本發(fā)明涉及包含有機聚合物的顆粒。這些顆?？捎糜诶缢幬镞f送應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我們之前公開了多種聚合物材料和技術(shù)來產(chǎn)生可用于包括生物學(xué)和納米技術(shù)的多種領(lǐng)域的分子結(jié)構(gòu)。

例如，WO 2009/12220公開了聚合物-樹枝狀聚合物雜化物(hybrid)，也稱為聚樹枝狀分子(polydendron)，其包含攜帶樹枝狀分子的支化乙烯基聚合物支架：這些聚樹枝狀分子由于它們的多重支化性質(zhì)具有部分的有利的樹枝狀聚合物類性能，而沒有復(fù)雜的常規(guī)樹枝狀聚合物加工的缺點。

能夠控制這種材料的性能，包括例如它們的尺寸、尺寸分布、官能度、疏水性/親水性、和在用于例如生物應(yīng)用情況下的含水體系的體系中的行為，是有用的。

我們現(xiàn)在研發(fā)了新種類的有用的材料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一方面提供了包含支化聚合物以及嵌段共聚物或線性樹枝狀雜化物中的任一種的顆粒。

支化聚合物可以是多種類型。兩種實例類型是支化乙烯基聚合物和支化聚酯。

可以通過已知的方法由單官能的乙烯基單體和二官能的乙烯基單體(支化劑)制備支化乙烯基聚合物。

可以通過例如單官能的內(nèi)酯單體和二官能的內(nèi)酯單體(支化劑)的開環(huán)聚合制備支化聚酯。

嵌段共聚物包含嵌段或片段，其各自具有各嵌段內(nèi)的相同類型的重復(fù)單元并且在嵌段片段之間是不同的。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明使用二嵌段共聚物(即具有兩種不同嵌段的共聚物)是特別有效的?？梢允褂闷渌抖喂簿畚?，例如三嵌段共聚物。

線性樹枝狀雜化物，也稱為線性樹枝狀聚合物，同樣包含不同的片段，其中的一種是線性聚合物鏈且另一種是樹枝狀分子。我們發(fā)現(xiàn)使用包含以樹枝狀分子封端或起始的均聚物的線性樹枝狀雜化物是特別有效的。然而，在本發(fā)明可以使用其他類型的線性樹枝狀雜化物(例如其中線性聚合物本身是共聚物，例如統(tǒng)計共聚物、嵌段共聚物或二嵌段共聚物)。因此，例如，線性樹枝狀雜化物可以包含連接至另一個嵌段，其然后連接至樹枝狀分子的一個嵌段。

顆?？梢允羌{米顆粒，例如其中至少一個尺寸、或其中z平均直徑(也稱為平均流體力學(xué)直徑)不大于約1000nm的顆粒。顆?？梢跃哂行∮?00nm、或小于500nm、或小于300nm、例如約50至300nm、或50至250nm、或100至200nm的z平均直徑。

重要的是注意本發(fā)明的顆粒含有兩種類型的聚合物材料，即支化聚合物以及嵌段共聚物或線性樹枝狀雜化物中的任一種(和可選地如以下所討論的另外的材料)，但是這些沒有彼此共價鍵連。相反，如在例如WO2009/12220中公開的，聚樹枝狀分子含有共價附接至支化乙烯基聚合物支架的樹枝狀分子單元。在本發(fā)明中，不同的聚合物材料在顆粒結(jié)構(gòu)內(nèi)彼此結(jié)合但不是彼此共價鍵合。優(yōu)選地，大部分、或基本上所有、或所有的顆粒具有相同的一般結(jié)構(gòu)。其中各部分結(jié)合、混合或組合的普通方式帶來了可靠的和可再現(xiàn)的性能。

本發(fā)明中的聚合物結(jié)構(gòu)的組合帶來特定的優(yōu)點。

第一主要組分支化聚合物組分通?？梢允鞘杷缘牟⒁虼丝捎糜谔峁┙Y(jié)合、攜帶或包封疏水性化合物、部分或負(fù)載(例如藥物)的環(huán)境?？商鎿Q地，其可以具有親水性質(zhì)。其可以響應(yīng)于pH或其他條件或刺激使得其性質(zhì)、例如其疏水/親水性質(zhì)、其結(jié)構(gòu)、和/或其在液相中的行為可以根據(jù)環(huán)境改變。

第二主要組分具有至少兩種片段(在嵌段共聚物的情況下不同的均聚物或共聚物嵌段，或在線性樹枝狀雜化物的情況下線性聚合物嵌段加樹枝狀分子)。這使得到的顆粒能夠適合或適應(yīng)用于各種介質(zhì)和環(huán)境以及用于各種應(yīng)用。這還使片段中的一種能夠充當(dāng)穩(wěn)定劑來穩(wěn)定液體介質(zhì)，例如含水介質(zhì)內(nèi)的顆粒，以及可選地提供鹽穩(wěn)定性以穩(wěn)定在生命系統(tǒng)中可能遇到的各自鹽條件和/或各種生理條件中的顆粒。

嵌段共聚物或線性樹枝狀雜化物可以包含疏水性片段。這使其能夠與疏水性支化聚合物(和可選地具有疏水性傳送材料)結(jié)合。疏水片段可以包含乙烯基聚合物。

嵌段共聚物或線性樹枝狀雜化物可以包含親水性片段。這在例如含水環(huán)境中是有用的并能夠穩(wěn)定納米顆粒。親水性片段可以包含例如聚醚結(jié)構(gòu)如聚乙二醇(PEG)或PEO。

當(dāng)然，嵌段共聚物或線性樹枝狀雜化物可以包含疏水性片段和親水性片段兩者，并從而表現(xiàn)出兩親行為。

因此，我們研發(fā)了特別有利的組合，其中支化聚合物是疏水性的并形成疏水核，并且其中嵌段共聚物或線性樹枝狀雜化物是兩親的，使得其一種片段可以與疏水核結(jié)合且其另一種片段可以在含水介質(zhì)中穩(wěn)定顆粒。這些在尺寸以及在含水介質(zhì)和改變的鹽條件下的穩(wěn)定性方面表現(xiàn)出相當(dāng)大的均一性。

然而，聚合物的其他類型的組合和因此的性質(zhì)在其他情形下也是有用的，并在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

