL、大于30x106細(xì)胞/mL、大于35x106細(xì)胞/mL、大于40x106細(xì)胞/mL、大于45x106細(xì)胞/mL、大于50x106細(xì)胞/mL、大于55x106細(xì)胞/mL或大于60x106細(xì)胞/mL的哺乳動物細(xì)胞密度。例如，所述培養(yǎng)方法能夠產(chǎn)生10x106細(xì)胞/mL至70x106細(xì)胞/mL、10x106細(xì)胞/mL至65x106細(xì)胞/mL、10x106細(xì)胞/mL至60x106細(xì)胞/mL、10x106細(xì)胞/mL至50x106細(xì)胞/mL、10x106細(xì)胞/mL至40x106細(xì)胞/mL、10x106細(xì)胞/mL至30x106細(xì)胞/mL、15x106細(xì)胞/mL至70x106細(xì)胞/mL、15x106細(xì)胞/mL至65x106細(xì)胞/mL、15x106細(xì)胞/mL至60x106細(xì)胞/mL、15x106細(xì)胞/mL至55x106細(xì)胞/mL、15x106細(xì)胞/mL至50x106細(xì)胞/mL、15x106細(xì)胞/mL至45x106細(xì)胞/mL、15x106細(xì)胞/mL至40x106細(xì)胞/mL、15x106細(xì)胞/mL至35x106細(xì)胞/mL、20x106細(xì)胞/mL至70x106細(xì)胞/mL、20x106細(xì)胞/mL至65x106細(xì)胞/mL、20x106細(xì)胞/mL至60x106細(xì)胞/mL、20x106細(xì)胞/mL至55x106細(xì)胞/mL、20x106細(xì)胞/mL至50x106細(xì)胞/mL、20x106細(xì)胞/mL至45x106細(xì)胞/mL、20x106細(xì)胞/mL至40x106細(xì)胞/mL、25x106細(xì)胞/mL至70x106細(xì)胞/mL、25x106細(xì)胞/mL至65x106細(xì)胞/mL、25x106細(xì)胞/mL至60x106細(xì)胞/mL、25x106細(xì)胞/mL至55x106細(xì)胞/mL、25x106細(xì)胞/mL至50x106細(xì)胞/mL、25x106細(xì)胞/mL至45x106細(xì)胞/mL、30x106細(xì)胞/mL至70x106細(xì)胞/mL、30x106細(xì)胞/mL至65x106細(xì)胞/mL、30x106細(xì)胞/mL至60x106細(xì)胞/mL、30x106細(xì)胞/mL至55x106細(xì)胞/mL、30x106細(xì)胞/mL至50x106細(xì)胞/mL、35x106細(xì)胞/mL至70x106細(xì)胞/mL、35x106細(xì)胞/mL至65x106細(xì)胞/mL、35x106細(xì)胞/mL至60x106細(xì)胞/mL、35x106細(xì)胞/mL至55x106細(xì)胞/mL、40x106細(xì)胞/mL至70x106細(xì)胞/mL、40x106細(xì)胞/mL至65x106細(xì)胞/mL、40x106細(xì)胞/mL至60x106細(xì)胞/mL、40x106細(xì)胞/mL至55x106細(xì)胞/mL、45x106細(xì)胞/mL至70x106細(xì)胞/mL或45x106細(xì)胞/mL至65x106細(xì)胞/mL的活哺乳動物細(xì)胞濃度。多種不同的方法可以用于測定細(xì)胞密度或活細(xì)胞密度。例如，可以將細(xì)胞培養(yǎng)物的樣品在生理緩沖液中稀釋，將稀釋的細(xì)胞懸浮液置于血細(xì)胞計數(shù)器中，并使用光學(xué)顯微術(shù)計數(shù)細(xì)胞。在另一方法中，活細(xì)胞密度可以使用類似的方法確定，但在生理緩沖液中包括染料，所述染料被非存活細(xì)胞選擇性地攝取(例如，錐蟲藍(lán)(trypanblue)，如來自BeckmanCoulter的Vi-CELL方法(見BeckmanCoulter網(wǎng)站))。在又另一實例中，細(xì)胞密度或活細(xì)胞密度可以使用熒光輔助流式細(xì)胞術(shù)(例如，來自MerckMillipore的GUAVA(參見Millipore網(wǎng)站))和其他細(xì)胞計數(shù)方法確定。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)方法產(chǎn)生顯著改進(jìn)的比生產(chǎn)率。例如，本文提供的方法實現(xiàn)的比生產(chǎn)率與在基本上相同的培養(yǎng)條件下、但不去除某個體積的第一培養(yǎng)基并添加第二體積的第二培養(yǎng)基所實現(xiàn)的比生產(chǎn)率相比是至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍大。本發(fā)明的方法實現(xiàn)的生產(chǎn)力可以是至少10,000單位/L、至少15,000單位/L、至少約20,000單位/L、至少約25,000單位/L、至少約30,000單位/L、至少約35,000單位/L或至少約40,000單位/L(在所述第一和/或第二液體培養(yǎng)基中)。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法實現(xiàn)的生產(chǎn)力可以是至少1g/L、至少1.5g/L、至少2.0g/L、至少2.5g/L、至少3.0g/L、至少4.0g/L、至少4.5g/L或至少5.0g/L。重組蛋白的生物活性可使用本領(lǐng)域已知的多種方法評估，并且會依賴于特定重組蛋白的活性。例如，作為免疫球蛋白(例如，抗體或抗體片段)的重組蛋白的生物活性可以通過測量所述抗體與其特異性表位的親和力來測定(例如，使用Biocore或競爭性酶聯(lián)吸附測定法)。所述重組蛋白可為酶(例如，重組半乳糖苷酶，例如，重組α-半乳糖苷酶)，而生物活性可通過測量酶的活性測定(例如，通過測量可檢測底物的濃度的減少或可檢測產(chǎn)物的濃度的增加(例如，使用分光光度法或光發(fā)射)來測定酶的催化速率常數(shù))。例如，重組半乳糖苷酶的生物活性可通過測量神經(jīng)酰胺三己糖苷(globotriasylceramide)(GL-3)或半乳糖二糖基神經(jīng)酰胺(galabiosylceramide)水平的減少，或神經(jīng)酰胺二己糖苷或半乳糖水平的增加來檢測。還提供能夠用于進(jìn)行例如本文描述的任何方法的多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)。用于測試制造工藝的方法本文還提供用于測試制備重組蛋白(例如，本文所述的或本領(lǐng)域已知的任何重組蛋白)的制造工藝的方法。這些方法包括實施本文所述的產(chǎn)生重組蛋白的方法，在所述方法的過程中和/或在那之后，檢測或測量至少一種(例如，兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種、十三種或十四種)培養(yǎng)讀數(shù)(例如，細(xì)胞中或第一和/或第二培養(yǎng)基中的重組蛋白量、葡萄糖消耗、活細(xì)胞濃度、乳酸產(chǎn)生、體積生產(chǎn)率、比生產(chǎn)率、從葡萄糖產(chǎn)生乳酸的產(chǎn)率、谷氨酰胺濃度、谷氨酸濃度、培養(yǎng)基的pH、溶解CO2的分壓或濃度、溶解O2的分壓或濃度、代謝物質(zhì)量轉(zhuǎn)移和代謝物質(zhì)量平衡)；并將所述至少一種培養(yǎng)讀數(shù)與所述至少一種(例如，兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或十三種)培養(yǎng)讀數(shù)的參照水平(例如，細(xì)胞中或第一和/或第二培養(yǎng)基中存在的(例如，檢測的)重組蛋白量、葡萄糖消耗、活細(xì)胞濃度、乳酸產(chǎn)生、體積生產(chǎn)率、比生產(chǎn)率、從葡萄糖產(chǎn)生乳酸的產(chǎn)率、谷氨酰胺濃度、谷氨酸濃度、培養(yǎng)基的pH、溶解CO2的分壓或濃度、溶解O2的分壓或濃度、代謝物質(zhì)量轉(zhuǎn)移和代謝物質(zhì)量平衡的參照水平)進(jìn)行比較。熟練的操作者會理解本文描述的多種培養(yǎng)參數(shù)中的任何參數(shù)(例如，多孔板、體積、替代培養(yǎng)液體積的速率或頻率、攪拌頻率、溫度、培養(yǎng)基、CO2濃度和反應(yīng)器角度)能夠以任何組合使用以實施這些方法。另外，本文描述的或本領(lǐng)域已知的任何哺乳動物細(xì)胞可用于所述方法中。至少一種培養(yǎng)讀數(shù)(例如，細(xì)胞中或第一和/或第二培養(yǎng)基中存在的(例如，細(xì)胞中或第一和/或第二培養(yǎng)基中的重組蛋白量、葡萄糖消耗、活細(xì)胞濃度、乳酸產(chǎn)生、體積生產(chǎn)率、比生產(chǎn)率、從葡萄糖產(chǎn)生乳酸的產(chǎn)率、谷氨酰胺濃度、谷氨酸濃度、培養(yǎng)基的pH、溶解CO2的分壓或濃度、溶解O2的分壓或濃度、代謝物質(zhì)量轉(zhuǎn)移和代謝物質(zhì)量平衡)的參照水平可為使用不同培養(yǎng)方法產(chǎn)生的水平，所述培養(yǎng)方法例如利用至少一種不同的培養(yǎng)參數(shù)(例如，不同的第一和/或第二液體培養(yǎng)基、不同的哺乳動物細(xì)胞、不同的頻率和/或攪拌類型、不同的多孔板、不同的分批再補(bǔ)料或灌注速率(例如，在24小時時間段或其他遞增的時間段內(nèi)10％至200％的孔體積或第一液體培養(yǎng)基體積)和任何其他本文描述的培養(yǎng)參數(shù))的培養(yǎng)方法。例如，重組蛋白的參照量可為使用一組產(chǎn)生不同水平的溶解O2和/或不同水平的液體剪切應(yīng)力的培養(yǎng)參數(shù)產(chǎn)生的重組蛋白水平。本文描述的方法可用于測試制造方法的任何組分或特征的效果。例如，本文描述的方法可用于測試不同的原料、攪拌水平、多孔板、抗結(jié)塊劑、培養(yǎng)基(例如，化學(xué)上限定的培養(yǎng)基)或營養(yǎng)元素或化合物對至少一種培養(yǎng)讀數(shù)的作用(例如，本文描述的任何培養(yǎng)讀數(shù)，例如，對重組蛋白產(chǎn)生和/或哺乳動物細(xì)胞生長的效果)。例如，本文提供測試第一或第二液體培養(yǎng)基、第一或第二液體培養(yǎng)基中存在的原始成分或補(bǔ)充劑或哺乳動物細(xì)胞的來源用于在產(chǎn)生重組蛋白的方法中的用途的效力的方法，所述方法包括提供包含至少一個包含置于第一液體培養(yǎng)基中的哺乳動物細(xì)胞的孔的多孔板，所述第一液體培養(yǎng)基占據(jù)約5％至約70％的孔體積；在約31℃至約40℃并伴隨約320RPM至約500RPM旋轉(zhuǎn)攪拌將所述多孔板溫育一段時間；在該段時間過程中，連續(xù)地或周期性地去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基并向所述第一液體培養(yǎng)基添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基，其中所述第一和第二體積大致相等；檢測或測定至少一種培養(yǎng)讀數(shù)(例如，本文描述的任何培養(yǎng)讀數(shù)，例如，細(xì)胞中或第一和/或第二培養(yǎng)基中的重組蛋白的量)；將所述至少一種培養(yǎng)讀數(shù)與通過不同培養(yǎng)方法產(chǎn)生的該至少一種培養(yǎng)讀數(shù)(例如，本文描述的任何培養(yǎng)讀數(shù)，例如，細(xì)胞中或第一和/或第二培養(yǎng)基中的重組蛋白的量)的參照水平比較，所述不同培養(yǎng)方法使用不同的第一或第二液體培養(yǎng)基或不同的哺乳動物細(xì)胞來源中的一種或多種；并將與所述至少一種培養(yǎng)讀數(shù)相較于參照水平的有利變化(例如，增加或減少)(例如，增加的重組蛋白量)相關(guān)的第一或第二液體培養(yǎng)基、第一或第二液體培養(yǎng)基中存在的原始成分或補(bǔ)充劑或哺乳動物細(xì)胞來源鑒定為對于在產(chǎn)生重組蛋白的方法中的使用而言是有效的。例如，相較于參照水平的重組蛋白水平的增加、活細(xì)胞濃度的增加、體積生產(chǎn)率的增加、比生產(chǎn)率的增加和葡萄糖消耗的增加指示該第一或第二液體培養(yǎng)基、第一或第二液體培養(yǎng)基中存在的該原始成分或補(bǔ)充劑或該哺乳動物細(xì)胞來源對于在產(chǎn)生重組蛋白的方法中的使用而言是有效的。本文描述的方法還可用于測試改變本文描述的或本領(lǐng)域已知的多種細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)(例如，孔的體積、高度、直徑或底部形狀、攪拌的頻率或類型、剪切力、培養(yǎng)接種密度、第一或第二液體培養(yǎng)基的pH、溶解O2濃度或分壓、孔的內(nèi)表面涂層、液體培養(yǎng)基(例如，第一和/或第二液體培養(yǎng)基)內(nèi)的多種內(nèi)容物、哺乳動物細(xì)胞類型或細(xì)胞系、CO2暴露或溶解CO2濃度或分壓、溫度、液體培養(yǎng)基的體積(例如，第一和/或第二液體培養(yǎng)基的體積)和/或去除第一體積的第一培養(yǎng)基和添加第二體積的第二培養(yǎng)基至第一培養(yǎng)基的速率或頻率)中的任何參數(shù)的效果。所述方法還可用于測試用于制備液體培養(yǎng)基(例如，第一和/或第二液體培養(yǎng)基)的水質(zhì)和/或液體培養(yǎng)基中的不同痕量金屬對至少一種培養(yǎng)讀數(shù)的效果(例如，本文描述的任何培養(yǎng)讀數(shù)，例如，對重組蛋白產(chǎn)生和/或哺乳動物細(xì)胞生長的效果)。所述方法還可用于測試生長因子或生長激素對至少一種培養(yǎng)讀數(shù)的效果(例如，本文描述的任何培養(yǎng)讀數(shù)，例如，對重組蛋白產(chǎn)生和/或哺乳動物細(xì)胞生長的效果)。所述方法還可用于測試用于制備第一和/或第二液體培養(yǎng)基的過濾方法和過濾器。所述方法還可用于測試液體培養(yǎng)基穩(wěn)定性和液體培養(yǎng)基對生物學(xué)功能的效果(例如，本文描述的任何培養(yǎng)讀數(shù)中的至少一種，例如，對重組蛋白產(chǎn)生和/或哺乳動物細(xì)胞生長的效果)。所述方法還可用于篩選多種重組細(xì)胞系和細(xì)胞庫產(chǎn)生期望的重組蛋白(例如，期望的分泌性治療蛋白)的能力。如本文所注意到的，所述方法還可用于篩選任何細(xì)胞培養(yǎng)方法參數(shù)，包括但不限于，攪拌的類型和頻率、剪切力、灌注速率和體積、培養(yǎng)物接種密度等。本文描述的方法還可用于測試第一或第二液體培養(yǎng)基中污染物的存在、用于生成第一或第二液體培養(yǎng)基的原材料或哺乳動物細(xì)胞的來源。例如，本文提供測試第一或第二液體培養(yǎng)基中污染物的存在、用于生成第一或第二液體培養(yǎng)基的原材料或哺乳動物細(xì)胞的來源的方法，所述方法包括提供包含至少一個含有懸浮于第一液體培養(yǎng)基中的哺乳動物細(xì)胞的孔的多孔板，所述第一液體培養(yǎng)基占據(jù)約5％至約70％的孔體積；在約31℃至約40℃并伴隨約320轉(zhuǎn)每分鐘(RPM)至約500RPM攪拌將所述多孔板溫育一段時間；在該段時間過程中，連續(xù)地或周期性地去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基并向所述第一液體培養(yǎng)基添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基，其中所述第一和第二體積大致相等；檢測或測定至少一種培養(yǎng)讀數(shù)(例如，本文描述的任何培養(yǎng)讀數(shù)，例如，細(xì)胞中或第一和/或第二培養(yǎng)基中的重組蛋白的量)；將所述至少一種培養(yǎng)讀數(shù)與通過不同培養(yǎng)方法產(chǎn)生的至少一種培養(yǎng)讀數(shù)(例如，本文描述的任何培養(yǎng)讀數(shù)，例如，細(xì)胞中或第一和/或第二培養(yǎng)基中的重組蛋白的量)的參照水平比較，所述不同培養(yǎng)方法使用不同的第一或第二液體培養(yǎng)基、生成所述第一或第二液體培養(yǎng)基的不同原材料或不同的哺乳動物細(xì)胞來源中的一種或多種；并且當(dāng)所述至少一種培養(yǎng)參數(shù)的水平相較于參照水平不利變化(例如，增加或減少)時，將該第一或第二液體培養(yǎng)基、生成該第一或第二液體培養(yǎng)基的原材料或該哺乳動物細(xì)胞來源鑒定為含有污染物。