支化聚合物、嵌段共聚物或線性樹枝狀雜化物可以包含響應(yīng)于pH或其他條件或刺激的化學(xué)性質(zhì)使得其性質(zhì)、例如其疏水/親水性質(zhì)可以根據(jù)環(huán)境改變。

線性樹枝狀雜化物包含線性聚合物鏈和樹枝狀分子。所述線性聚合物鏈可以本身是共聚物，例如統(tǒng)計共聚物或嵌段共聚物。

顆?？梢园M(jìn)一步的材料，例如化合物、有機化合物、疏水性化合物、親水性化合物、藥物、前體藥物或治療上、診斷上或生物上有用材料。實際上，本發(fā)明的一種主要用途是藥物遞送。

進(jìn)一步的材料、例如藥物或生物活性材料可以作為顆粒內(nèi)的單獨的化合物包含或包含在顆粒內(nèi)的單獨化合物內(nèi)，或可以共價鍵合至聚合物結(jié)構(gòu)中的一種，例如共價鍵合至支化聚合物、嵌段共聚物或線性樹枝狀雜化物。

從進(jìn)一步的方面，通過共沉淀制備顆粒。

制備方法可以包括：

‐將支化聚合物和嵌段共聚物或線性樹枝狀雜化物中的任一種以及可選地其他組分溶解在溶劑中以形成溶液；

‐將所述溶液添加到不同的液體中，

‐除去溶劑以形成共沉淀的顆粒在液體內(nèi)的分散體。

可以通過例如使得所述溶劑蒸發(fā)或通過透析除去溶劑。

分散體可以原樣用于例如治療應(yīng)用的應(yīng)用，或可替換地，可以濃縮或凝膠化該分散體，或可以除去液體以產(chǎn)生固體顆粒。

材料溶解在其中的溶劑可以是有機溶劑，合適地是與其中沉淀出現(xiàn)的液體可互溶的溶劑，例如水溶性的溶劑。例如，材料溶解在其中的溶劑可以是例如丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亞砜、二噁烷、乙醇、異丙醇、甲醇、四氫呋喃和它們的任意組合和混合物或包含水的組合。

材料溶解在其中的溶劑可以是因為其相對容易蒸發(fā)而選擇的一種，例如具有80攝氏度或更低、或70攝氏度或更低、或60攝氏度或更低的沸點的一種。

其中發(fā)生沉淀的液體可以是例如水或其他含水體系、或其中材料不能溶解或相比第一溶劑溶解較不良好的其他液體。

可以使用多種水溶液。一些實例包括：

-堿金屬/鹵素鹽(例如NaCl、LiBr、KCl)的所有濃度(最高達(dá)飽和)的水溶液

-0至12pH范圍內(nèi)的水溶液，包括酸和堿(布朗斯特-勞里(-Lowry)無機和有機酸以及堿)溶液(例如，例如HCl、H₂SO₄、乙酸、NaOH或KOH的水溶液)

-表面活性劑(例如十二烷基硫酸鈉、兩親性二嵌段共聚物、)在水中的所有濃度(臨界膠束濃度以上和以下)的溶液

-所有合適濃度的含水體系中的生物培養(yǎng)基[例如輸送緩沖劑(transport buffer)、牛血清蛋白(BSA)、培養(yǎng)基杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle’s medium)(DMEM)、洛斯維帕克紀(jì)念研究所(Roswell park memorial institute)1640(RPMI 1640)、胎牛血清(FBS)]及它們的混合物。

以上所列的含水體系提供了其中本發(fā)明作用、符合包括治療應(yīng)用的各種條件下的應(yīng)用的各種各樣的體系的一些指示，其中存在承受變化的以及有時極端的生理環(huán)境的需要。

其中沉淀發(fā)生的液體可以是水和有機溶劑的混合物，例如丙酮/水混合物、THF/水、MeOH/水、EtOH/水或IPA/水。這種混合物中的水的量可以可選地是按體積計2份水比按體積計1份有機溶劑、或大于按體積計2份水(例如大于3份水，例如大于4份水)比按體積計1份有機溶劑。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別的發(fā)明點之一在于本發(fā)明涉及兩種特定類型的聚合物同時從有機溶劑共沉淀到水中。盡管有機聚合物的沉淀(包括納米沉淀)之前在多個文獻(xiàn)中公開并且已經(jīng)以不同的成功程度實施(參見例如Slater et al，Soft Matter 2012,8,9816-9827)，但是這還沒有涉及本發(fā)明中限定的聚合物類型的組合。我們首先認(rèn)識到并證明了這種共沉淀的益處。

可選地，可以進(jìn)行共沉淀多次。因此，在液體中形成共沉淀的顆粒的分散體(以及隨后除去有機溶劑)之后，可以另外進(jìn)行以下方法步驟一次或多次：

‐將另外的溶液(支化聚合物以及嵌段共聚物或線性樹枝狀雜化物中的任一種以及可選地其他組分在溶劑中的溶液)添加到液體中，

‐除去溶劑。

我們發(fā)現(xiàn)通過多次進(jìn)行共沉淀，可以增加液體內(nèi)的顆粒的濃度，同時基本上保持顆粒尺寸、PdI和穩(wěn)定性。換句話說，可以使用多次納米沉淀來提供每單位體積更多的相同類型的納米顆粒，而可以預(yù)期多次納米沉淀將導(dǎo)致顯著較大的顆粒、不同的分散性特征或不穩(wěn)定性。這在促進(jìn)藥物遞送中是特別有利的，其中增強的有效載荷可以導(dǎo)致實際的治療優(yōu)勢和成本效益。

支化聚合物組分

支化聚合物是本發(fā)明的顆粒中的主要組分。

支化聚合物是非凝膠化的和可加工的并可選地具有低粘度。如以上關(guān)于通過從這種溶劑沉淀到不同的介質(zhì)中形成顆粒的合適方法所描述的，其可溶于有機溶劑。其可以與不可溶和/或表現(xiàn)出高粘度的聚合物結(jié)構(gòu)如大規(guī)模交聯(lián)的不可溶聚合物網(wǎng)絡(luò)、高分子量線性聚合物或微凝膠形成對比。

支化乙烯基聚合物

支化聚合物可以是支化乙烯基聚合物。其可以通過以下制備但不限于此：活性聚合、受控聚合或常規(guī)的鏈增長聚合技術(shù)如自由基聚合。幾種類型的活性和受控聚合是本領(lǐng)域已知的并適合用于本發(fā)明。優(yōu)選類型的活性聚合是原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)；然而通過有意添加鏈轉(zhuǎn)移劑控制的其他技術(shù)如可逆加成-裂解鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)和氮氧調(diào)控聚合(NMP)或常規(guī)的自由基聚合也是合適的合成。

技術(shù)人員知道提供支化但非凝膠化的乙烯基聚合物的技術(shù)。例如，以下中描述了合適的流程：N.O’Brien,A.McKee,D.C.Sherrington,A.T.Slark and A.Titterton,Polymer 2000,41,6027-6031；T.He,D.J.Adams,M.F.Butler,C.T.Yeoh,A.I.Cooper and S.P.Rannard,Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,9243-9247；V.Bütün,I.Bannister,N.C.Billingham,D.C.Sherrington and S.P.Armes,Macromolecules 2005,38,4977-4982；I.Bannister,N.C.Billingham,S.P.Armes,S.P.Rannard and P.Findlay,Macromolecules 2006,39,7483-7492；和R.A.Slater,T.O McDonald,D.J.Adams,E.R.Draper,J.V.M.Weaver and S.P.Rannard,Soft Matter 2012,8,9816-9827。本發(fā)明的非凝膠化的和可溶的產(chǎn)物不同于L.A.Connal,R.Vestberg,CJ.Hawker and G.G.Qiao,Macromolecules 2007,40,7855-7863中公開的材料，已知其在凝膠化網(wǎng)絡(luò)中包含多重交聯(lián)。

每個乙烯基聚合物鏈的聚合起始于引發(fā)劑。單官能乙烯基單體的聚合導(dǎo)致線性聚合物鏈。與二官能乙烯基單體的共聚導(dǎo)致鏈之間的支化。為了控制支化和防止凝膠化，每條鏈應(yīng)存在少于一個有效的支化物(二官能乙烯基單體)。在某些條件下，其可以通過使用小于一的支化物與引發(fā)劑的摩爾比實現(xiàn)：這假設(shè)單體(即單官能乙烯基單體)和支化物(即二官能乙烯基單體)具有相同的反應(yīng)性而不存在分子內(nèi)反應(yīng)，支化物的兩個官能團(tuán)具有相同或類似的反應(yīng)性，以及反應(yīng)性即使在部分反應(yīng)之后保持相同。當(dāng)然，體系和條件可以不同，但是技術(shù)人員理解如何控制反應(yīng)和在沒有過度實驗的情況下確定如何實現(xiàn)非凝膠化的結(jié)構(gòu)。例如，在稀釋條件下，一些支化物形成限制鏈之間的支化的支化物的數(shù)目的分子內(nèi)環(huán)，即使反應(yīng)中的支化物與引發(fā)劑(即聚合物鏈)的摩爾比高于1:1。

用于聚合過程的引發(fā)劑和其他試劑如本領(lǐng)域已知的。例如，在ATRP中，方便的和有效的引發(fā)劑包括烷基鹵化物(例如烷基溴化物)，以及在常規(guī)的自由基聚合中，有效的引發(fā)劑包括偶氮化合物。

其他支化聚合物

其他合適類型的支化聚合物包括支化聚酯。可以通過例如單官能的內(nèi)酯單體和二官能的內(nèi)酯單體(支化劑)的開環(huán)聚合制備這些。開環(huán)聚合方法和材料是本領(lǐng)域例如由Nguyen et al.,Polym Chem 2014,5,2997-3008已知的。

支化聚合物相對于線性聚合物和其他可選組分的量

支化聚合物(例如支化乙烯基聚合物)的量可以可選地不大于95wt％、或不大于75wt％、或不大于50wt％、或不大于10wt％、或不大于1wt％。在這方面，wt％表示作為顆粒中的固體材料的總質(zhì)量的百分比的支化乙烯基聚合物的量。支化聚合物的量可以可選地是至少0.1wt％、或至少0.5wt％。例如，支化聚合物的量可以在約0.1wt％和95wt％之間、例如1wt％和10wt％之間。

出乎意料地，我們發(fā)現(xiàn)相對少量的支化聚合物(可選地在一些情況下約1-10wt％)對于能夠引導(dǎo)納米沉淀并使得形成窄分散度的規(guī)則顆粒是有效的。因此，在一些應(yīng)用中，這可以帶來使得他組分(即嵌段共聚物組分或線性樹枝狀雜化物加任何其他組分例如攜帶的材料)的量最大化的益處。

嵌段共聚物組分

嵌段共聚物組分可以包含多種類型的聚合物，包括例如乙烯基聚合物、聚醚(例如PEO或PPO)、聚酯(例如聚己內(nèi)酯或聚乳酸)、聚氨酯、聚酰胺或聚碳酸酯。存在(至少)兩種不同的嵌段。形成每個嵌段的聚合物的類型可以相同或不同，盡管當(dāng)然如果聚合物的類型相同，那么對于區(qū)分單體的嵌段或單體的混合物必須不同。

例如，嵌段共聚物可以包含兩個嵌段，其各自是乙烯基聚合物鏈，其中，組成一個嵌段的乙烯基單體不同于組成另一個嵌段的乙烯基單體。

可替換地，形成每個嵌段的聚合物的類型可以不同。例如，嵌段共聚物可以包含是乙烯基聚合物鏈的一個嵌段和是聚醚鏈或聚酯鏈的第二嵌段。

制備其中一個嵌段是乙烯基鏈的嵌段共聚物的一種方便的已知方式是在乙烯基聚合過程中使用大分子引發(fā)劑，其中，大分子引發(fā)劑包含其他的或另一個嵌段。例如，大分子引發(fā)劑可以是包含PEO或其他聚合物鏈的溴化物引發(fā)劑。在進(jìn)一步的變體中，所述引發(fā)劑可以是二官能的并因此可以允許制備三嵌段共聚物(例如A-B-A嵌段共聚物，其中A是經(jīng)常為疏水性嵌段的乙烯基，以及B是親水性嵌段PEO)。

PEO的分子質(zhì)量可以是例如大于1,000g/mol，例如在1,000和10,000g/mol之間；例如是PEG 2K或PEG 5K。

另一個實例是使用帶有羥基基團(tuán)的聚合物(例如親水性聚合物)作為大分子引發(fā)劑用于開環(huán)聚合(例如環(huán)酯，例如己內(nèi)酯或其他環(huán)狀結(jié)構(gòu))?？梢允褂靡阎拈_環(huán)聚合技術(shù)。