例如，與參照水平比較重組蛋白產(chǎn)生的減少(例如，細(xì)胞中或第一和/或第二培養(yǎng)基中的重組蛋白的減少)、體積生產(chǎn)率的減少或活細(xì)胞濃度的減少是不利的變化，其指示在該第一或第二液體培養(yǎng)基、用于生成該第一或第二液體培養(yǎng)基的原材料或該哺乳動物細(xì)胞來源中污染物的存在。一些方法進(jìn)一步包括一種或多種測定該第一或第二液體培養(yǎng)基、用于生成該第一或第二液體培養(yǎng)基的原材料或該哺乳動物細(xì)胞來源中存在的污染物的身份的測定法。污染物可能是生物污染物(例如，分枝桿菌、真菌、細(xì)菌、病毒或不希望的哺乳動物細(xì)胞)。污染物也可為物理上未表征的物質(zhì)。所述方法可用于進(jìn)行高通量細(xì)胞培養(yǎng)實驗來執(zhí)行對細(xì)胞培養(yǎng)方法的實驗設(shè)計(design-of-experiment；DOE)或質(zhì)量源于設(shè)計(quality-by-design；QBD)優(yōu)化。例如，本文提供優(yōu)化產(chǎn)生重組蛋白的制造工藝的方法，所述方法包括提供包含至少一個含有懸浮于第一液體培養(yǎng)基中的哺乳動物細(xì)胞的孔的多孔板，所述第一液體培養(yǎng)基占據(jù)約5％至約70％的孔體積；在約31℃至約40℃并伴隨約320轉(zhuǎn)每分鐘(RPM)至約500RPM旋轉(zhuǎn)攪拌將所述多孔板溫育一段時間；在該段時間過程中，連續(xù)地或周期性地去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基并向所述第一液體培養(yǎng)基添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基，其中所述第一和第二體積大致相等；檢測至少一種培養(yǎng)讀數(shù)(例如，本文描述的任何培養(yǎng)讀數(shù)，例如，細(xì)胞中或第一和/或第二液體培養(yǎng)基中的重組蛋白的量)；將所述至少一種培養(yǎng)讀數(shù)與通過不同培養(yǎng)方法產(chǎn)生的至少一種培養(yǎng)讀數(shù)(例如，本文描述的任何培養(yǎng)讀數(shù)，例如，細(xì)胞中或第一和/或第二培養(yǎng)基中存在的重組蛋白的量)的參照水平比較；并且鑒定和去除或改變制造方法中與相較于至少一種培養(yǎng)讀數(shù)(例如，本文描述的任何培養(yǎng)讀數(shù)，例如，產(chǎn)生的重組蛋白量)的參照水平的至少一種培養(yǎng)讀數(shù)的不利變化(例如，增加或減少)相關(guān)的任何培養(yǎng)組分或參數(shù)，或鑒定并向制造方法添加與相較于至少一種培養(yǎng)讀數(shù)(例如，本文描述的任何培養(yǎng)讀數(shù)，例如，產(chǎn)生的重組蛋白量)的參照水平的至少一種培養(yǎng)讀數(shù)的有利變化(例如，增加或減少)相關(guān)的任何培養(yǎng)組分或參數(shù)。例如，產(chǎn)生的重組蛋白量、體積生產(chǎn)率、比生產(chǎn)率或活細(xì)胞濃度的增加是培養(yǎng)讀數(shù)中的有利變化，而產(chǎn)生的重組蛋白量、體積生產(chǎn)率、比生產(chǎn)率或活細(xì)胞濃度的減少是培養(yǎng)讀數(shù)中的不利變化。在一些情況中，所述方法用于以高通量方式鑒定能夠用于重組蛋白的規(guī)模放大(例如，生物反應(yīng)器)生產(chǎn)的優(yōu)化的細(xì)胞培養(yǎng)條件。在本節(jié)描述的任何方法中，至少一種培養(yǎng)讀數(shù)的參照水平可來自較大規(guī)模培養(yǎng)(例如，灌注生物反應(yīng)器，例如，2000-L灌注生物反應(yīng)器、40-L灌注生物反應(yīng)器或12-L灌注生物反應(yīng)器)。在本節(jié)描述的任何方法的一些實施方案中，將哺乳動物細(xì)胞使用本文描述的任何方法培養(yǎng)在多孔板中，經(jīng)歷與實施較大規(guī)模培養(yǎng)相同的時間段(平行培養(yǎng))。例如，在本文描述的任何方法中用于接種多孔板的接種物也用于在大致相同的時間接種較大規(guī)模灌注生物反應(yīng)器。在一個實施方案中，用于接種孔的接種物獲得自較大規(guī)模培養(yǎng)(例如，較大規(guī)模灌注生物反應(yīng)器)。例如，將來自任意時間點的較大規(guī)模培養(yǎng)的等分試樣(例如，在生長階段、過渡階段(例如，當(dāng)培養(yǎng)物正在過渡至一組不同的生長條件例如不同的液體培養(yǎng)基和/或溫度的任選時期)或收獲階段期間取出)用于接種孔(例如，用于起始衛(wèi)星多孔板培養(yǎng))。等分試樣可在生長階段期間自較大規(guī)模培養(yǎng)取出并用于接種(inoculate)或接種(seed)包含至少一個含有液體培養(yǎng)基的孔的多孔板，隨后將所述孔在復(fù)制了或類似于較大規(guī)模培養(yǎng)中采用的生長階段條件的條件下培養(yǎng)?？商鎿Q地或者此外，等分試樣可取自過渡階段期間的較大規(guī)模培養(yǎng)并用于接種(inoculate)或接種(seed)含有至少一個含有液體培養(yǎng)基的孔的多孔板，隨后將所述孔在復(fù)制了或類似于較大規(guī)模培養(yǎng)中采用的過渡階段條件的條件下培養(yǎng)?？商鎿Q地或者此外，等分試樣可取自收獲階段期間的較大規(guī)模培養(yǎng)并用于接種(inoculate)或接種(seed)含有至少一個含有液體培養(yǎng)基的孔的多孔板，隨后將所述孔在復(fù)制了或類似于較大規(guī)模培養(yǎng)中采用的收獲階段條件的條件下培養(yǎng)。在任何這些方法中，可改變在用于在多孔板中培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的方法中的一種或多種培養(yǎng)參數(shù)(相較于在較大規(guī)模培養(yǎng)中用于培養(yǎng)所述哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)參數(shù)或組分)，測量至少一種培養(yǎng)讀數(shù)，并將所述至少一種培養(yǎng)讀數(shù)與針對所述較大規(guī)模培養(yǎng)所測定的至少一種培養(yǎng)讀數(shù)進(jìn)行比較。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的，這些方法能夠用于測試特定培養(yǎng)參數(shù)或組分對培養(yǎng)方法中一個或多個具體階段過程中的至少一種培養(yǎng)讀數(shù)的作用(例如，一種或多種培養(yǎng)參數(shù)和/或培養(yǎng)組分對生長階段、任選的過渡階段和/或收獲階段期間至少一種培養(yǎng)讀數(shù)的作用)。在某些實施方案中，可實施這些方法以測定污染物是否存在于較大規(guī)模生物反應(yīng)器中，其通過測定或檢測多孔板(例如，用較大規(guī)模生物反應(yīng)器培養(yǎng)的等分試樣或用于接種較大規(guī)模生物反應(yīng)器的同一冷凍細(xì)胞庫接種)中的至少一種培養(yǎng)讀數(shù)，將所述至少一種培養(yǎng)讀數(shù)與至少一種培養(yǎng)讀數(shù)的參照水平(例如，來自基本上不含污染的培養(yǎng)物的至少一種培養(yǎng)讀數(shù)的水平)相比，并且當(dāng)與所述至少一種培養(yǎng)讀數(shù)的參照水平相比孔中的至少一種培養(yǎng)讀數(shù)指示孔中存在污染物時，將較大規(guī)模生物反應(yīng)器鑒定為含有污染物。例如，所述污染物可以是生物污染物，如病毒、真菌、不希望的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)菌，如分枝桿菌。例如，所述污染物可為水皰疹病毒(vesivirus)。多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)本說明書提供用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞(例如，使用任何本文所述的方法)的示例性多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)。這些系統(tǒng)經(jīng)設(shè)計以允許通過至少一個端口連續(xù)或周期去除培養(yǎng)容器中存在的流體(例如，第一液體培養(yǎng)基)和向培養(yǎng)容器添加流體(例如，第二液體培養(yǎng)基)，所述端口經(jīng)配置以容納流入和/或流出所述培養(yǎng)容器的流體流。示例性多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)1的非限定性實例的頂視圖在圖1中提供。多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)1包括一體支持板2，一體支持板2包含具有多個孔4的表面3?？卓梢砸匀魏涡问脚帕?，并且盡管圖1顯示孔呈線和行的形式，熟練的操作人員會理解可以采用孔的任何構(gòu)型。示例性多孔培養(yǎng)板系統(tǒng)11的非限定性實例的側(cè)視圖在圖2中提供。多孔培養(yǎng)板系統(tǒng)11包括一體支持板2，所述一體支持板2具有包括多個孔4的表面3。所述一體支持板2可由任何生物相容性材料(例如，聚苯乙烯或任何其他本領(lǐng)域已知的生物相容性材料)制成。所述一體支持板2可具有至少2個孔4(例如，4、6、9、10、12、15、18、20、24、36、48、60、72或96個孔4)或者可具有至少3、4、5、6、12、18、24、36、48或96個孔4。圖2中所示的多孔培養(yǎng)板系統(tǒng)11具有多個在支持板2之內(nèi)形成的或設(shè)置的并配置用于容納細(xì)胞培養(yǎng)物(例如，本文描述的任何示例性哺乳動物細(xì)胞和/或組織培養(yǎng)基)的培養(yǎng)容器5。容器5可經(jīng)配置以容納任何體積的細(xì)胞培養(yǎng)物，例如，那些具有約0.3mL至約25mL(例如，約0.3mL至約24mL、約0.3mL至約22mL、約0.3mL至約20mL、約0.3mL至約18mL、約0.3mL至約16mL、約0.3mL至約14mL、約0.3mL至約12mL、約0.3mL至約10mL、約0.3mL至約8mL、約0.3mL至約6mL、約0.3mL至約5mL、約0.3mL至約4mL、約0.3mL至約3mL、約0.3mL至約2mL、約0.3mL至約1mL、約0.5mL至約25mL、約0.5mL至約24mL、約0.5mL至約22mL、約0.5mL至約0.5mL至約20mL、約0.5mL至約18mL、約0.5mL至約16mL、約0.5mL至約14mL、約0.5mL至約12mL、約0.5mL至約10mL、約0.5mL至約8mL、約0.5mL至約6mL、約0.5mL至約5mL、約0.5mL至約4mL、約0.5mL至約3mL、約0.5mL至約2mL、約0.5mL至約1mL、約1mL至約25mL、約1mL至約24mL、約1mL至約22mL、約1mL至約20mL、約1mL至約18mL、約1mL至約16mL、約1mL至約14mL、約1mL至約12mL、約1mL至約10mL、約1mL至約8mL、約1mL至約7mL、約1mL至約6mL、約1mL至約5mL、約1mL至約4mL、約1mL至約3.5mL、約1mL至約3mL、約1mL至約2.5mL、約1mL至約2mL、約1mL至約1.5mL、約1.5mL至約25mL、約1.5mL至約24mL、約1.5mL至約22mL、約1.5mL至約20mL、約1.5mL至約18mL、約1.5mL至約16mL、約1.5mL至約14mL、約1.5mL至約12mL、約1.5mL至約10mL、約1.5mL至約8mL、約1.5mL至約6mL、約1.5mL至約5mL、約1.5mL至約4mL、約1.5mL至約3.5mL、約1.5mL至約3mL、約1.5mL至約2.5mL、約1.5mL至約2.0mL、約2mL至約25mL、約2mL至約24mL、約2mL至約22mL、約2mL至約20mL、約2mL至約18mL、約2mL至約16mL、約2mL至約14mL、約2mL至約12mL、約2mL至約10mL、約2mL至約8mL、約2mL至約6mL或約2mL至約5mL)的體積的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中每個孔3與每個培養(yǎng)容器4配對并限定進(jìn)入每個培養(yǎng)容器中的開口。所述培養(yǎng)容器5可具有不同的形狀。所述培養(yǎng)容器的形狀的非限定性實例可為大致圓柱或圓柱形，其具有與孔4的末端相對的末端，所述末端是例如平的、半球形的、金字塔形的或圓錐形的?？?的直徑可為，例如，約4.0mm至約50mm(例如，約4.0mm至約45mm、約4.0mm至約40mm、約4.0mm至約35mm、約4.0mm至約30mm、約4.0mm至約25mm、約4.0mm至約20mm、約4.0mm至約15mm、約4.0mm至約10mm、約6.0mm至約50mm、約6.0mm至約45mm、約6.0mm至約40mm、約6.0mm至約35mm、約6.0mm至約30mm、約6.0mm至約25mm、約6.0mm至約25mm、約6.0mm至約20mm、約6.0mm至約15mm、約6.0mm至約10mm、約8mm至約50mm、約8mm至約45mm、約8mm至約40mm、約8mm至約35mm、約8mm至約30mm、約8mm至約25mm、約8mm至約20mm、約8mm至約15mm、約10mm至約50mm、約10mm至約45mm、約10mm至約40mm、約10mm至約35mm、約10mm至約30mm、約10mm至約25mm、約10mm至約20mm、約15mm至約50mm、約15mm至約45mm、約15mm至約40mm、約15mm至約35mm、約15mm至約30mm、約15mm至約25mm或約15mm至約20mm)。培養(yǎng)容器5可具有約1cm至約12cm(例如，約1cm至約11cm、約1cm至約10cm、約1cm至約9cm、約1cm至約8cm、約1cm至約7cm、約1cm至約6cm、約1cm至約5cm、約1cm至約4cm、約1cm至約3cm、約1.2cm至約12cm、約1.2cm至約11cm、約1.2cm至約10cm、約1.2cm至約9cm、約1.2cm至約8cm、約1.2cm至約7cm、約1.2cm至約6cm、約1.2cm至約5cm、約1.2cm至約4cm、約1.2cm至約3cm、約1.5cm至約11cm、約1.5cm至約10cm、約1.5cm至約9cm、約1.5cm至約8cm、約1.5cm至約7cm、約1.5cm至約6cm、約1.5cm至約5cm、約1.5cm至約4cm、約1.5cm至約3cm、約2cm至約12cm、約2cm至約11cm、約2cm至約10cm、約2cm至約9cm、約2cm至約8cm、約2cm至約7cm、約2cm至約6cm、約2cm至約5cm、約2cm至約4cm、約2cm至約3cm、約2.5cm至約12cm、約2.5cm至約11cm、約2.5cm至約10cm、約2.5cm至約9cm、約2.5cm至約8cm、約2.5cm至約7cm、約2.5cm至約6cm、約2.5cm至約5cm、約2.5cm至約4cm、約3cm至約12cm、約3cm至約11cm、約3cm至約10cm、約3cm至約9cm、約3cm至約8cm、約3cm至約7cm、約3cm至約6cm、約3cm至約5cm、約4cm至約12cm、約4cm至約11cm、約4cm至約10cm、約4cm至約9cm、約4cm至約8cm、約4cm至約7cm、約4cm至約6cm、約5cm至約12cm、約5cm至約11cm、約5cm至約10cm、約5cm至約9cm、約5cm至約8cm或約5cm至約7cm)的高度。圖2中所示的多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)11還包括端口6，例如，單向或多向閥，其經(jīng)配置以容納流入和流出培養(yǎng)容器5的流體流。所述端口6可以流體連接至培養(yǎng)容器5的任何位置。本文描述的多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)可以具有至少一個，例如，兩個、三個或至少四個端口6流體連接至每個培養(yǎng)容器5。端口6與培養(yǎng)容器5的連接的示例性位置示于圖2和圖3中。可配置端口6以使流體以單向(例如，進(jìn)或出培養(yǎng)容器5)或雙向流動(進(jìn)和出培養(yǎng)容器5)。在一些實施方案中，第一端口6可經(jīng)配置以容納單向流入培養(yǎng)容器5的單向流，而第二端口6可經(jīng)配置以容納單向流出培養(yǎng)容器5的單向流。圖3顯示多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)12，其包括經(jīng)配置用于選擇性阻止細(xì)胞流入和流出培養(yǎng)容器5的過濾器8。過濾器8可以是任何本領(lǐng)域已知的用于過濾哺乳動物細(xì)胞的微米或納米過濾器。具有兩個或多個端口6的多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)可以具有配置在每個端口6之上或之內(nèi)的過濾器8，以選擇性地阻止細(xì)胞流入或流出所述培養(yǎng)容器5。分別顯示于圖2和圖3中的多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)12和13還包括至少一個置于一體支持板2之內(nèi)并與端口6流體聯(lián)通的導(dǎo)管7，其中所述導(dǎo)管7經(jīng)配置以使流體流至或流自培養(yǎng)容器5。在一些實例中，多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)可具有與每個端口6流體聯(lián)通的導(dǎo)管7(例如，經(jīng)配置以使流體流至和/或流自每一培養(yǎng)容器5)。本文提供的多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)可進(jìn)一步包括與端口6可操作連接的至少一個流體流調(diào)節(jié)器。本文提供的多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)可進(jìn)一步包括與導(dǎo)管7可操作連接的至少一個流體流調(diào)節(jié)器。流體流調(diào)節(jié)器的非限定性實例可以通過檢測培養(yǎng)容器5內(nèi)流體體積和/或流體壓力的變化來控制流體流動速率和/或流動方向。在一些實例中，可以對流體流調(diào)節(jié)器進(jìn)行編程以使流體以特定速率以特定的流動方向(例如，流入和/或流出培養(yǎng)容器5)流動一段特定的時間。在一些實施方案中，一體支持板2經(jīng)配置以包括用于容納液體并向端口6或?qū)Ч?供應(yīng)液體的貯液器。在一些實例中，多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)包括用于容納液體并向端口6或?qū)Ч?供應(yīng)液體的貯液器，其經(jīng)配置使得其在一體支持板2的外部并且與端口6或?qū)Ч?分別流體連接(其中所述端口6或?qū)Ч?執(zhí)行使流體流入培養(yǎng)容器5的功能)。在一些實施方案中，配置一體支持板2以包括用于容納和儲存從培養(yǎng)容器5去除的液體的貯液器，其中所述用于容納和儲存去除的液體的貯液器在一體支持板2的外部并且與端口6或?qū)Ч?流體連接(其中所述端口6或?qū)Ч?實施使流體流出培養(yǎng)容器5的功能)。經(jīng)配置以包括用于容納液體并將液體供應(yīng)至端口6的內(nèi)部貯液器9的示例性一體支持板2示于圖4。圖4中的一體支持板2進(jìn)一步包括交換端口10用于去除或向內(nèi)部貯液器9添加液體。包括內(nèi)部貯液器9的一體支持板可包括單向和/或雙向交換端口10(例如，單向或雙向閥)。例如，包括內(nèi)部貯液器9的一體支持板2可以具有第一交換端口10，其允許液體流入內(nèi)部貯液器，以及第二交換端口，其允許液體流出內(nèi)部貯液器。在另一實例中，包括內(nèi)部貯液器9的一體支持板2可具有單一雙向交換端口10，其允許液體流入和流出內(nèi)部貯液器10。內(nèi)部貯液器10中存在的流體可以通過一個或多個端口6和/或?qū)Ч?的使用流入和/或流出容器5。在一些實例中，多孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)一步包含蓋板，其經(jīng)配置以覆蓋一體支持板2和孔4(例如，一體支持板2中的全部孔4)，防止培養(yǎng)容器5的污染(例如，細(xì)菌(例如，分枝桿菌)、病毒或真菌污染)并允許培養(yǎng)容器5和外部環(huán)境之間的氣體交換。在一些實施方案中，多孔培養(yǎng)板還包括置于蓋板和一體支持板2之間的透氣性拋棄式膜或透氣性硅酮層以防止培養(yǎng)容器5的污染，同時允許培養(yǎng)容器5和外部環(huán)境之間的氣體交換。可使用本領(lǐng)域已知的流體壓力、氣壓、重力和機(jī)械壓力的多種方法中的一種或多種使流體流動通過本文描述的任何系統(tǒng)(例如，流入和/或流出系統(tǒng)，例如，流入和/或流出端口6，流入和/或流出導(dǎo)管7，或流入和/或流出交換端口10)。例如，可以使用泵、重力、離心力或機(jī)械壓力使流體移動通過本文描述的任何系統(tǒng)。用于使流體流過本文描述的任何系統(tǒng)的其他方法是本領(lǐng)域已知的。培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的方法在本文描述示例的方法中，首先提供多孔板。將第一液體培養(yǎng)基添加至孔使得培養(yǎng)基占據(jù)約5％至約80％(例如，約5％至約75％、約5％至約70％、約5％至約65％、約5％至約60％、約5％至約55％、約5％至約50％、約5％至約45％、約5％至約40％、約5％至約35％、約5％至約30％、約10％至約80％、約10％至約75％，約10％至約70％、約10％至約65％、約10％至約60％、約10％至約55％、約10％至約50％、約10％至約45％、約10％至約40％、約10％至約35％、約15％至約80％、約15％至約75％、約15％至約70％、約15％至約65％、約15％至約60％、約15％至約55％、約15％至約50％、約15％至約45％、約15％至約40％、約20％至約80％、約20％至約75％、約20％至約70％、約20％至約65％、約20％至約60％、約20％至約55％、約20％至約50％、約20％至約45％、約25％至約80％、約25％至約75％、約25％至約70％、約25％至約65％、約25％至約60％、約25％至約55％或約25％至約50％)的孔體積。將至少一個哺乳動物細(xì)胞添加至第一液體培養(yǎng)基，即，在將培養(yǎng)基添加至孔之前或在此之后。將多孔板在約31℃至約40℃并且以約300RPM至約600RPM(例如，本文描述的任何示例性攪拌范圍)攪拌(例如，在旋轉(zhuǎn)振蕩器設(shè)備上)溫育一段時間。例如，細(xì)胞可在溫育箱中溫育，如拋擲(軌道)直徑約3mm至約50mm的搖動溫育箱。在溫育過程中，在所述時間段內(nèi)連續(xù)地或周期性地去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基(例如，含有任何哺乳動物細(xì)胞濃度的，例如，基本上不含哺乳動物細(xì)胞或被制成基本上不含哺乳動物細(xì)胞的第一體積的第一液體培養(yǎng)基)，并向所述第一液體培養(yǎng)基添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基。通常，所述第一和第二體積大致相等，但是可有小量的不同，例如當(dāng)比較第一和第二體積時相差約1％至約10％(例如，約1％至約8％、約1％至約5％或約1％至約3％)。在一些實施方案中，添加的第二體積的第二液體培養(yǎng)基少于(例如，最多少約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％)去除的第一體積的第一液體培養(yǎng)基。如本領(lǐng)域已知的，術(shù)語溫育可包括在其間將含有哺乳動物細(xì)胞和液體培養(yǎng)基的多孔板從溫育箱移出從而去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基并添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基的短時間段(例如，至多1分鐘、至多2分鐘、至多3分鐘、至多4分鐘、至多5分鐘、至多10分鐘、至多20分鐘、至多30分鐘、至多40分鐘、至多50分鐘或至多1小時)。在一些實例中，術(shù)語溫育不包括在其間將含有哺乳動物細(xì)胞和液體培養(yǎng)基的多孔板從溫育箱移出從而去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基并添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基的短時間段(例如，通過使用本文描述的多孔培養(yǎng)板系統(tǒng))。這些溫育方法的各個方面的多種非限定性實例在下文描述。本文提供的方法的示例性方面可不受限地以任何組合使用。哺乳動物細(xì)胞本文提供的方法可用于培養(yǎng)多種不同的哺乳動物細(xì)胞。例如，所述哺乳動物細(xì)胞可為生長在懸浮液中的細(xì)胞或者可以是粘附細(xì)胞。能夠使用本文描述的任何方法培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞的非限定性實例包括：中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、Sp2.0、黑素瘤細(xì)胞(例如，NS/0)、B-細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、T-細(xì)胞、人胚胎腎(HEK)細(xì)胞(例如，HEK293E和HEK293F)，非洲綠猴腎上皮細(xì)胞(Vero)細(xì)胞和Madin-Darby犬(可卡犬(CockerSpaniel))腎上皮細(xì)胞(MDCK)細(xì)胞。能夠使用本文描述的方法培養(yǎng)的其他哺乳動物細(xì)胞是本領(lǐng)域已知的。哺乳動物細(xì)胞可含有編碼重組蛋白的重組核酸(例如，穩(wěn)定整合到所述哺乳動物細(xì)胞的基因組的核酸)。編碼示例性重組蛋白的重組核酸的非限定性實例在下文描述，因為重組蛋白可使用本文描述的方法產(chǎn)生。在一些情況中，置于用于培養(yǎng)的多孔板中的哺乳動物細(xì)胞源自較大培養(yǎng)。例如，多孔板中的哺乳動物細(xì)胞可源自大規(guī)模生物反應(yīng)器培養(yǎng)，即，可使用所述方法制備衛(wèi)星培養(yǎng)物。培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的。所述第一和/或第二組織培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有哺乳動物血清(例如，胎牛血清和牛血清)和/或生長激素或生長因子(例如，胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和表皮生長因子)。可替換地或另外地，第一和/或第二液體培養(yǎng)基可以是化學(xué)上限定的液體培養(yǎng)基、無動物來源組分的液體培養(yǎng)基、無血清液體培養(yǎng)基、含血清液體培養(yǎng)基或無蛋白質(zhì)液體培養(yǎng)基?；瘜W(xué)上限定的液體培養(yǎng)基、無動物來源組分的幼體培養(yǎng)基、無血清液體培養(yǎng)基和含血清液體培養(yǎng)基的非限定性實例是市售的。液體培養(yǎng)基通常含有能量源(例如，碳水化合物，如葡萄糖)、必需氨基酸(例如，基本組的二十種氨基酸加上半胱氨酸)、維生素和/或其他以低濃度需要的有機(jī)化合物、游離脂肪酸和/或痕量元素。如有需要，第一和/或第二液體培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有例如哺乳動物激素或生長因子(例如，胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽和緩沖液(例如鈣、鎂和磷酸鹽)、核苷和堿基(例如，腺苷、胸苷和次黃嘌呤)、蛋白質(zhì)和組織水解物和/或這些添加劑的任何組合。在本文描述的方法中特別有用的液體培養(yǎng)基的非限定性實例包括，例如，CDCHO、OptiCHO和FortiCHO(全部可從LifeTechnologies；GrandIsland,NY獲得)、HycellCHO培養(yǎng)基(ThermoFisherScientific,Inc.；Waltham,MA)、Ex-cellCDCHO融合培養(yǎng)基(Sigma-AldrichCo.；St.Louis,MO)和PowerCHO培養(yǎng)基(LonzaGroup,Ltd.；Basel,Switzerland)。在本方法中也可能有用的培養(yǎng)基組分包括但不限于化學(xué)成分確定(CD)的水解物，例如，CD蛋白胨、CD多肽(兩個或多個氨基酸)和CD生長因子。液體組織培養(yǎng)基和培養(yǎng)基組分的其他實例是本領(lǐng)域已知的。在本文描述的任何方法的一些實施例中，將哺乳動物細(xì)胞懸浮在約100μL至約25mL(例如，約100μL至約20mL、約100μL至約15mL、約100μL至約10mL、約100μL至約8mL、約100μL至約6mL、約100μL至約4mL、約100μL至約3mL、約100μL至約2.5mL、約100μL至約2.0mL、約100μL至約1.5mL、約100μL至約1.0mL、約100μL至約800μL、約100μL至約600μL、約100μL至約500μL、約100μL至約400μL、約100μL至約300μL、約100μL至約250μL、約100μL至約200μL、約150μL至約25mL、約150μL至約20mL、約150μL至約15mL、約150μL至約10mL、約150μL至約8mL、約150μL至約6mL、約150μL至約4mL、約150μL至約3mL、約150μL至約2.5mL、約150μL至約2.0mL、約150μL至約1.5mL、約150μL至約1.0mL、約150μL至約800μL、約150μL至約600μL、約150μL至約500μL、約150μLand約400μL、約150μL至約300μL、約150μL至約200μL、約250μL至約25mL、約250μL至約20mL、約250μL至約15mL、約250μL至約10mL、約250μL至約8mL、約250μL至約6mL、約250μL至約5mL、約250μL至約4mL、約250μL至約3mL、約250μL至約2.5mL、約250μL至約2mL、約250μL至約1mL、約500μL至約25mL、約500μL至約20mL、約500μL至約15mL、約500μL至約10mL、約500μL至約8mL、約500μL至約6mL、約500μL至約5mL、約500μL至約4mL、約500μL至約3mL、約500μL至約2.5mL、約500μL至約2mL、約500μL至約1mL、約1mL至約25mL、約1mL至約20mL、約1mL至約15mL、約1mL至約10mL、約1mL至約8mL、約1mL至約6mL、約1mL至約5mL、約1mL至約4mL、約1mL至約3mL、約1mL至約2.5mL或約1mL至約2mL)的第一培養(yǎng)基中。