合成二嵌段共聚物的其他方式包括例如一鍋法(one-pot method)，其中首先聚合一種單體(例如乙烯基單體)(通常首先是親水性嵌段，但不是必須的)，然后當(dāng)?shù)谝环磻?yīng)達(dá)到期望的單體轉(zhuǎn)化率時以及在沒有第一嵌段的任何純化的情況下，可以原位添加第二單體(如果第一單體導(dǎo)致親水性嵌段，則其可以例如導(dǎo)致疏水性嵌段)。在每種情況下，添加的單體可以是導(dǎo)致每個嵌段內(nèi)的統(tǒng)計共聚的單體的混合物。

可以使用其他已知的制備嵌段共聚物的方法。

線性樹枝狀雜化物

線性樹枝狀雜化物包含線性聚合物鏈和樹枝狀分子。樹枝狀分子共價附接至聚合物鏈。聚合物鏈可以包含多種類型的聚合物，包括乙烯基聚合物、聚酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚胺脂或聚醚(例如PEO或PPO)。

線性樹枝狀雜化物是由例如F.Wurm,H.Frey,Prog.Polym.Sci.2011,36,1-52的多個文獻(xiàn)已知的。

可以以多種方式并入樹枝狀分子。一種可能的方法將樹枝狀分子用作例如乙烯基聚合中的大分子引發(fā)劑。這使得形成例如具有乙烯基聚合物鏈與鏈末端的樹枝狀分子的線性樹枝狀雜化物。也可以將樹枝狀分子用作鏈轉(zhuǎn)移劑來調(diào)節(jié)和引發(fā)鏈增長聚合。

為了能夠引發(fā)聚合，樹枝狀分子必須帶有合適的反應(yīng)性官能團(tuán)。例如，在ATRP中，在它們的焦點處攜帶鹵化物(例如溴化物)的樹枝狀分子可以充當(dāng)引發(fā)劑。在這種情形下，擴增在樹枝狀分子“楔”的頂點或焦點處開始。技術(shù)人員熟知用于包括ATRP和其他活性或受控聚合以及常規(guī)的自由基聚合的聚合的組分和試劑的類型，并因此用于它們的必須存在于或被引入至樹枝狀分子的類型的官能團(tuán)充當(dāng)引發(fā)劑或鏈轉(zhuǎn)移劑。

例如，將溴基團(tuán)引入至樹枝狀分子的一種可能的方式是用α-溴代異丁酰溴官能化樹枝狀分子醇。然而存在許多官能化樹枝狀分子使得它們可以充當(dāng)引發(fā)劑和鏈轉(zhuǎn)移劑的其他方式以及將引發(fā)聚合的其他類型的官能團(tuán)。樹枝狀分子引發(fā)劑的概念適用于所有合適類型的聚合，并且官能團(tuán)可以根據(jù)需要改變。

并入樹枝狀分子的另一種方法包括使用具有合適的官能團(tuán)(例如-OH基團(tuán))的樹枝狀分子的例如環(huán)狀酯的開環(huán)聚合。

進(jìn)一步的方法將樹枝狀分子用作鏈轉(zhuǎn)移劑用于使用可逆加成裂解鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)的聚合或常規(guī)的自由基聚合。

其他可能的方法包括經(jīng)由鏈端/樹枝狀分子連接，例如通過使用焦點處的硫醇基團(tuán)的聚合物的后官能化。

可以使用本領(lǐng)域已知的用于將樹枝狀分子并入線性樹枝狀雜化物中的其他方法。

關(guān)于可以使用的樹枝狀分子的類型或用于制備樹枝狀分子的化學(xué)過程沒有特別的限制。在一些情形下，期望在表面(即樹枝狀分子的“樹枝”的尖端)具有特定的基團(tuán)，并且可以在樹枝狀分子的合成期間并入這些。樹枝狀分子優(yōu)選地是非乙烯基的。

可以使用任何合適的連接化學(xué)過程來構(gòu)建樹枝狀分子。在一個實施例中，可以例如使用羰基二咪唑?qū)泛痛歼B接在一起。然而，這僅是一個實例，且多種其他連接方法如邁克爾加成化學(xué)過程或熟知的酯化技術(shù)是可能的。

樹枝狀分子可以包含多個部分，包括例如胺(例如在叔胺中心分支的樹枝狀分子，或以NMe₂基團(tuán)封端的樹枝狀分子)、羥基基團(tuán)、酸、羧基基團(tuán)或PEG基團(tuán)。

支化聚合物可以可選地包含醇基團(tuán)。

支化聚合物可以可選地包含胺基團(tuán)。

支化聚合物可以可選地包含羧基基團(tuán)。

嵌段共聚物可以可選地包含醇基團(tuán)。

嵌段共聚物可以可選地包含胺基團(tuán)。

嵌段共聚物可以可選地包含羧基基團(tuán)。

線性樹枝狀雜化物的聚合物鏈可以可選地包含醇基團(tuán)。

線性樹枝狀雜化物的聚合物鏈可以可選地包含胺基團(tuán)。

線性樹枝狀雜化物的聚合物鏈可以可選地包含羧基基團(tuán)。

附圖說明

實施例、附圖和實驗詳述

現(xiàn)將參考以下附圖，通過示例的方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步非限制性詳細(xì)地描述，其中：

圖1示出了支化乙烯基聚合物、二嵌段共聚物、和含有支化乙烯基聚合物和二嵌段共聚物的本發(fā)明的顆粒、以及可用于制備聚合物的一些單體的圖示；

圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的一種可能的共沉淀流程的圖示；

圖3示出了根據(jù)本發(fā)明的一些納米顆粒的SEM圖像；

圖4和5示出了本發(fā)明的顆粒對鹽溶液和隨時間的穩(wěn)定性；

圖6示出了根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒的SEM圖像；

圖7至12示出了負(fù)載藥物的顆粒的粒徑分布；

圖13示出了支化聚合物、線性樹枝狀雜化物、和包含該兩者的兩種不同結(jié)構(gòu)的本發(fā)明的納米顆粒；

圖14至18示出了支化聚合物和線性樹枝狀雜化物的一些組合以及它們的性質(zhì)；

圖19示出了一些納米顆粒的SEM圖像；以及

圖20示出了本發(fā)明的一些納米顆粒對細(xì)胞存活率的影響。

具體實施方式

包含支化聚合物和嵌段共聚物的顆粒

根據(jù)本發(fā)明的一組顆粒是包含支化聚合物和嵌段共聚物的那些。

圖1示出了使用的一些組分的總覽。支化乙烯基聚合物(左上)含有由乙烯基單體形成的直鏈，其通過支化物支化?？梢允褂酶鞣N各樣的乙烯基單體，示出了其中的一些實例(左下)。