熟練的操作者會理解本文描述的第一液體培養(yǎng)基和第二液體培養(yǎng)基可為相同類型的培養(yǎng)基或不同的培養(yǎng)基。微載劑在哺乳動物細(xì)胞是粘附細(xì)胞的一些實例中，第一和/或第二液體培養(yǎng)基包括多個微載劑。例如，孔可含有例如，約1.0g/L至約15.0g/L的終濃度(例如，振蕩燒瓶中約1.0g/L至約2.5g/L、約1.0g/L至約2.0g/L、約1.0g/L至約1.75g/L、約1.0g/L至約1.5g/L、約1.0g/L至約1.25g/L、約2.5g/L至5.0g/L、約5.0g/L至約7.5g/L、約7.5g/L至約10.0g/L、約10.0g/L至約12.5g/L、約12.5g/L至約15.0g/L、約1.0g/L至約5.0g/L、約5.0g/L至約10.0g/L、約10.0g/L至約15.0g/L、約2.5g/L至約3.5g/L、約3.0g/L至約4.0g/L、約4.0g/L至約5.0g/L、約5.0g/L至約6.0g/L、約6.0g/L至約7.0g/L、約7.0g/L至約8.0g/L、約8.0g/L至約9.0g/L、約9.0g/L至約10.0g/L、約10.0g/L至約11.0g/L、約11.0g/L至約12.0g/L、約12.0g/L至約13.0g/L、約13.0g/L至約14.0g/L或約14.0g/L至約15.0g/L的終濃度)的微載劑。在一些實施方案中，多個微載劑可具有約20μm至約1mm(例如，約20μm至約250μm、約100μm至約250μm、約150μm至約250μm、約250μm至500μm、約200μm至約300μm、約750μm至1mm、約200μm至約800μm、約200μm至約500μm或約500μm至約800μm)的平均直徑，其中所述微載劑具有容許性的表面或促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞(例如，本文描述的或本領(lǐng)域已知的任何哺乳動物細(xì)胞)的附著。在一些實例中，微載劑可含有一個或多個孔(例如，具有約10μm至約100μm(例如，約10μm至20μm、約20μm至約30μm、約30μm至約40μm、約50μm至約60μm、約60μm至約70μm、約70μm至約80μm、約80μm至約90μm、約90μm至約100μm、約10μm至約45μm、約45μm至約80μm、約25μM至約35μm、或約30μm)的平均直徑的一個或多個孔)。在一些實施方案中，將多個微載劑的表面和/或多個微載劑中一個或多個孔的表面以促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞附著至微載劑(例如，附著至微載劑的外表面和/或微載劑中的孔的表面)的試劑涂覆。能夠用于促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞的附著的這些試劑的實例包括但不限于明膠、膠原蛋白、聚-L-鳥氨酸、聚苯乙烯和層粘連蛋白。在一些實例中，微載劑具有約0.5m2/g干重至2.0m2/g干重(例如，約0.75m2/g干重至1.25m2/g干重、約1.0m2/g干重至約1.5m2/g干重、約1.25m2/g干重至約1.5m2/g干重、約1.5m2/g干重至約2.0m2/g干重，或約1.1m2/g干重)的平均有效細(xì)胞結(jié)合表面積。在一些實例中，微載劑具有約10mL/g干重至約70mL/g干重(例如，約10mL/g干重至約20mL/g干重、約20mL/g干重至約30mL/g干重、約30mL/g干重至約40mL/g干重、約40mL/g干重至約50mL/g干重、約50mL/g干重至約60mL/g干重、約60mL/g干重至約70mL/g干重、約10mL/g干重至約40mL/g干重、約30mL/g干重至約40mL/g干重、約40mL/g干重至約70mL/g干重，或約40mL/g干重)的平均體積。在一些實施方案中，微載劑的平均相對密度為0.8g/mL至約1.2g/mL(例如，約0.8g/mL至約0.9g/mL、約0.9g/mL至約1.0g/mL、約1.0g/mL至約1.1g/mL、約1.0g/mL、約1.1g/mL至約1.2g/mL、約0.95g/mL至約1.05g/mL，或約1.03g/mL)。在一些實施方案中，微載劑大致為球形或橢球形的形狀。在其他實例中，微載劑具有經(jīng)刮擦的或粗糙的表面，其帶有增加微載劑的外表面總面積的小突起。在一些實施方案中，微載劑具有網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，微載劑是吸濕性的。在一些實例中，微載劑含有纖維素。在一些實施方案中，微載劑具有的外表面和/或微載劑孔具有的表面是帶正電的(例如，由于N,N-二乙基氨基乙基基團(tuán)的存在而帶正電)。在一些實例中，微載劑具有網(wǎng)絡(luò)或網(wǎng)狀或網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)。微載劑可具有約0.5me/g至約2.5me/g(例如，約0.5me/g至約1.5meq/g、約0.75meq/g至約1.25meq/g、約1.1meq/g、約1.5meq/g至約2.5meq/g、約1.5meq/g至約2.0meq/g、約1.8meq/g、約0.5meq/g至約1.0meq/g或約1.0meq/g至約1.5meq/g)的平均電荷密度。在一些情況中，微載劑可含有天然聚合物和/或合成聚合物。合成聚合物的非限定性實例包括聚乙二醇(PEG)、聚環(huán)氧乙烷、聚乙烯亞胺、二甘醇、三甘醇、聚亞烷基二醇、聚氧化烯、聚乙烯醇、多聚磷酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基噁唑啉、聚羥基丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺，聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羥丙基酯、聚丙烯酸羥乙酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚甘油、聚天冬酰胺、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆(poloxamer))、羧酸(例如，丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸和馬來酸)、聚氧乙烯類、聚環(huán)氧乙烷、不飽和烯屬單二羧酸、聚乳酸(PLA)、聚環(huán)氧丙烷、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚(乙基乙烯)、聚丁二烯、聚乙醇酸、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基丁基醚、聚苯乙烯、聚環(huán)戊二烯基甲基降冰片烯、聚乙烯丙烯、聚乙基乙烯、聚異丁烯、聚硅氧烷、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸異丁酯、丙烯酸2-乙酯、丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸酯類(例如，甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丁酯和甲基丙烯酸異丁酯)、丙烯腈類、甲基丙烯腈、乙烯基類(例如，乙酸乙烯酯、叔碳酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、乙烯基甲酰胺、乙烯基乙酰胺、乙烯基吡啶和乙烯基咪唑)、氨基烷類(例如，氨基烷基丙烯酸酯、氨基烷基甲基丙烯酸酯和氨基烷基(甲基)丙烯酰胺)、苯乙烯、聚亞烷基二醇、多堿氧化物和乳酸。天然聚合物的非限定性實例包括纖維素、卵磷脂和玻尿酸。微載劑可以含有不同聚合物以相同或不同比例混合的混合物(例如，本文描述的或本領(lǐng)域已知的一種或多種聚合物的任意組合)。本文描述的任何微載劑可以含有核心和外層，所述核心含有一種或多種聚合物(例如，本文描述的或本領(lǐng)域已知的任何聚合物)，所述外層含有一種或多種不同的聚合物(例如，本文描述的或本領(lǐng)域已知的任何聚合物)。能夠在本文描述的任何方法中使用的非限定性示例性微載劑包括CytoPoreTM1和CytoPoreTM2(可從GEHealthcare,LifeSciences,Piscataway,NewJersey獲得)。能夠在本文描述的任何方法中使用的微載劑的其他實例是公眾可以獲得的和本領(lǐng)域已知的。多孔板多種多孔板是本領(lǐng)域已知的并且可用于本文描述的任何方法。例如，多孔板可為2孔板、4孔板、6孔板、8孔板、9孔板、10孔板、12孔板、15孔板、18孔板、20孔板、24孔板、36孔板、48孔板、60孔板、72孔板，或96孔板。在一些實例中，孔具有約0.3mL至約25mL(例如，約0.3mL至約24mL、約0.3mL至約22mL、約0.3mL至約20mL、約0.3mL至約18mL、約0.3mL至約16mL、約0.3mL至約14mL、約0.3mL至約12mL、約0.3mL至約10mL、約0.3mL至約8mL、約0.3mL至約6mL、約0.3mL至約5mL、約0.3mL至約4mL、約0.3mL至約3mL、約0.3mL至約2mL、約0.3mL至約1mL、約0.5mL至約25mL、約0.5mL至約24mL、約0.5mL至約22mL、約0.5mL至約0.5mL至約20mL、約0.5mL至約18mL、約0.5mL至約16mL、約0.5mL至約14mL、約0.5mL至約12mL、約0.5mL至約10mL、約0.5mL至約8mL、約0.5mL至約6mL、約0.5mL至約5mL、約0.5mL至約4mL、約0.5mL至約3mL、約0.5mL至約2mL、約0.5mL至約1mL、約1mL至約25mL、約1mL至約24mL、約1mL至約22mL、約1mL至約20mL、約1mL至約18mL、約1mL至約16mL、約1mL至約14mL、約1mL至約12mL、約1mL至約10mL、約1mL至約8mL、約1mL至約7mL、約1mL至約6mL、約1mL至約5mL、約1mL至約4mL、約1mL至約3.5mL、約1mL至約3mL、約1mL至約2.5mL、約1mL至約2mL、約1mL至約1.5mL、約1.5mL至約25mL、約1.5mL至約24mL、約1.5mL至約22mL、約1.5mL至約20mL、約1.5mL至約18mL、約1.5mL至約16mL、約1.5mL至約14mL、約1.5mL至約12mL、約1.5mL至約10mL、約1.5mL至約8mL、約1.5mL至約6mL、約1.5mL至約5mL、約1.5mL至約4mL、約1.5mL至約3.5mL、約1.5mL至約3mL、約1.5mL至約2.5mL、約1.5mL至約2.0mL、約2mL至約25mL、約2mL至約24mL、約2mL至約22mL、約2mL至約20mL、約2mL至約18mL、約2mL至約16mL、約2mL至約14mL、約2mL至約12mL、約2mL至約10mL、約2mL至約8mL、約2mL至約6mL或約2mL至約5mL)的體積(內(nèi)部體積)。在一些實例中，多孔板是深孔板。例如，深孔板中的孔的內(nèi)部高度可為1cm至約12cm(例如，約1cm至約11cm、約1cm至約10cm、約1cm至約9cm、約1cm至約8cm、約1cm至約7cm、約1cm至約6cm、約1cm至約5cm、約1cm至約4cm、約1cm至約3cm、約1.2cm至約12cm、約1.2cm至約11cm、約1.2cm至約10cm、約1.2cm至約9cm、約1.2cm至約8cm、約1.2cm至約7cm、約1.2cm至約6cm、約1.2cm至約5cm、約1.2cm至約4cm、約1.2cm至約3cm、約1.5cm至約11cm、約1.5cm至約10cm、約1.5cm至約9cm、約1.5cm至約8cm、約1.5cm至約7cm、約1.5cm至約6cm、約1.5cm至約5cm、約1.5cm至約4cm、約1.5cm至約3cm、約2cm至約12cm、約2cm至約11cm、約2cm至約10cm、約2cm至約9cm、約2cm至約8cm、約2cm至約7cm、約2cm至約6cm、約2cm至約5cm、約2cm至約4cm、約2cm至約3cm、約2.5cm至約12cm、約2.5cm至約11cm、約2.5cm至約10cm、約2.5cm至約9cm、約2.5cm至約8cm、約2.5cm至約7cm、約2.5cm至約6cm、約2.5cm至約5cm、約2.5cm至約4cm、約3cm至約12cm、約3cm至約11cm、約3cm至約10cm、約3cm至約9cm、約3cm至約8cm、約3cm至約7cm、約3cm至約6cm、約3cm至約5cm、約4cm至約12cm、約4cm至約11cm、約4cm至約10cm、約4cm至約9cm、約4cm至約8cm、約4cm至約7cm、約4cm至約6cm、約5cm至約12cm、約5cm至約11cm、約5cm至約10cm、約5cm至約9cm、約5cm至約8cm或約5cm至約7cm)。在一些實例中，孔(例如，深孔多孔板中的孔)可具有平底(也稱為方底)、圓底(也稱為半球底)、錐形底或金字塔形底。在一些實施方案中，本文描述的任何孔的直徑可為約4.0mm至約50mm(例如，約4.0mm至約45mm、約4.0mm至約40mm、約4.0mm至約35mm、約4.0mm至約30mm、約4.0mm至約25mm、約4.0mm至約20mm、約4.0mm至約15mm、約4.0mm至約10mm、約6.0mm至約50mm、約6.0mm至約45mm、約6.0mm至約40mm、約6.0mm至約35mm、約6.0mm至約30mm、約6.0mm至約25mm、約6.0mm至約25mm、約6.0mm至約20mm、約6.0mm至約15mm、約6.0mm至約10mm、約8mm至約50mm、約8mm至約45mm、約8mm至約40mm、約8mm至約35mm、約8mm至約30mm、約8mm至約25mm、約8mm至約20mm、約8mm至約15mm、約10mm至約50mm、約10mm至約45mm、約10mm至約40mm、約10mm至約35mm、約10mm至約30mm、約10mm至約25mm、約10mm至約20mm、約15mm至約50mm、約15mm至約45mm、約15mm至約40mm、約15mm至約35mm、約15mm至約30mm、約15mm至約25mm或約15mm至約20mm)。在一些實例中，將多孔板密封(例如，用透氣性拋棄式膜或透氣性硅酮層密封)。用于密封多孔板的材料的非限制性實例在實施例中描述。用于密封多孔板的其他材料是本領(lǐng)域已知的?？椎膬?nèi)表面可具有至少一種涂層(例如，明膠、膠原蛋白、聚-L-鳥氨酸、聚苯乙烯和層粘連蛋白涂層的至少一種)。多孔板的其他實例(例如，不同形狀和尺寸的孔)和孔的內(nèi)表面涂層的其他實例是本領(lǐng)域已知的并且可用于本發(fā)明中。攪拌本發(fā)明描述的方法需要旋轉(zhuǎn)攪拌含有哺乳動物細(xì)胞和第一和/或第二液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)物。