如本文所使用的圖1的左下方所示的乙烯基單體和它們的縮寫如下：

‐HPMA：甲基丙烯酸羥基丙基酯。示出了甲基丙烯酸2-羥基丙基酯，盡管本發(fā)明不僅可以單獨利用該異構(gòu)體而且可選地可以利用可商購的該異構(gòu)體和甲基丙烯酸2-羥基異丙基酯的混合物或單獨的后者。

‐nBuMA：甲基丙烯酸正丁酯

‐苯乙烯

‐tBuMA：甲基丙烯酸叔丁酯

‐DEAEMA：N,N-二乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯，與上述單體相比是親水性的單體和pH響應(yīng)的。

如圖1所指出的，可以使用單體的組合，例如HPMA和nBuMA或HPMA和tBuMA。

使用的其他材料包括以下，也在圖1中示出：

‐EBIB：α-溴代異丁酸乙酯，通常用于引發(fā)聚合的引發(fā)劑。

‐EGDMA：二甲基丙烯酸乙二醇酯，合適的支化物

‐PEG 2K或PEG 5K：大小2K或5K的聚氧化乙烯(盡管當(dāng)然其他大小也是可能的)，其是溴官能化的使得其可以充當(dāng)用于乙烯基聚合的大分子引發(fā)劑。由于存在于聚氧化乙烯(PEO)中的氧化乙烯基團(tuán)的數(shù)目，PEG 2K還稱為PEO₄₅以及PEG 5K還稱為PEO₁₁₄。

也可以使用其他單體、支化物、引發(fā)劑和其他材料，包括：

‐BDME，1,4-丁二醇二(甲基丙烯酰氧基)-乙基醚，pH響應(yīng)支化物

示出了長度變化的二嵌段共聚物(中上)：這些可以例如具有由選自示出的那些的乙烯基單體(例如HPMA)形成的一個嵌段和不同化學(xué)過程(例如聚氧化乙烯)的第二嵌段。一種可能的制備流程將溴官能化的聚氧化乙烯(例如PEG 2K或5K)(圖1，右下)用作用于乙烯基聚合的大分子引發(fā)劑。得到的兩親性二嵌段共聚物可以與支化乙烯基聚合物共沉淀以形成右上示意性示出的顆粒。在該實例中，示出嵌段共聚物的親水性聚氧化乙烯鏈在顆粒的外側(cè)，如在含水體系中的情況。

如圖2所示，可以例如通過將合適的有機溶劑中的兩種聚合物添加到水中，然后使有機溶劑蒸發(fā)來進(jìn)行共沉淀。

支化乙烯基聚合物(聚-HPMA-EGDMA)與兩親性二嵌段共聚物(一個嵌段是PEG 5K或PEG 2K，以及另一個是HPMA₄₀、HPMA₈₀或HPMA₁₂₀)以多種比率的共沉淀的粒徑(動態(tài)光散射尺寸)和多分散系數(shù)(PDI)值在下表中示出。

可以看出在這些實例中，共納米沉淀顆粒的尺寸(z均直徑)在90至230nm的范圍，且自始至終存在較窄的PDI值，示出它們的一致性和均一性。

SEM示出了納米顆粒的尺寸和球形性質(zhì)。圖3示出了一些實例：支化乙烯基聚合物(聚-HPMA-EGDMA)與PEG 5K-HPMA₁₂₀以比率80:20(上)和90:10(中)以及與PEG 2K-HPMA₁₂₀以比率50:50(下)的共沉淀。

圖4示出了多種顆粒對鹽溶液(0.5M NaCl)的穩(wěn)定性?！翱瞻住北硎驹谔砑欲}之前，“瞬時”為添加鹽之后馬上、且1、7和21為添加鹽之后的天數(shù)。顆粒表現(xiàn)出相當(dāng)大的鹽穩(wěn)定性，這對于用于生理環(huán)境是重要的。之前僅由單獨的支化乙烯基聚合物形成的顆粒的實例示出在鹽存在下是不穩(wěn)定的(Slater et al,Soft Matter 2012,8,9816-9827)。

以下實施例提供了含有疏水性核和兩親性二嵌段穩(wěn)定劑的一些納米顆粒的更多細(xì)節(jié)。

實施例1：包含支化的疏水性核聚合物和直鏈兩親性二嵌段共聚物的納米顆粒

聚合物的制備

將ATRP用于合成直鏈PEO₄₅-p(HPMA₁₂₀)以及EGDMA和HPMA p(HPMA₅₀-EGDMA_0.9)的支化統(tǒng)計共聚物。通過三重探測(triple detection)凝膠滲透色譜法(GPC)和¹H NMR分析聚合物。將苯甲醚用作內(nèi)標(biāo)通過¹H NMR監(jiān)測單體至聚合物的轉(zhuǎn)化率。

在30℃下甲醇中的一步ATRP反應(yīng)期間合成直鏈兩親性嵌段共聚物。為了引入親水性嵌段，以以下比率[大分子引發(fā)劑]:[單體]:[Cu(I)Cl]:[Bpy]＝1:120:1:2將PEO45-Br大分子引發(fā)劑(2kDa)與催化體系Cu(I)Cl/2,2’-雙吡啶(Bpy)添加到HPMA中。目標(biāo)的數(shù)均聚合度(DP_HPMA)是120HPMA單體單元且GPC確認(rèn)了數(shù)均DP_HPMA＝127單體單元(M_n＝20300Da)，具有較窄的分散性

使用之前描述的催化體系以以下比率[大分子引發(fā)劑]:[EGDMA]:[單體]:[Cu(I)Cl]:[Bpy]＝1:0.9:50:1:2用2-溴代異丁酸乙酯(EBIB)引發(fā)HPMA和EGDMA的支化統(tǒng)計共聚。[EGDMA]/[EBIB]<1的摩爾比是重要的參數(shù)以對支化反應(yīng)具有控制和避免凝膠化。如預(yù)期的，與顯示出單峰窄分子量分布的直鏈兩親性聚合物形成對比，存在的EGDMA顯著增加聚合物分子量(例如M_w＝295,000Da)和分散性另外，直鏈PEO₄₅-p(HPMA₁₂₀)和支化p(HPMA₅₀-EGDMA_0.9)兩者的¹H NMR分析示出高的單體轉(zhuǎn)化率(>98％)。

納米沉淀和共納米沉淀

通過納米沉淀制備聚合物納米顆粒，納米沉淀對應(yīng)于通過快速的沉淀反應(yīng)將溶劑轉(zhuǎn)換為水(環(huán)境溫度)。假設(shè)在p(HPMA₅₀-EGDMA_0.9)疏水支化核的結(jié)合期間，來自二嵌段共聚物的直鏈HPMA鏈也變得并入疏水核，使得PEO₄₅(2kDa)鏈存在于得到的顆粒的表面上并通過立體穩(wěn)定化防止聚合。將重量分?jǐn)?shù)變化的p(HPMA₅₀-EGDMA_0.9)_x：PEO₄₅-p(HPMA₁₂₀)_y(x:y)以5mg mL^-1的總濃度溶解在丙酮中六個小時以確保完全溶解。1mL聚合物溶液至5mL水的快速沉淀給出丙酮完全蒸發(fā)之后1mg mL^-1的最終的納米顆粒濃度。通過動態(tài)光散射(DLS)和掃描電子顯微(SEM)分析納米顆粒分散體。將得到的z均直徑(nm)、多分散系數(shù)(PDI)、ζ電位(mV)和數(shù)均直徑(nm)收集在下表中。

表.通過共納米沉淀p(HPMA₅₀-EGDMA_0.9)、PEO₄₅-p(HPMA₁₂₀)和p(HPMA₅₀-EGDMA_0.9)_x:PEO₄₅-p(HPMA₁₂₀)_y(x:y)丙酮溶液到水中得到的納米顆粒的DLS和SEM表征

支化p(HPMA₅₀-EGDMA_0.9)和兩親性PEO₄₅-p(HPMA₁₂₀)聚合物在從丙酮至H₂O的共納米沉淀期間的自組裝產(chǎn)生界限分明的顆粒，這通過分別由DLS測量和SEM觀察得到的低PDI值(0.046-0.107)和尺寸均勻性指出。

共納米沉淀的顆粒表現(xiàn)出-19mV和-25mV范圍的ζ電位值(表1，項目3-7)。

鹽穩(wěn)定性

通過添加等份(20μL)的含水0.5M NaCl鹽溶液到1mL的納米沉淀的分散體中表明共沉淀的顆粒的鹽穩(wěn)定性。在0-21天期間測量z均直徑和PDI。

共納米沉淀的顆粒表明優(yōu)異的在添加20μL之后的21天內(nèi)的鹽穩(wěn)定性和窄多分散性的保持。僅包含支化乙烯基聚合物的納米顆粒在添加NaCl時立即從溶液中析出，而包含支化乙烯基聚合物和二嵌段兩親性共聚物兩者的納米顆粒保持為穩(wěn)定的納米顆粒分散體。納米顆粒(0.1mg mL^-1)的SEM分析示出顆粒和由顆粒的組組成的共納米沉淀的球形性質(zhì)。

圖5示出了在添加NaCl(20μL 0.5M NaCl)至p(HPMA₅₀-EGDMA_0.9):PEO₄₅-p(HPMA₁₂₀)60:40的1mg mL^-1含水分散體時z均直徑和PDI是如何變化的?？v軸表示強度(百分比)且橫軸示出了z均直徑(d，nm)。實線：添加之前。短劃線：緊接添加NaCl之后。點線：添加NaCl之后21天。

圖6示出了p(HPMA₅₀-EGDMA_0.9):PEO₄₅-p(HPMA₁₂₀)60:40；1mg mL^-1的掃描電子顯微圖像。

實施例1的結(jié)論

實施例1示出以低濃度添加兩親性二嵌段“穩(wěn)定劑”(PEO 2000Da)至支化疏水性聚合物，隨后共納米沉淀可以形成具有期望的z均直徑和非常窄的PDI值的顆粒?？梢灾苽涓鞣N各樣的共納米沉淀的顆粒。共納米沉淀的顆粒由于引入了立體穩(wěn)定劑而提供增強的穩(wěn)定性。這依賴于防止顆粒變得極為貼近的材料的外層的形成。

HIV抗病毒劑的負(fù)載

研究了納米顆粒負(fù)載包含以下HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的多種藥物的用途：

依法韋侖(Efavirenz)：

洛匹那韋(Lopinavir)：

利托那韋(Ritonavir)：

可以以可靠的和可再現(xiàn)的方式將藥物包封在聚合物顆粒內(nèi)，使得產(chǎn)生具有非常窄的粒徑分布的顆粒。

發(fā)現(xiàn)在疏水核中使用支化乙烯基聚合物與兩種單體[HPMA加甲基丙烯酸叔丁酯(tBMA)或甲基丙烯酸正丁酯(nBMA)中的任一種]的共混物在允許要實現(xiàn)的高藥物負(fù)載中是特別有效的。當(dāng)將nBMA用作支化乙烯基聚合物中的唯一單官能單體時也得到了良好的結(jié)果。

在圖7至12中示出了結(jié)果如下：

圖7-12中所示的利用為形成顆粒的嵌段共聚物是PEG 5K-HPMA₁₂₀并且支化聚合物與直鏈聚合物的比率是50:50。

可以通過進(jìn)一步使聚合物化學(xué)過程適于使得對依法韋侖實現(xiàn)25wt％的藥物負(fù)載來增加藥物負(fù)載。負(fù)載藥物的顆粒穩(wěn)定延長的時間。研究了不同藥物類型的負(fù)載的進(jìn)一步的實驗以及這些的細(xì)節(jié)(以及在這方面的聚合物合成和共納米沉淀)如下。