旋轉(zhuǎn)攪拌可以約300RPM至約600RPM(例如，約300RPM至約580RPM、約300RPM至約560RPM、約300RPM至約540RPM、約300RPM至約520RPM、約300RPM至約500RPM、約300RPM至約480RPM、約300RPM至約460RPM、約300RPM至約440RPM、約300RPM至約420RPM、約300RPM至約400RPM、約300RPM至約380RPM、約300RPM至約360RPM、約320RPM至約600RPM、約320RPM至約580RPM、約320RPM至約560RPM、約320RPM至約540RPM、約320RPM至約520RPM、約320RPM至約500RPM、約320RPM至約480RPM、約320RPM至約460RPM、約320RPM至約440RPM、約320RPM至約420RPM、約320RPM至約400RPM、約320RPM至約380RPM、約330RPM至約600RPM、約330RPM至約580RPM、約330RPM至約560RPM、約330RPM至約540RPM、約330RPM至約520RPM、約330RPM至約500RPM、約330RPM至約480RPM、約330RPM至約460RPM、約330RPM至約440RPM、約330RPM至約420RPM、約330RPM至約400RPM、約330RPM至約380RPM、約340RPM至約600RPM、約340RPM至約580RPM、約340RPM至約560RPM、約340RPM至約540RPM、約340RPM至約520RPM、約340RPM至約500RPM、約340RPM至約480RPM、約340RPM至約460RPM、約340RPM至約440RPM、約340RPM至約420RPM、約340RPM至約400RPM、約360RPM至約600RPM、約360RPM至約580RPM、約360RPM至約560RPM、約360RPM至約540RPM、約360RPM至約520RPM、約360RPM至約500RPM、約360RPM至約480RPM、約360RPM至約460RPM、約360RPM至約440RPM、約360RPM至約420RPM、約380RPM至約600RPM、約380RPM至約580RPM、約380RPM至約560RPM、約380RPM至約540RPM、約380RPM至約520RPM、約380RPM至約500RPM、約380RPM至約480RPM、約380RPM至約460RPM、約380RPM至約440RPM、約400RPM至約600RPM、約400RPM至約580RPM、約400RPM至約560RPM、約400RPM至約540RPM、約400RPM至約520RPM、約400RPM至約500RPM、約400RPM至約480RPM或約400RPM至約460RPM)的頻率發(fā)生(例如，在培養(yǎng)箱中，如具有約3mm至約50mm的拋擲(軌道)直徑的搖動培養(yǎng)箱)。如本領(lǐng)域所能夠理解的，攪拌的水平(例如，RPM速度)可依賴于孔的大小和形狀(例如，孔的直徑、形狀和高度中的一項或多項)以及用于進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)箱的拋擲(軌道)的直徑而變化。例如，較小的拋擲(軌道)直徑可能需要更高水平的攪拌(例如，較高的RPM速度)，而較大的拋擲(軌道)直徑可能需要較低水平的攪拌(例如，較低的RPM速度)來達(dá)到類似水平的流體剪切力和溶解O2濃度。在另一實例中，具有較大直徑的孔可能需要較低的RPM速度，而具有較小直徑的孔可能需要較高的RPM速度來達(dá)到類似水平的流體剪切力和溶解O2濃度。在一些實施方案中，使用具有約3mm至約50mm(例如，約3mm至約25mm或約25mm至約50mm)的拋擲(軌道)直徑的搖動管型培養(yǎng)箱并以約320RPM至約500RPM(例如，約320RPM至約480RPM、約320RPM至約460RPM、約320RPM至約400RPM、約320RPM至約380RPM、約320RPM至約360RPM、約320RPM至約350RPM、約320RPM至約340RPM、約330RPM至約500RPM、約330RPM至約480RPM、約330RPM至約460RPM、約330RPM至約440RPM、約330RPM至約420RPM、約330RPM至約400RPM、約330RPM至約380RPM、約330RPM至約370RPM、約330RPM至約360RPM、約330RPM至約350RPM、約340RPM至約500RPM、約340RPM至約480RPM,340RPM至約460RPM、約340RPM至約440RPM、約340RPM至約420RPM、約340RPM至約400RPM、約340RPM至約380RPM、約340RPM至約370RPM、約340RPM至約360RPM、約350RPM至約500RPM、約350RPM至約480RPM、約350RPM至約460RPM、約350RPM至約440RPM、約350RPM至約420RPM、約350RPM至約400RPM、約350RPM至約390RPM、約350RPM至約380RPM、約350RPM至約370RPM、約360RPM至約500RPM、約360RPM至約480RPM、約360RPM至約460RPM、約360RPM至約440RPM、約360RPM至約420RPM、約360RPM至約400RPM、約360RPM至約380RPM或約400RPM至約500RPM)的攪拌進(jìn)行培養(yǎng)。例如，可使用旋轉(zhuǎn)圓形搖動或旋轉(zhuǎn)橢圓形搖動進(jìn)行旋轉(zhuǎn)攪拌?？蛇B續(xù)地或周期性地進(jìn)行攪拌。多孔板的旋轉(zhuǎn)攪拌能夠產(chǎn)生與含有占據(jù)約10％至約40％(例如，約10％至約35％、約10％至約30％、約10％至約25％、約10％至約20％、約10％至約15％，約15％至約40％、約15％至約35％、約15％至約30％、約15％至約25％、約15％至約20％、約20％至約40％、約20％至約35％、約20％至約30％、約20％至約25％、約25％至約40％、約25％至約35％、約25％至約30％、約30％至約40％、約30％至約35％或約35％至約40％)孔體積的液體培養(yǎng)基的、具有約6.0mm至約35mm(例如，約6.0mm至約30mm、約6.0mm至約25mm、約6.0mm至約20mm、約6.0mm至約15mm、約10mm至約35mm、約10mm至約30mm、約10mm至約25mm、約10mm至約20mm、約15mm至約35mm、約15mm至約30mm、約15mm至約25mm、約20mm至約35mm、約20mm至約30mm或約25mm至約35mm)的直徑和約40mm至約50mm(例如，約40mm至約45mm或約45mm至約50mm)的高度的方底孔中在約31℃至約40℃的溫度并以約320RPM至約450RPM(例如，約320RPM至約440RPM、約320RPM至約430RPM、約320RPM至約420RPM、約320RPM至約410RPM、約320RPM至約400RPM、約320RPM至約390RPM、約320RPM至約380RPM、約320RPM至約370RPM、約320RPM至約360RPM、約320RPM至約350RPM、約320RPM至約340RPM、約320RPM至約330RPM、約330RPM至約450RPM、約330RPM至約440RPM、約330RPM至約430RPM、約330RPM至約420RPM、約330RPM至約410RPM、約330RPM至約400RPM、約330RPM至約390RPM、約330RPM至約380RPM、約330RPM至約370RPM、約330RPM至約360RPM、約330RPM至約350RPM、約330RPM至約340RPM、約340RPM至約450RPM、約340RPM至約440RPM、約340RPM至約430RPM、約340RPM至約420RPM、約340RPM至約410RPM、約340RPM至約400RPM、約340RPM至約390RPM、約340RPM至約380RPM、約340RPM至約370RPM、約340RPM至約360RPM、約340RPM至約350RPM、約350RPM至約450RPM、約350RPM至約440RPM、約350RPM至約430RPM、約350RPM至約420RPM、約350RPM至約410RPM、約350RPM至約400RPM、約350RPM至約390RPM、約350RPM至約380RPM、約350RPM至約370RPM、約350RPM至約360RPM、約360RPM至約450RPM、約360RPM至約440RPM、約360RPM至約430RPM、約360RPM至約420RPM、約360RPM至約410RPM、約360RPM至約400RPM、約360RPM至約390RPM、約360RPM至約380RPM、約360RPM至約370RPM、約370RPM至約450RPM、約370RPM至約430RPM、約370RPM至約410RPM、約370RPM至約390RPM、約390RPM至約450RPM、約390RPM至約430RPM、約390RPM至約410RPM、約410RPM至約450RPM、約410RPM至約430RPM或約430RPM至約450RPM)的頻率攪拌進(jìn)行溫育所實現(xiàn)的基本上相同的流體剪切力和溶解氧(O2)濃度。旋轉(zhuǎn)攪拌可使用加濕氣氛的受控培養(yǎng)箱(例如，大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的濕度，或100％的濕度)進(jìn)行，所述培養(yǎng)箱帶有為含有哺乳動物細(xì)胞和液體培養(yǎng)基(例如，第一和/或第二液體培養(yǎng)基)的一個或多個多孔板提供攪拌的機(jī)械裝置。溫度本文描述的培養(yǎng)方法可在約31℃至約40℃的溫度進(jìn)行。熟練的操作人員會理解可在培養(yǎng)方法中的特定時間點改變溫度，例如，每小時或每天。例如，可在用哺乳動物細(xì)胞對孔進(jìn)行初始接種之后約一天、兩天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十四天、十五天、十六天、是七天、十八天、十九天或二十天或更久時改變或變換(例如，提高或降低)溫度。例如，可向上變換溫度(例如，高至或大約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，或高至或大約20℃的變化)。例如，可向下變換溫度(例如，高至或大約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，或高至或大約20℃的變化)。培養(yǎng)基的去除和替換本文描述的方法包括從孔去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基(例如，含有任何濃度的哺乳動物細(xì)胞，例如，基本上不含細(xì)胞的第一體積的第一液體培養(yǎng)基)，向第一液體培養(yǎng)基添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基。去除和添加可以同時或順序或以二者的組合進(jìn)行。另外，去除和添加可連續(xù)進(jìn)行(例如，以在任意給定的時間段內(nèi)(例如，在24小時期間，在約1小時至約24小時的漸增時間段內(nèi)，或在大于24小時的漸增時間段內(nèi))或周期性地(例如，每三天一次、每隔一天、每天一次、每天兩次、每天三次、每天四次或每天五次)或其任意組合去除和替換孔體積或第一液體培養(yǎng)基體積的0.1％至700％(例如，1％至600％、1％至500％、1％至400％、1％至350％、1％至300％、1％至250％、1％至100％、100％至200％、5％至150％、10％至50％、15％至40％、8％至80％或4％至30％)的體積的速率)。在周期性進(jìn)行的情況下，去除或替換的體積(例如，在約24小時期間，在約1小時至約24小時的漸增時間段內(nèi)，或在大于24小時的漸增時間段內(nèi))可為例如孔體積或第一液體培養(yǎng)基體積的0.1％至700％(例如，1％至700％、1％至600％、1％至500％、1％至400％、1％至300％、1％至200％、1％至100％、100％至200％、5％至150％、10％至50％、15％至40％、8％至80％或4％至30％)的體積。在一些情況下，可在整個或部分培養(yǎng)時期內(nèi)在每24小時的時期內(nèi)(或，可替換地，在約1小時至約24小時的漸增時間段內(nèi)，或在大于24小時的漸增時間段內(nèi))使去除的第一體積的第一液體培養(yǎng)基和添加的第二體積的第二液體培養(yǎng)基保持大致相同。如本領(lǐng)域已知的，去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基的速率(體積/單位時間)和添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基的速率(體積/單位時間)可有所變化。去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基的速率(體積/單位時間)和添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基的速率(體積/單位時間)可大致相同或可不同?？商鎿Q地，在培養(yǎng)期間在每24小時的時期內(nèi)(或，可替換地，在約1小時至約24小時的漸增時間段內(nèi)，或在大于24小時的漸增時間段內(nèi))可改變(例如，逐漸增加)去除和添加的體積。包括逐漸增加體積的方法的非限定性實例在本文描述。例如，在培養(yǎng)期間在每24小時的時期內(nèi)(或，可替換地，在約1小時至24小時以上的漸增時間段內(nèi)，或在大于24小時的漸增時間段內(nèi))去除的第一液體培養(yǎng)基的體積和添加的第二液體培養(yǎng)基的體積可從孔體積或第一液體培養(yǎng)基體積的0.5％至約30％的體積增加(例如，逐漸地或通過交錯增量)至孔體積或第一液體培養(yǎng)基體積的約30％至約200％的體積。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，將多孔板培養(yǎng)超過7天的一段時間，并且在溫育的第1至3天中的每24小時的時間段內(nèi)，去除的第一液體培養(yǎng)基的第一體積和添加的第二培養(yǎng)基的第二體積是第一液體培養(yǎng)基的體積的約30％至約50％；在培養(yǎng)的第4至6天中，去除的第一液體培養(yǎng)基的第一體積和添加的第二培養(yǎng)基的第二體積是第一液體培養(yǎng)基的體積的約30％至約50％或約40％至約70％；并且從培養(yǎng)的第7天起的每24小時的時間段內(nèi)，去除的第一液體培養(yǎng)基的第一體積和添加的第二培養(yǎng)基的第二體積是第一液體培養(yǎng)基的體積的約90％至約150％。在其他實例中，在大約最初的24-48小時的時間段之后，在每24小時的時間段內(nèi)，去除的第一液體培養(yǎng)基的第一體積和添加的第二培養(yǎng)基的第二體積是第一液體培養(yǎng)基的體積的約30％至約300％(例如，約30％至約280％、約30％至約260％、約30％至約240％、約30％至約220％、約30％至約200％、約30％至約180％、約30％至約160％、約30％至約150％、約30％至約140％、約30％至約120％、約30％至約100％、約30％至約80％、約30％至約60％、約30％至約50％、約40％至約300％、約40％至約280％、約40％至約260％、約40％至約240％、約40％至約220％、約40％至約200％、約40％至約180％、約40％至約160％、約40％至約140％、約40％至約120％、約40％至約100％、約40％至約80％、約40％至約60％、約50％至約300％、約50％至約280％、約50％至約260％、約50％至約240％、約50％至約220％、約50％至約200％、約50％至約180％、約50％至約160％、約50％至約140％、約50％至約120％、約50％至約100％或50％至約80％)。熟練的操作人員會理解第一液體培養(yǎng)基和第二液體培養(yǎng)基可使用相同類型的培養(yǎng)基。在其他情況中，第一液體培養(yǎng)基和第二液體培養(yǎng)基可為不同的。例如，可通過離心(例如，慢速旋翼式離心(swingingbucketcentrifugation))多孔板，并將第一體積的基本上不含細(xì)胞的第一液體培養(yǎng)基從上清液去除來去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基?？商鎿Q地或者此外，可通過使第一體積的第一液體培養(yǎng)基滲透或重力流過無菌膜來去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基，所述無菌膜具有排除哺乳動物細(xì)胞的分子量截留值?？商鎿Q地或者此外，第一液體培養(yǎng)基可通過在去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基之前停止攪拌至少30秒的時間段(例如，至少一分鐘、至少兩分鐘、至少三分鐘、至少四分鐘或至少五分鐘)來去除?？墒謩拥?例如，通過從孔中抽吸或移液掉第一體積的第一液體培養(yǎng)基)或以自動化的方式(例如，使用自動化設(shè)備或使用任何本文描述的多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng))去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基。