包含10wt％依法韋侖、利托那韋和洛匹那韋負(fù)載的一般的納米顆粒制備

在一般的納米顆粒制備期間，將5.5mL的依法韋侖、利托那韋或洛匹那韋的1mg/mL丙酮溶液添加到小瓶中并靜置蒸發(fā)整夜。將25mg的支化聚合物和25mg的二嵌段聚合物添加到該小瓶中并在6-8小時期間將其溶解在10mL丙酮中以確保完全溶解。將1mL的聚合物和溶解藥物的5mg/mL溶液添加到5mL的攪拌蒸餾水(500rpm)中并靜置24小時用于完全蒸發(fā)丙酮(聚合物的最終濃度是1mg/mL)。

抗癌藥物

可以合并的藥物的其他實例是抗癌藥物。

伊立替康(Irinotecan)是疏水性抗癌藥物以及SN-38是伊立替康的疏水性抗癌活性代謝物。

特別地，將伊立替康以10wt％或15wt％有效包封在具有低PdI值的共納米沉淀的顆粒中，例如其中，支化聚合物包含nBMA或tBMA-HPMA且兩親聚合物包含PEG5K-HPMA120。

伊立替康(一般10wt％負(fù)載)

在一般的納米顆粒制備期間，將5.5mL的伊立替康的1mg/mL丙酮溶液添加到小瓶中并靜置蒸發(fā)整夜。將25mg的支化聚合物和25mg的聚合物二嵌段添加到該小瓶中并在6-8小時期間將其溶解在10mL丙酮中以確保完全溶解。將1mL的聚合物和溶解藥物的5mg/mL溶液添加到5mL的攪拌中的(500rpm)水中并靜置24小時用于完全蒸發(fā)丙酮。

SN-38(一般2wt％負(fù)載)

在一般的納米顆粒制備期間，將1.03mL的SN-38的1mg/mL的THF/乙腈(50:50)溶液添加到小瓶中并靜置蒸發(fā)整夜。將25mg的支化聚合物核和25mg的聚合物二嵌段添加到該小瓶中并在6-8小時期間將其溶解在10mL丙酮中以確保完全溶解。將1mL的聚合物和溶解的藥物的5mg/mL溶液添加到5mL的攪拌中的(500rpm)水中并靜置24小時用于完全蒸發(fā)丙酮。

通過DMSO透析制備SN-38納米顆粒

在通過透析的一般的納米顆粒制備期間，添加2.65mL的SN-38的1mg/mL DMSO溶液、25mg的支化聚合物核和25mg的聚合物二嵌段，并在6-8小時期間將其溶解在7.35mL的DMSO中以確保完全溶解。將1mL的聚合物的5mg/mL溶液添加到具有2000g/mol截留分子量(MWCO)的透析袋中，并置于蒸餾水中透析4天(每4小時換水)。

ATRP聚合-支化聚合物核p(HPMA_50-EGDMA_0.9)的形成

目標(biāo)的數(shù)均聚合度(DP_n)是50重復(fù)單元。在一般的ATRP合成期間，將EBIB引發(fā)劑(0.14g,0.69mmol 1eq.)和HPMA(5g，34.68mmol 50eq.)添加到配備有氮氣入口/出口和攪拌棒的圓底燒瓶中。添加甲醇(基于HPMA，50wt/wt％)，并在氮氣下強力攪拌溶液10-15分鐘。將支化劑EGDMA(0.12g，0.62mmol，0.9eq.至EBIB引發(fā)劑)、銅催化劑Cu(I)Cl(0.069g，0.69mmol 1eq.)和bpy(0.22g，1.39mmol 2eq.)添加到燒瓶中并將溫度固定在30℃。通過¹H NMR質(zhì)譜監(jiān)測反應(yīng)，并當(dāng)HPMA單體達(dá)到>99％轉(zhuǎn)化率時用甲醇終止反應(yīng)。使用Dowex Marathon交換珠(～12g)純化聚合物以除去過量的銅催化劑，隨后使樣品通過堿性氧化鋁柱。在沉淀到冷的己烷中之前，在真空下除去過量的THF以濃縮樣品。通過在MeOD中的¹H NMR、使用THF洗脫液的三重探測GPC確認(rèn)得到的聚合物。

對所有其他單體：nBMA p(nBMA₅₀-EGDMA_0.9)、tBMA p(tBMA₅₀-EGDMA_0.9)、HPMA-nBMA p(HPMA₂₅-nBMA₂₅-EGDMA_0.9)和HPMA-tBMA p(HPMA₂₅-tBMA₂₅-EGDMA_0.9)進(jìn)行聚合

聚(乙二醇)單官能ATRP大分子引發(fā)劑(PEO_x-Br)(當(dāng)x＝45時，大分子引發(fā)劑在本文中稱為PEG 2K)的實例合成

在一般的合成中，在裝有添加漏斗、氮氣入口/出口和攪拌棒的兩頸圓底燒瓶中在三乙胺(2.275g，22.5mmol，1.5eq.)和4-二甲基氨基吡啶(0.092g，0.75mmol 0.05eq.)的存在下將PEO₄₅-OH(30g，15mmol，1eq.)溶解在100mL的甲苯中。將用25mL甲苯稀釋的2-溴-2-甲基丙酰溴(5.175g，22.5mmol，1.5eq.)置于添加漏斗中。將反應(yīng)器置于攪拌下，在約0℃下的冰浴中冷卻，并在20-30min期間緩慢添加2-溴-2-甲基丙酰溴溶液。完成添加之后，使反應(yīng)器達(dá)到室溫并置于攪拌下24小時。白色沉淀(三乙胺鹽)的形成表示反應(yīng)進(jìn)程。然后，在約50℃的水浴中使反應(yīng)介質(zhì)變熱，過濾并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。將得到的產(chǎn)物稀釋在丙酮中并通過在石油醚中的沉淀來純化。重復(fù)一次上一步驟，并最終在40℃下在真空下干燥產(chǎn)物24小時。以70％產(chǎn)率回收的得到的大分子引發(fā)劑，并通過在D₂O中的¹H NMR、使用DMF的洗脫液的三重探測GPC和MALDI-TOF質(zhì)譜分析確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。