例如，可通過灌注泵向第一液體培養(yǎng)基添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基。可手動地(例如，通過將第二體積的第二液體培養(yǎng)基直接移液到第一液體培養(yǎng)基上)或以自動化的方式(例如，使用自動化設(shè)備或使用任何本文描述的多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng))將第二液體培養(yǎng)基添加至第一液體培養(yǎng)基。在一些實例中，使用本文描述的任何多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng)可去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基并且可向第一液體培養(yǎng)基添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基。在一些情況中，去除第一體積的第一液體培養(yǎng)基(例如，基本上不含哺乳動物細(xì)胞的第一體積的第一液體培養(yǎng)基)和向第一液體培養(yǎng)基添加第二體積的第二液體培養(yǎng)基不會發(fā)生在用哺乳動物細(xì)胞接種孔的至少1小時之內(nèi)(例如，2小時之內(nèi)、3小時之內(nèi)、4小時之內(nèi)、5小時之內(nèi)、6小時之內(nèi)、7小時之內(nèi)、8小時之內(nèi)、9小時之內(nèi)、10小時之內(nèi)、12小時之內(nèi)、14小時之內(nèi)、16小時之內(nèi)、18小時之內(nèi)、24小時之內(nèi)、36小時之內(nèi)、48小時之內(nèi)、72小時之內(nèi)、96小時之內(nèi)或96小時之后)。一些實施方案進(jìn)一步包括向多個孔中的每個周期性地添加額外體積的第二液體培養(yǎng)基，從而抵銷因為蒸發(fā)所致的第一液體培養(yǎng)基在體積上的任何減少。例如，可向孔添加這樣的額外體積的第二液體培養(yǎng)基，例如，至少每24小時一次，至少每48小時一次、至少每72小時一次或至少每96小時一次?？墒謩拥鼗蛞宰詣踊姆绞?例如，使用自動化設(shè)備或使用任何本文描述的多孔細(xì)胞培養(yǎng)板系統(tǒng))添加這種額外體積的第二液體培養(yǎng)基。CO2本文描述的方法可以進(jìn)一步包括在含有至多或約15％CO2(例如，至多或大約14％CO2、12％CO2、10％CO2、8％CO2、6％CO2、5％CO2、4％CO2、3％CO2、2％CO2或至多或大約1％CO2)的氣氛中培養(yǎng)多孔板。另外，本文描述的任何方法可包括在加濕氣氛(例如，至少或大約20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或至少或大約95％濕度，或大約100％濕度)中培養(yǎng)多孔板。示例性設(shè)備能夠用于進(jìn)行本文描述的培養(yǎng)方法的設(shè)備的非限制性實例包括：AppropriateTechnicalResources(Maryland,USA)分銷的INFORSMultiron搖動培養(yǎng)箱(INFORS；Basel,Switzerland)，和Kuhner搖動培養(yǎng)箱(KuhnerAG；Basel,Switzerland)。能夠用于進(jìn)行培養(yǎng)方法的設(shè)備的非限制性實例包括具有約3mm至約50mm(例如，約1mm至約25mm或約25mm至約50mm)的拋擲(軌道)直徑的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱。搖動培養(yǎng)箱和滾動培養(yǎng)箱的其他實例是本領(lǐng)域已知的。溶解O2和液體剪切力還提供包括在梯度灌注方法中在如下條件下培養(yǎng)懸浮在置于多孔板孔內(nèi)的液體培養(yǎng)基中的哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)方法，所述條件在所述培養(yǎng)基中生成與含有占據(jù)具有約6.0mm至約35mm(例如，約6.0mm至約30mm、約6.0mm至約25mm、約6.0mm至約20mm、約6.0mm至約15mm、約10mm至約35mm、約10mm至約30mm、約10mm至約25mm、約10mm至約20mm、約15mm至約35mm、約15mm至約30mm、約15mm至約25mm、約20mm至約35mm、約20mm至約30mm或約25mm至約35mm)的直徑和約40mm至約50mm(例如，約40mm至約45mm或約45mm至約50mm)的高度的方底孔體積的約10％至約40％(例如，約10％至約35％、約10％至約30％、約10％至約25％、約10％至約20％、約10％至約15％、約15％至約40％、約15％至約35％、約15％至約30％、約15％至約25％、約15％至約20％、約20％至約40％、約20％至約35％、約20％至約30％、約20％至約25％、約25％至約40％、約25％至約35％、約25％至約30％、約30％至約40％、約30％至約35％或約35％至約40％)的液體培養(yǎng)基中在約31℃至約40℃的溫度并以約320RPM至約450RPM(例如，約320RPM至約440RPM、約320RPM至約430RPM、約320RPM至約420RPM、約320RPM至約410RPM、約320RPM至約400RPM、約320RPM至約390RPM、約320RPM至約380RPM、約320RPM至約370RPM、約320RPM至約360RPM、約320RPM至約350RPM、約320RPM至約340RPM、約320RPM至約330RPM、約330RPM至約450RPM、約330RPM至約440RPM、約330RPM至約430RPM、約330RPM至約420RPM、約330RPM至約410RPM、約330RPM至約400RPM、約330RPM至約390RPM、約330RPM至約380RPM、約330RPM至約370RPM、約330RPM至約360RPM、約330RPM至約350RPM、約330RPM至約340RPM、約340RPM至約450RPM、約340RPM至約440RPM、約340RPM至約430RPM、約340RPM至約420RPM、約340RPM至約410RPM、約340RPM至約400RPM、約340RPM至約390RPM、約340RPM至約380RPM、約340RPM至約370RPM、約340RPM至約360RPM、約340RPM至約350RPM、約350RPM至約450RPM、約350RPM至約440RPM、約350RPM至約430RPM、約350RPM至約420RPM、約350RPM至約410RPM、約350RPM至約400RPM、約350RPM至約390RPM、約350RPM至約380RPM、約350RPM至約370RPM、約350RPM至約360RPM、約360RPM至約450RPM、約360RPM至約440RPM、約360RPM至約430RPM、約360RPM至約420RPM、約360RPM至約410RPM、約360RPM至約400RPM、約360RPM至約390RPM、約360RPM至約380RPM、約360RPM至約370RPM、約370RPM至約450RPM、約370RPM至約430RPM、約370RPM至約410RPM、約370RPM至約390RPM、約390RPM至約450RPM、約390RPM至約430RPM、約390RPM至約410RPM、約410RPM至約450RPM、約410RPM至約430RPM或約430RPM至約450RPM)的頻率攪拌進(jìn)行溫育所實現(xiàn)的流體剪切力和溶解氧(O2)濃度相同(或基本上相同)的流體剪切力和溶解氧(O2)濃度。如本領(lǐng)域已知的，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)以實現(xiàn)特定溶解O2濃度和特定流體剪切力。能夠被調(diào)節(jié)的這些參數(shù)的非限定性實例包括：孔體積、液體培養(yǎng)基的體積、孔的形狀(例如，直徑、高度和孔底部形狀中的一項或多項)、攪拌類型(例如，旋轉(zhuǎn)圓形攪拌和/或旋轉(zhuǎn)橢圓形攪拌)、攪拌的頻率、培養(yǎng)基類型、孔的內(nèi)部涂層和液體培養(yǎng)基的溫度。這些培養(yǎng)參數(shù)的其他實例是本領(lǐng)域已知的。本文描述的或本領(lǐng)域已知的培養(yǎng)參數(shù)的任何組合可以任何方式組合以在培養(yǎng)基中實現(xiàn)與占據(jù)具有約6.0mm至約35mm的半徑和約40mm和約50mm的高度的平底孔體積的約10％至約40％(例如，約15％至約25％)的培養(yǎng)基中在約31℃至約40℃的溫度并以約320RPM至約450RPM(例如，約320RPM至約360RPM)的頻率攪拌進(jìn)行培養(yǎng)所實現(xiàn)的流體剪切力和溶解氧(O2)濃度相同(或基本上相同)的流體剪切力和溶解氧(O2)濃度。液體培養(yǎng)基中的溶解O2水平可使用多種不同的方法檢測。例如，溶解O2可使用溶解O2電極或探測器(例如，可從EutechInstrumentsWD-35201-80DissolvedOxygenProbe、RosemountAnalytical499SeriesDissolvedOxygen/OzoneSensor、ExtechDO705DissolvedOxygenElectrode獲得的O2探測器和電極)測量。校準(zhǔn)和使用O2探測器和電極的方法可使用制造商的說明書進(jìn)行。液體培養(yǎng)基中的流體剪切力可使用本領(lǐng)域已知的方法計算。描述液體培養(yǎng)基中液體剪切力計算的合適教科書的非限定性實例描述在FluidMechanics,RobertA.Granger,1995,DoverPublications,Inc.,Mineola,NY，和FundamentalsofFluidMechanics,BruceR.Munson等,JohnWiley&Sons,Inc.,2009中。產(chǎn)生重組蛋白的方法本文還提供產(chǎn)生重組蛋白的方法，其包括培養(yǎng)使用本文描述的方法能夠產(chǎn)生重組蛋白的細(xì)胞。在實施所述方法之后，可以從哺乳動物細(xì)胞和/或從第一或第二培養(yǎng)基回收所述重組蛋白。在一些實施方案中，在培養(yǎng)方法過程中任何給定的時間點從所述第一和/或第二液體培養(yǎng)基回收所述重組蛋白(例如，在培養(yǎng)的第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100天或在超過100天的一天或數(shù)天中從第一和/或第二液體培養(yǎng)基回收)。這些方法的一些實施方案進(jìn)一步包括添加某個體積的第三培養(yǎng)基或某個體積的第四液體培養(yǎng)基，但是在每種情況中，孔中的液體培養(yǎng)基的總體積應(yīng)該大致等于或小于第一液體培養(yǎng)基體積。熟練的操作人員會理解可以任何組合使用多種培養(yǎng)參數(shù)(例如，本文描述的多孔板、孔、體積、替換培養(yǎng)物體積的速率或頻率、攪拌頻率、溫度、培養(yǎng)基和CO2濃度)中的任何參數(shù)來進(jìn)行這些方法。另外，本文描述的或本領(lǐng)域已知的任何哺乳動物細(xì)胞可用于產(chǎn)生重組蛋白?？墒褂梅肿由飳W(xué)和分子遺傳學(xué)中已知的多種多樣的方法將編碼重組蛋白的核酸引入哺乳動物細(xì)胞。非限定性實例包括轉(zhuǎn)染(例如，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)、轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如，慢病毒、腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染)和電穿孔。在一些情況中，編碼重組蛋白的核酸不是穩(wěn)定地整合在哺乳動物細(xì)胞的染色體中的(瞬時轉(zhuǎn)染)；而在其他方法中核酸是整合的。可替換地或者此外，編碼重組蛋白的核酸可存在于質(zhì)粒和/或哺乳動物人工染色體(例如，人的人工染色體)中。可替換地或者此外，可使用病毒載體(例如，慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體)將核酸引入細(xì)胞中?？蓪⒑怂崤c啟動子序列(例如，強(qiáng)啟動子，如β-肌動蛋白啟動子和CMV啟動子或誘導(dǎo)型啟動子)可操作地連接。如有需要，含有核酸的載體可還含有選擇標(biāo)記(例如，為哺乳動物細(xì)胞賦予潮霉素、嘌呤霉素或新霉素抗性的基因)。在一些情況中，重組蛋白是分泌蛋白并且由哺乳動物細(xì)胞釋放至胞外培養(yǎng)基(例如，第一和/或第二液體培養(yǎng)基)中。例如，編碼可溶性重組蛋白的核酸序列可含有編碼在重組蛋白的N或C末端的分泌信號肽的序列，其通過哺乳動物細(xì)胞中存在的酶被切割，并且隨后釋放至胞外培養(yǎng)基(例如，第一和/或第二液體培養(yǎng)基)中。例如，這樣的分泌的重組蛋白可為分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生長因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白。在其他情況中，所述重組蛋白是不被分泌的可溶性蛋白，并且所述重組蛋白從哺乳動物細(xì)胞內(nèi)回收。例如，不被分泌的重組蛋白可為免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白。能夠通過本文提供的方法產(chǎn)生的重組蛋白的非限定性實例包括免疫球蛋白(包括輕鏈和重鏈免疫球蛋白、抗體或抗體片段(例如，本文描述的任何抗體片段)、酶(例如，半乳糖苷酶(α-半乳糖苷酶)、Myozyme或Cerezyme)、蛋白質(zhì)(例如，生長因子、人促紅細(xì)胞生成素、腫瘤壞死因子(TNF)或干擾素α或β)、工程化蛋白或免疫原性或抗原性蛋白或蛋白片段(例如用于在疫苗中使用的蛋白質(zhì)))。在一些實施方案中，重組蛋白是工程化抗原結(jié)合多肽，其含有至少一個多功能重組蛋白支架(參見，例如，在Gebauer等，CurrentOpin.Chem.Biol.13:245-255,2009；和美國專利申請公開號2012/0164066(通過提述以其整體并入本文)中描述的重組抗原結(jié)合蛋白)。作為抗體的重組蛋白的非限定性實例包括：帕尼單抗(panitumumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、阿巴伏單抗(abagovomab)、阿昔單抗(abciximab)、阿托續(xù)單抗(actoxumab)、阿達(dá)木單抗(adalimumab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿非莫單抗(afelimomab)、阿托珠單抗(afutuzumab)、阿珠單抗(alacizumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、alirocumab、阿妥莫單抗(altumomab)、阿麥妥昔單抗(amatuximab)、馬安莫單抗(anatumomab)、阿泊珠單抗(apolizumab)、阿替奴單抗(atinumab)、托珠單抗(tocilizumab)、巴利昔單抗(basilizimab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝利單抗(belimumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、比西單抗(biciromab)、卡那單抗(canakinumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、達(dá)珠單抗(daclizumab)、迪諾賽單抗(densumab)、艾庫組單抗(eculizumab)、依決洛單抗(edrecolomab)、依法利珠單抗(efalizumab)、依芬古單抗(efungumab)、厄妥索單抗(ertumaxomab)、達(dá)珠單抗(etaracizumab)、戈利木單抗(golimumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、他珠單抗(natalizumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、培妥珠單抗(pertuzumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、托珠單抗(tocilizumab)和曲妥單抗(trastuzumab)。能夠通過本領(lǐng)域描述的方法產(chǎn)生的治療性抗體的其他實例是本領(lǐng)域已知的。能夠通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的重組蛋白的其他非限定性實例包括：阿葡糖苷酶阿爾法(alglucosidasealfa)、拉羅尼酶(laronidase)、阿貝西普(abatacept)、加硫酶(galsulfase)、促黃體素α(lutropinalfa)、抗血友病因子(antihemophilicfactor)、阿加糖酶-β(agalsidasebeta)、干擾素β-1a(interferonbeta-1a)、阿法達(dá)貝泊汀(darbepoetinalfa)、替奈普酶(tenecteplase)、伊納西普(etanercept)、凝血因子IX(coagulationfactorIX)、卵泡雌激素(folliclestimulatinghormone)、干擾素β-1a(interferonbeta-1a)、伊米苷酶(imiglucerase)、阿法鏈道酶(dornasealfa)、阿法依泊汀(epoetinalfa)和阿替普酶(alteplase)。分泌的可溶性重組蛋白可通過將液體培養(yǎng)基從哺乳動物細(xì)胞去除或以其他方式在物理上分開而從液體培養(yǎng)基(例如，第一和/或第二液體培養(yǎng)基)回收。用于從哺乳動物細(xì)胞去除液體培養(yǎng)基的多種不同的方法是本領(lǐng)域已知的，包括，例如，離心、過濾、移液和/或抽吸。然后可使用多種生物化學(xué)技術(shù)從液體培養(yǎng)基回收并進(jìn)一步純化分泌的重組蛋白，所述技術(shù)包括多種類型的層析(例如，親和層析、分子篩層析、陽離子交換層析或陰離子交換層析)和/或過濾(例如，分子量截留過濾)。為了回收胞內(nèi)重組蛋白，可裂解哺乳動物細(xì)胞。用于裂解哺乳動物細(xì)胞的多種多樣的方法是本領(lǐng)域已知的，包括，例如，超聲處理和/或洗滌劑、酶和/或化學(xué)裂解?？墒褂枚喾N本領(lǐng)域已知的生物化學(xué)方法從哺乳動物細(xì)胞裂解液純化重組蛋白，所述方法通常以離心去除細(xì)胞碎片的步驟開始，然后是一個或多個額外步驟(例如，一種或多種類型的層析(例如，親和層析、分子篩層析、陽離子交換層析或陰離子交換層析)和/或過濾(例如，分子量截留過濾))。在一些實施方案中，回收的重組蛋白是按重量計至少或約50％純的，例如，按重量計至少或約55％純的，按重量計至少60％純的，按重量計至少65％純的，按重量計至少70％純的，按重量計至少75％純的，按重量計至少80％純的，按重量計至少85％純的，按重量計至少90％純的，按重量計至少95％純的，按重量計至少96％純的，按重量計至少97％純的，按重量計至少98％純的，或按重量計至少或大約99％純的或按重量計大于99％純的。實施例在下列實施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，所述實施例不對權(quán)利要求中記載的本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。實施例1.示例性培養(yǎng)方法的有益特性進(jìn)行實驗以生成灌注培養(yǎng)的小規(guī)模高通量模型并測定這些培養(yǎng)是否能夠?qū)崿F(xiàn)與生產(chǎn)灌注培養(yǎng)類似的細(xì)胞密度。材料和方法重組半乳糖苷酶懸浮細(xì)胞培養(yǎng)在每個細(xì)胞培養(yǎng)方法運行中使用了產(chǎn)生重組半乳糖苷酶的同一選殖細(xì)胞系，并且將用于每個細(xì)胞培養(yǎng)方法運行的培養(yǎng)基列于表1中。表1.研究中使用的培養(yǎng)基儀器和試劑在本實施例描述的細(xì)胞培養(yǎng)方法運行中使用了以下儀器和試劑：Multitron搖動培養(yǎng)箱(AppropriateTechnicalResources,Inc.)(型號AJ125)、Auto1000(NexcelomBioscienceLLC)、BeckmanCoulterAllegra離心機(jī)(型號AllegraX-14R)、Bioreactors50(TechnoPlasticProductsAG,Trasadingen,Switzerland)、96-孔微板2-mL(GrienerBioOne,Frickenhausen,Germany)、96-孔微板1-mL(GrienerBioOne,Frickenhausen,Germany)、Olympus白光桌面型顯微鏡(型號BH-s)、Olympus白光桌面型顯微鏡(型號BX40)、Olympus白光桌面型顯微鏡(型號BX41)、0.4％錐蟲藍(lán)溶液(Sigma)、0.2％錐蟲藍(lán)溶液(Sigma)、ReichertBright-血細(xì)胞計數(shù)儀腔室、ThermoScientific顯微鏡蓋玻片、FisherScientificLaboratoryCounter、JMPSoftware(版本X)、ApplikonMicroFlask微量滴定板夾持裝置(ApplikonBiotechnologyInc.)、AeraSeal、微孔拋棄式膜密封(PhenixResearchProducts)、BeckmanCoulter3000LaboratoryAutomationWorkstation、RAININPipetting360°Pipet-LiteTMXLSTMPipettor(MettlerToledo)、ErgenomicHigh-PerformancePipettor和試劑貯液器(VistaLabTechnologies)。方法實施研究以測試攪拌(RPM)、孔形狀和工作體積的一系列變化條件。設(shè)計研究以覆蓋320RPM至360RPM的攪拌范圍、圓底(1-mL標(biāo)稱容積)或方底(2-mL標(biāo)稱容積)孔和100μL至600μL工作體積。實施細(xì)胞培養(yǎng)方法運行I以測定用于圓底深孔板(1-mL標(biāo)稱容積)的操作條件的基礎(chǔ)。實施細(xì)胞培養(yǎng)方法運行II以測定圓底深孔板支持高密度細(xì)胞培養(yǎng)的能力。實施細(xì)胞培養(yǎng)方法運行III以建立用于設(shè)計優(yōu)化的參數(shù)范圍，以及比較ApplikonMicroFlask微量滴定板夾持裝置(ApplikonBiotechnology,Inc.,FosterCity,CA)與無菌的、微孔膜密封(AeraSeal,PhenixResearchProducts,CandlerNC)。設(shè)計實施細(xì)胞培養(yǎng)方法運行IV和V用于模型優(yōu)化目的。使用JMP軟件的定制設(shè)計工具設(shè)計細(xì)胞培養(yǎng)方法運行V?？紤]到三階相互作用(third-orderinteraction)，將模型設(shè)計為對于兩個連續(xù)的變量(搖動速度和工作體積)和一個分類響應(yīng)(孔形狀)的I最佳。根據(jù)表2(其中工作體積作為總?cè)萜黧w積的分?jǐn)?shù)列出)設(shè)定下限和上限。定制設(shè)計以具有2次冪來考慮變量之間的任何非線性關(guān)系。最后，設(shè)計研究以使一式兩份重復(fù)運行的每個實驗具有總共15個條件(圓底孔6個和方底孔9個)。表2.JMP中使用的連續(xù)變量設(shè)置變量下限上限搖動速度(RPM)320360工作體積0.10.3工作體積(mL)230將全部容器使用來自種子培養(yǎng)物的細(xì)胞以5x106活細(xì)胞/mL接種，所述種子培養(yǎng)物在細(xì)胞庫的小瓶解凍后對于細(xì)胞培養(yǎng)方法運行1-5分別在振蕩燒瓶中擴(kuò)大9、10、7、0和7次傳代。將細(xì)胞培養(yǎng)物保持在搖動培養(yǎng)箱中5％CO2、37℃和80％相對濕度的受控環(huán)境中。對照搖管條件與每個實驗一起運行，其具有10mL每管的恒定工作體積、45°的搖動角度和160RPM的攪拌。對于全部實驗(除非另行注明)，根據(jù)表3考慮了蒸發(fā)。表3.蒸發(fā)補(bǔ)充變量圓形DWP方形DWPApplikon20μL20μL拋棄式膜20μL40μL對于細(xì)胞培養(yǎng)方法運行I，將圓底深孔板以5x105活細(xì)胞/mL和1x106活細(xì)胞/mL接種。在接種后的第一天開始，每天采樣(10μL)培養(yǎng)物以通過手動計數(shù)(排除錐蟲藍(lán))測定活細(xì)胞密度(VCD)，進(jìn)行兩日。對于細(xì)胞培養(yǎng)方法運行II，在接種后的第一天開始，每日采樣(10μL)培養(yǎng)物以通過手動計數(shù)測定VCD達(dá)11日。在細(xì)胞計數(shù)之后，將板以～233xg離心5分鐘，并去除用過的培養(yǎng)基。以表4中描述的比例交換培養(yǎng)基。使用圓底(1-mL)深孔板和方底(2-mL)深孔板用于細(xì)胞培養(yǎng)方法運行III和IV。在接種后的第一天開始，在每個周一、周三和周五采樣培養(yǎng)物(2-2-3時間表)(10μL)以通過Auto1000測定VCD。在細(xì)胞計數(shù)之后，將板以～233xg離心5分鐘，并去除用過的培養(yǎng)基。以表4中描述的比例交換培養(yǎng)基。對于細(xì)胞培養(yǎng)方法運行V，使用了Biomek3000液體處理器。在接種后的第一天開始，在每個周一、周三和周五采樣培養(yǎng)物(0.10x工作體積)以通過Auto1000確定VCD。在細(xì)胞計數(shù)之后，將板以～233xg離心5分鐘，并立即使用去除的用過的培養(yǎng)基或?qū)⑵鋬Υ嬖?80℃直到進(jìn)行重組人α-半乳糖苷酶(rhα-Gal)活性測定法以測定產(chǎn)物滴度/效價。以表5中描述的比例交換培養(yǎng)基，并使用下文的等式1和2計算rhα-Gal體積生產(chǎn)率和比生產(chǎn)率。此外，使用下文的等式3計算整體/積分的(integrated)活細(xì)胞密度(IVCD)。表4.批次再補(bǔ)料時間表接種后的培養(yǎng)日1再補(bǔ)料速率(生物反應(yīng)器體積每天)第1–3天0.5RV/d第4–6天0.7RV/d第7天起1.0RV/d1接種時的接種密度為5x105細(xì)胞/mL.表5.修飾的批次再補(bǔ)料時間表接種后的培養(yǎng)日1再補(bǔ)料速率(生物反應(yīng)器體積每天)第1–3天0.4RV/d第4–6天0.5RV/d第7–10天0.7RV/d第11天起2x0.5RV/d1接種時的接種密度為5x105細(xì)胞/mL。VPR＝滴度*PR等式1PR：灌注速率VPR：體積生產(chǎn)率(U/L/d)Titer：rhα-Gal活性(U/L)SPR：比生產(chǎn)率(U/E9細(xì)胞/d)Xv：活細(xì)胞計數(shù)(E6細(xì)胞/mL)IVCD：整體/積分的活細(xì)胞密度(細(xì)胞-d/mL)t：時間(d)手動細(xì)胞計數(shù)用異丙醇(IPA)清潔血細(xì)胞計數(shù)器腔室和蓋片。將蓋片的角落用IPA沾濕，并固定至血細(xì)胞計數(shù)器。將細(xì)胞樣品均勻地按照1:1與0.4％錐蟲藍(lán)混合。將10μL等分試樣轉(zhuǎn)移至血細(xì)胞計數(shù)器腔室。在四個較大的外正方形中計數(shù)細(xì)胞：每個大的外正方形含有16個較小的正方形網(wǎng)格。將位于較大正方形的邊界上的細(xì)胞僅對四邊中的兩邊進(jìn)行計數(shù)。將未染色的細(xì)胞計算為活細(xì)胞，同時將那些染為藍(lán)色的細(xì)胞認(rèn)為是死細(xì)胞。百分比活力和活細(xì)胞密度使用下文的等式4和5計算?？偧?xì)胞：活細(xì)胞和死細(xì)胞之和Nexcelom細(xì)胞計數(shù)器細(xì)胞計數(shù)將細(xì)胞樣品均勻地按照1:1與0.2％錐蟲藍(lán)混合。將混合物的20μL等分試樣轉(zhuǎn)移至儀器專用載片。在通過儀器中整合的數(shù)碼相機(jī)取得的四幅圖像中計數(shù)細(xì)胞。將未染色的細(xì)胞計算為活細(xì)胞，同時將那些染為藍(lán)色的細(xì)胞認(rèn)為是死細(xì)胞。統(tǒng)計學(xué)分析使用JMP軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。使用的應(yīng)答為使用最大化期望值(maximizeddesirability)的峰值活細(xì)胞密度(VCD或XV)和體積生產(chǎn)率(VPR)。通過帶有效果篩選報告的“擬合模型”功能評價統(tǒng)計學(xué)模型?！诌x參數(shù)估計’報告了顯著影響應(yīng)答變量的因素，其是通過t檢驗在統(tǒng)計學(xué)上確定的。最后，‘預(yù)測分析器(PredictionProfiler)’繪制了參數(shù)對應(yīng)答變量的效果的獨立趨勢，并使用模型通過最大化期望值功能來預(yù)測最佳條件。結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)方法運行I在本實驗中，在小瓶解凍之后第27天，將rhα-GalCHO細(xì)胞系(于CDCHO培養(yǎng)基中)用于在三種不同條件(表6)下接種容器。追蹤細(xì)胞培養(yǎng)增殖概貌11天。表6.細(xì)胞培養(yǎng)方法I測試的條件容器類型總體積工作體積搖晃速度搖管50mL10mL160RPM96DWP(圓形)1mL200μL330RPM96DWP(圓形)1mL300μL330RPM保持在CDCHO培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物十一天的活細(xì)胞密度概貌示于圖5。觀察了全部實驗培養(yǎng)物中的生長。對于以5x105細(xì)胞/mL接種的細(xì)胞，在兩種工作體積下(200μL和300μL)存在達(dá)到1x106細(xì)胞/mL的VCD的最小生長。這表明細(xì)胞能夠以低接種密度在圓底深孔板中生長。以1x106細(xì)胞/mL接種的培養(yǎng)物也在第2天展現(xiàn)出生長，其中以0.5RV每天再補(bǔ)料兩次的培養(yǎng)物具有更好的生長(圖6)。再補(bǔ)料兩次的培養(yǎng)物在第2天達(dá)到了2x106細(xì)胞/mL以上的VCD：以200μL為2.7x106細(xì)胞/mL，而以300μL為2.3x106細(xì)胞/mL。以大約1.0RV/天再補(bǔ)料的培養(yǎng)物在第2天具有低得多的VCD，這可能也是因為在去除用過的培養(yǎng)物的過程中無意的細(xì)胞損失。這些數(shù)據(jù)指示2x0.5RV/天的灌注速率允許比1.0RV/天的灌注速率更好的細(xì)胞生長。這些數(shù)據(jù)提示圓底1-mL96深孔板能夠支持細(xì)胞生長。在整個實驗過程中，當(dāng)從搖動培養(yǎng)箱中立即取出時，觀察到了培養(yǎng)物具有小細(xì)胞團(tuán)塊，可能是因為不充分的攪拌。這一觀察結(jié)果提示對于圓底1-mL深孔板應(yīng)該使用更高的攪拌速度。細(xì)胞培養(yǎng)方法運行II進(jìn)行了一組實驗來優(yōu)化用于在圓底(1-mL)96深孔板中培養(yǎng)細(xì)胞的灌注速率。在這些實驗中，使用CDCHO培養(yǎng)基中的rhα-Gal細(xì)胞(小瓶解凍之后的第30天)來接種圓底96深孔板中的孔和搖管(如表7中所述)。在11天的分批再補(bǔ)料過程中評估了細(xì)胞培養(yǎng)表現(xiàn)。表7.細(xì)胞培養(yǎng)方法運行測試的條件容器類型總體積工作體積振蕩速度搖管50mL10mL160RPM96DWP(圓形)1mL300μL360RPM全部培養(yǎng)物保持了85％以上的百分比細(xì)胞活力(圖7)。保持在CDCHO培養(yǎng)基中的細(xì)胞的11天培養(yǎng)的活細(xì)胞密度概貌示于圖8。對于全部培養(yǎng)觀察到了生長直到第9天，此時實驗對照(搖管培養(yǎng))細(xì)胞生長達(dá)到了25x106細(xì)胞/mL的峰值密度的平臺期。圓底96深孔板中的培養(yǎng)物展現(xiàn)了比實驗對照慢的生長速率，達(dá)到8x106細(xì)胞/mL的峰值VCD。在第8天，考慮到蒸發(fā)損失，向圓底96深孔板培養(yǎng)物添加了培養(yǎng)基的推注(50μL)。圓底96深孔板的這些數(shù)據(jù)提示應(yīng)該調(diào)整再補(bǔ)料時間表。修改的再補(bǔ)料時間表示于圖9和表3。細(xì)胞培養(yǎng)方法運行III進(jìn)行了一組實驗來優(yōu)化用于在圓底96深孔板中培養(yǎng)細(xì)胞的再補(bǔ)料速率。這些實驗使用1-mL圓底和2-mL方底兩種96深孔板和圖9中所示的修改的再補(bǔ)料速率方案進(jìn)行。在小瓶解凍之后的第8天，將CDCHO培養(yǎng)基中的rhα-Gal細(xì)胞用于接種兩種類型的深孔板和搖管(參見，表8)。方底96深孔培養(yǎng)含有300μL或500μL的培養(yǎng)體積，而圓底96深孔培養(yǎng)含有200μL或300μL的培養(yǎng)體積(1mL標(biāo)稱容積)。這些孔使用Applikon系統(tǒng)或使用AeraSeal膜之一來密封。將全部96深孔板培養(yǎng)以330RPM或360RPM攪拌。在9天期間測量了細(xì)胞培養(yǎng)物生長。對96深孔板培養(yǎng)的全部活細(xì)胞計數(shù)均在一式三份重復(fù)的孔中進(jìn)行計數(shù)并進(jìn)行平均。15天細(xì)胞培養(yǎng)的活細(xì)胞密度概貌示于圖10。使用Applikon系統(tǒng)覆蓋的或使用拋棄式膜密封覆蓋的方底96深孔板培養(yǎng)展現(xiàn)了相似的生長曲線(彼此處在一個標(biāo)準(zhǔn)偏差(1SD)之內(nèi))。96孔板形式中最高的活細(xì)胞密度是35x106細(xì)胞/mL的活細(xì)胞密度，其是在方底96深孔板中在第15天時實現(xiàn)的。在對照搖管培養(yǎng)中實現(xiàn)的最高活細(xì)胞密度是第10天時的21x106細(xì)胞/mL。直到第13天，方底96深孔板培養(yǎng)還非常接近地模仿了對照搖管培養(yǎng)的生長曲線。然而，方底96深孔板培養(yǎng)在整個15天的過程中模仿了歷史搖管對照(n＝11)。最接近地模仿了歷史搖管對照培養(yǎng)的兩種方底96深孔板培養(yǎng)使用了拋棄式膜覆蓋并且以330RPM攪拌并且具有300μL或500μL的培養(yǎng)體積。在本實驗中的圓底96深孔板培養(yǎng)沒有展現(xiàn)出與對照搖管培養(yǎng)相當(dāng)?shù)纳L。在圓底96深孔板培養(yǎng)中觀察到的最高活細(xì)胞密度是第15天時的14x106細(xì)胞/mL。全部培養(yǎng)保持了85％以上的百分比細(xì)胞活力(圖11)，直到進(jìn)入下降期。與搖管對照不同，兩種孔形狀中的培養(yǎng)持續(xù)地增殖超過第14天，到第20天達(dá)到了50x106細(xì)胞/mL(方底)和17x106細(xì)胞/mL(圓底)的活細(xì)胞密度(圖12和13)。這些數(shù)據(jù)指示圓底96深孔板能夠支援高細(xì)胞密度。表8.細(xì)胞培養(yǎng)方法運行III測試的條件容器類型總體積工作體積搖晃速度無菌覆蓋搖管50mL10mL160RPM排氣蓋96DWP(圓形)1mL200μL330RPMApplikon96DWP(圓形)1mL300μL330RPMApplikon96DWP(圓形)1mL200μL330RPM拋棄式膜96DWP(圓形)1mL300μL330RPM拋棄式膜96DWP(圓形)1mL200μL360RPM拋棄式膜96DWP(圓形)1mL300μL360RPM拋棄式膜96DWP(方形)2mL300μL330RPM拋棄式膜96DWP(方形)2mL500μL330RPM拋棄式膜96DWP(方形)2mL300μL330RPM拋棄式膜96DWP(方形)2mL500μL330RPM拋棄式膜96DWP(方形)2mL300μL360RPM拋棄式膜96DWP(方形)2mL500μL360RPM拋棄式膜細(xì)胞培養(yǎng)方法運行IV進(jìn)行了另外一組實驗來優(yōu)化方底96深孔板(2-mL標(biāo)稱容積)中的細(xì)胞生長。在這些實驗中，在小瓶解凍之后的第1天，使用CDCHO培養(yǎng)基中的細(xì)胞來接種方底96深孔板和搖管(n＝3)(參見，表9)。在這些實驗中使用的培養(yǎng)體積是300μL或500μL，并且以320RPM、330RPM或340RPM攪拌培養(yǎng)物。在14天期間評估了培養(yǎng)物中的細(xì)胞生長。對于培養(yǎng)物的全部活細(xì)胞計數(shù)均從一式三份重復(fù)的孔中計數(shù)并進(jìn)行平均。表9.細(xì)胞培養(yǎng)方法運行IV測試的條件容器類型總體積工作體積搖晃速度無菌覆蓋搖管50mL10mL160RPM排氣蓋96DWP(圓形)2mL300μL320RPM拋棄式膜96DWP(圓形)2mL500μL320RPM拋棄式膜96DWP(圓形)2mL300μL330RPM拋棄式膜96DWP(圓形)2mL500μL330RPM拋棄式膜96DWP(圓形)2mL300μL340RPM拋棄式膜96DWP(圓形)2mL500μL340RPM拋棄式膜在14天期間的方底96深孔板培養(yǎng)的活細(xì)胞密度概貌示于圖14中。直到第7天，所有測試的條件展現(xiàn)出了相似的生長概貌。在第7天之后，具有500μL的培養(yǎng)體積并以320RPM或330RPM攪拌的方底96深孔板展現(xiàn)了更好的細(xì)胞生長。盡管全部測試的培養(yǎng)條件均持續(xù)增殖到過了第13天之后，達(dá)到30x106細(xì)胞/mL至35x106細(xì)胞/mL的活細(xì)胞密度，具有更好的生長表現(xiàn)的兩種培養(yǎng)條件達(dá)到了40x106細(xì)胞/mL以上的活細(xì)胞密度。在第12天之后，在具有500μL的培養(yǎng)體積和320RPM或330RPM的攪拌速率的方底96深孔板培養(yǎng)中實現(xiàn)的活細(xì)胞密度超過了搖管中相同細(xì)胞系的培養(yǎng)物在歷史上觀察到的活細(xì)胞密度(落入1標(biāo)準(zhǔn)偏差之內(nèi))。直到培養(yǎng)的第12天，在具有500μL的培養(yǎng)體積和320RPM或330RPM的攪拌速率的方底96深孔板培養(yǎng)中和搖管培養(yǎng)中觀察到了相似的生長模式。細(xì)胞培養(yǎng)方法運行V進(jìn)行了另外一組實驗來優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)操作條件(參見，上文對實驗方法設(shè)計的描述)。在這些實驗中，在小瓶解凍之后第21天，使用CDCHO中的細(xì)胞來接種方底或圓底96深孔板或搖管。每種測試的培養(yǎng)的操作條件示于表10。將測試的每種96深孔板用AeraSeal拋棄式膜覆蓋。搖管培養(yǎng)充當(dāng)對照(n＝4)：一組兩個搖管培養(yǎng)按照對照再補(bǔ)料時間表，而另一組兩個搖管培養(yǎng)按照用于96深孔板中的修改的再補(bǔ)料速率(圖9中所示)。全部條件以一式兩份重復(fù)測試。在9天的分批再補(bǔ)料方法中評估了細(xì)胞生長。表10.細(xì)胞培養(yǎng)方法允許V測試的條件容器類型總體積工作體積搖晃速度無菌覆蓋搖管50mL10mL160RPM排氣蓋96DWP(圓形)1mL100μL320RPM拋棄式膜96DWP(圓形)1mL300μL320RPM拋棄式膜96DWP(圓形)1mL200μL340RPM拋棄式膜96DWP(圓形)1mL100μL360RPM拋棄式膜96DWP(圓形)1mL300μL360RPM拋棄式膜96DWP(方形)2mL200μL320RPM拋棄式膜96DWP(方形)2mL400μL320RPM拋棄式膜96DWP(方形)2mL600μL320RPM拋棄式膜96DWP(方形)2mL200μL340RPM拋棄式膜96DWP(方形)2mL400μL340RPM拋棄式膜96DWP(方形)2mL600μL340RPM拋棄式膜96DWP(方形)2mL200μL360RPM拋棄式膜96DWP(方形)2mL400μL360RPM拋棄式膜96DWP(方形)2mL600μL360RPM拋棄式膜列于表10中維持在CDCHO培養(yǎng)基中的細(xì)胞的15天培養(yǎng)的活細(xì)胞密度概貌示于圖15和16。在當(dāng)前測試的條件下，圓底96深孔板培養(yǎng)不像方底培養(yǎng)一樣表現(xiàn)良好(分別為圖15和圖16)。對于在360RPM攪拌的100μL培養(yǎng)，圓底96深孔板中達(dá)到的最高活細(xì)胞密度是20x106細(xì)胞/mL。與具有接近40x106細(xì)胞/mL的峰值活細(xì)胞密度的對照搖管培養(yǎng)相比，方底96深孔板培養(yǎng)具有相當(dāng)?shù)幕罴?xì)胞密度(在1標(biāo)準(zhǔn)偏差之內(nèi))(當(dāng)使用上文所述的修改的再補(bǔ)料速率時)。使用400μL的培養(yǎng)體積和320RPM或340RPM的攪拌實現(xiàn)了最好的方底96深孔細(xì)胞培養(yǎng)，在第15天達(dá)到了大約50x106細(xì)胞/mL的峰值活細(xì)胞密度。另外，具有600μL培養(yǎng)體積和340RPM的攪拌的方底96深孔在第13天產(chǎn)生了高達(dá)27x106細(xì)胞/mL的細(xì)胞生長，并且產(chǎn)生了與達(dá)到31x106細(xì)胞/mL的峰值活細(xì)胞密度的搖管對照培養(yǎng)(對照再補(bǔ)料速率)相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。全部測試的培養(yǎng)保持了大于85％的活細(xì)胞百分比。在搖管對照培養(yǎng)和96深孔培養(yǎng)的整體/積分的活細(xì)胞密度之間進(jìn)行的比較示于圖17和18。在CDCHO中培養(yǎng)的細(xì)胞的15天培養(yǎng)的體積生產(chǎn)率概貌示于圖19和20。正如基于活細(xì)胞生長所預(yù)測的，在圓底96深孔板中生長的培養(yǎng)物具有較低的生產(chǎn)力(圖19)。22,000單位/L/天的最佳體積生產(chǎn)率是在第15天在圓底96深孔板內(nèi)100μL培養(yǎng)基中并以320RPM的攪拌生長的培養(yǎng)物中觀察到的(圖19)。然而，具有相同培養(yǎng)體積和攪拌的圓底96深孔板培養(yǎng)在之前數(shù)天具有低的體積生產(chǎn)率(<5000單位/L/天)。在方底96深孔培養(yǎng)中觀察到了改進(jìn)的體積生產(chǎn)率(圖20)，其緊密地遵循了生長概貌。對于生長模式緊密地模仿了搖管培養(yǎng)的培養(yǎng)(具有600μL體積并以340RPM攪拌的方底培養(yǎng))觀察到了相當(dāng)?shù)幕钚?到第15天為40000單位/L/天)。具有初始生長延遲但最終與對照搖管培養(yǎng)具有類似的峰值活細(xì)胞密度的數(shù)種培養(yǎng)(方底96深孔培養(yǎng)，其具有400μL的體積和340RPM的攪拌，或400μL或600μL的體積或360RPM的攪拌)直到第13天展現(xiàn)了類似的體積生產(chǎn)率(達(dá)到約40,000單位/L/天的體積生產(chǎn)率)。在第13天之后，體積生產(chǎn)率減少，除了以400μL的體積和360RPM的攪拌生長的培養(yǎng)，其在第15天達(dá)到了60,000單位/L/天的體積生產(chǎn)率。在具有400μL的體積并以320RPM攪拌的方底96深孔培養(yǎng)中觀察到了最佳生產(chǎn)力，其在第15天達(dá)到了67,000單位/L/天的體積生產(chǎn)率。用于圓底96深孔板培養(yǎng)的大多數(shù)條件展現(xiàn)了與對照搖管培養(yǎng)相比相當(dāng)?shù)幕蚋偷谋壬a(chǎn)率(SPR)，除了在100μL的體積中生長并以320RPM攪拌的培養(yǎng)，或在300μL的體積中生長并以360RPM攪拌的培養(yǎng)(圖21)。這些培養(yǎng)在第15天具有增加的比生產(chǎn)率。具有相當(dāng)?shù)幕蚋蟮捏w積生產(chǎn)率的五種方底96深孔板培養(yǎng)也展現(xiàn)了與對照搖管培養(yǎng)(1600單位/1x109細(xì)胞/天)相當(dāng)?shù)幕蚋蟮谋壬a(chǎn)率(圖22)。將收集的數(shù)據(jù)傳入JMP實驗設(shè)計，以基于統(tǒng)計學(xué)分析預(yù)測最佳操作條件。使用三種響應(yīng)預(yù)測最佳操作條件：峰值活細(xì)胞密度、峰值體積生產(chǎn)率和峰值比生產(chǎn)率。設(shè)定全部響應(yīng)限以最大化輸出。首先，將數(shù)據(jù)擬合至模型，如圖23和24所示。對于活細(xì)胞密度(圖23)和體積生產(chǎn)率(圖24)收集的數(shù)據(jù)與模型匹配良好。統(tǒng)計學(xué)分析(t檢驗)揭示了孔形狀和工作體積顯著影響活細(xì)胞密度和生產(chǎn)力二者，而搖動速度僅顯著影響生產(chǎn)力。使用JMP分析儀預(yù)測了最佳操作條件(圖25)?；谠摲治觯罴鸭?xì)胞表現(xiàn)應(yīng)該在使用具有440μL工作體積并以360RPM攪拌的方底96深孔板時獲得。將標(biāo)準(zhǔn)偏差考慮在內(nèi)并維持相同的合意性，對于方底96深孔板的最佳操作范圍是工作體積為約350μL至約550μL，而搖動速度為約320RPM至約360RPM。綜上，數(shù)據(jù)顯示本文提供的方法能夠用作較大規(guī)模灌注生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)的模型(例如，通過在相似的時間框架內(nèi)實現(xiàn)相似的細(xì)胞密度)。本文提供的方法能夠用于高通量篩選組織培養(yǎng)基(和組織培養(yǎng)基內(nèi)的組分)。實施例2.96深孔培養(yǎng)方法用于篩選培養(yǎng)基的用途進(jìn)一步進(jìn)行了一組實驗以使用本文描述的96深孔培養(yǎng)方法測試多種不同的組織培養(yǎng)基。在這些實驗中，將產(chǎn)生單株株抗體的重組哺乳動物細(xì)胞系(產(chǎn)mAb細(xì)胞)或產(chǎn)生酶的重組哺乳動物細(xì)胞系(產(chǎn)酶細(xì)胞)用于接種方底96深孔板，并將細(xì)胞在500μL的至少102種不同的組織培養(yǎng)基之一中伴隨330RPM的攪拌培養(yǎng)一周。這些實驗中的對照是使用相同的96深孔板、相同的培養(yǎng)基、相同的樣品細(xì)胞系和CDCHO培養(yǎng)基實現(xiàn)的活細(xì)胞密度。在歷時七天中測量了培養(yǎng)物的活細(xì)胞密度和滴度/效價二者。圖26-29中的數(shù)據(jù)顯示本文描述的96深孔培養(yǎng)方法能夠篩選不同組織培養(yǎng)基對培養(yǎng)的細(xì)胞的生產(chǎn)力和活細(xì)胞密度的作用。其他實施方案應(yīng)理解的是，盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的詳述對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是前文的描述旨在闡釋而不在限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求的范圍來限定。其他方面、優(yōu)勢和修飾在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3