PEG 5K

PEO-5K引發(fā)劑的相同合成-使用PEO₁₁₄-OH而不是PEO₄₅-OH。

ATRP聚合-直鏈PEO₄₅-p(HPMA₁₂₀)的合成

目標(biāo)的數(shù)均聚合度(DP_n)是120重復(fù)單元。在一般的ATRP合成中，將PEO₄₅-Br大分子引發(fā)劑(0.62g，0.29mmol 1eq.)和HPMA(5g，34.68mmol 120eq.)添加到配備有氮氣入口/出口和攪拌棒的圓底燒瓶中。添加甲醇(基于HPMA，33.5w/v％)，并在氮氣下強力攪拌溶液10-15分鐘。將銅催化劑Cu(I)Cl(0.029g，0.29mmol 1eq.)和bpy(0.09g，0.58mmol2eq.)添加到燒瓶中并將溫度固定在30℃。通過¹H NMR質(zhì)譜監(jiān)測反應(yīng)，并當(dāng)HPMA單體達(dá)到>99％轉(zhuǎn)化率時用甲醇終止反應(yīng)。使用Dowex Marathon交換珠(～12g)純化聚合物以除去過量的銅催化劑，隨后使樣品通過堿性氧化鋁柱。在沉淀至石油醚30/40之前，在真空下除去過量的THF以濃縮樣品。通過在d₆-DMSO中的¹H NMR、使用DMF洗脫液的三重探測GPC確認(rèn)得到的聚合物。

上述流程適用于所有其他的對于HPMA以及PEO5K-nBMA120的ATRP的數(shù)均聚合度。

其他藥物和其他藥物并入方法

本發(fā)明還與許多其他藥物以及并入藥物的其他方法相容，并入藥物的其他方法不僅包括如之前所述的包封而且包括化學(xué)鍵合(有時稱為配合)至支化聚合物或直鏈聚合物中的任一種或顆粒的兩種組分。

在這方面，將布洛芬用作模型藥物。包封游離的布洛芬，且其還經(jīng)由其酸官能團(tuán)鍵合以產(chǎn)生前體藥物模型。

布洛芬作用-前體藥物模型

布洛芬(IBU)改性的HPMA(IbuPMA)的合成

在一般的合成期間，將HPMA(1.5g，10.40mmol 1eq.)、布洛芬(2.79g，13.53mmol 1.3eq)、DMAP(0.64g，5.5mmol，0.5eq)和DCC(2.79g，13.53mmol，1.3eq)溶解在圓底燒瓶中的40mL THF中并在環(huán)境溫度下攪拌24小時。過濾DCU鹽并用THF洗滌，隨后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。添加DCM(100mL)并用1M硫酸氫鈉溶液洗滌以除去過量的DCU，然后在MgSO4上干燥，在真空中濃縮并在0℃下存儲。

ATRP聚合-并入的IBU單體：目標(biāo)總計DP80

組合物PEO₁₁₄-p(HPMA₆₀-IbuPMA₂₀)

目標(biāo)的數(shù)均聚合度(DP_n)是HPMA₆₀-IbuPMA₂₀。將PEO114-Br大分子引發(fā)劑(0.59g，0.12mmol 1eq.)和HPMA(1g，6.94mmol 60eq.)和IbuPMA(0.77g 2.3mmol，20eq.)添加到配備有氮氣入口/出口和攪拌棒的圓底燒瓶中。添加甲醇(基于HPMA+IbuPMA，37w/w％)，并在氮氣下強力攪拌溶液10-15分鐘。將銅催化劑Cu(I)Cl(0.0114g，0.12mmol1eq.)和bpy(0.036g，0.23mmol 2eq.)添加到燒瓶中并將溫度固定在30℃。通過¹H NMR質(zhì)譜監(jiān)測反應(yīng)，并當(dāng)單體達(dá)到99％轉(zhuǎn)化率時用甲醇終止反應(yīng)。使用中性氧化鋁柱純化聚合物，用THF沖洗以除去過量的銅催化劑。在沉淀至冷石油醚30/40之前，在真空下除去過量的THF以濃縮樣品。通過在MeOD中的¹H NMR、使用THF洗脫液的三重探測GPC確認(rèn)得到的聚合物。

改性后的PEO₁₁₄-HPMA₁₂₀-目標(biāo)40HPMA單體單元

將PEO₁₁₄-HPMA₁₂₀(1g，0.033mmol，1eq.)、布洛芬(0.27g，1.33mmol，40eq.)、DCC(0.274g，1.33mmol，40eq.)和DMAP(1x10-³g)溶解在THF(12mL)中并靜置24小時。濾出DCU并用THF洗滌，和在真空中濃縮。將過量的DMAP和DCU溶解在DCM中，以及用1M硫酸氫鈉洗滌和用MgSO₄干燥并在真空下干燥。

ATRP聚合-支化IBU改性的共聚物p(HPMA₆₀-IBU₂₀-EGDMA_0.9)

目標(biāo)的聚合度(DP_n)是50重復(fù)單元。在一般的ATRP合成中，將EBIB引發(fā)劑(0.024g，0.12mmol 1eq.)和HPMA(1.04g，7.23mmol 60eq.)和IbuPMA(0.8g，2.41mmol，20eq.)添加到配備有氮氣入口/出口和攪拌棒的圓底燒瓶中。添加甲醇(基于HPMA，50wt/wt％)，并在氮氣下強力攪拌溶液10-15分鐘。將支化劑EGDMA(0.021g，0.11mmol 0.9eq.至EBIB引發(fā)劑)、銅催化劑Cu(I)Cl(0.012g，0.12mmol 1eq.)和bpy(0.038g，0.24mmol 2eq.)添加到燒瓶中并將溫度固定在30℃。通過¹H NMR質(zhì)譜監(jiān)測反應(yīng)，并當(dāng)HPMA單體達(dá)到>99％轉(zhuǎn)化率時用甲醇終止反應(yīng)。使用中性的氧化鋁柱純化聚合物，用THF沖洗。在沉淀之前，在真空下除去過量的THF以濃縮樣品。將聚合物從MeOH沉淀到冷的石油醚30/40中。通過在MeOD中的¹H NMR、用THF洗脫液的三重探測GPC確認(rèn)得到的聚合物。

納米顆粒制備

IBU改性的二嵌段–p(EO)₁₁₄-p(HPMA₆₀-HPMA:IBU₂₀):p(HPMA₅₀-EGDMA_0.9)

在一般的納米顆粒制備中，在6-8小時期間將25mg的PEO₁₁₄-p(HPMA₆₀-HPMA:IBU₂₀)和25mg的p(HPMA₅₀-EGDMA_0.9)添加到10mL的甲醇中以確保在6-8小時內(nèi)完全溶解。將1mL的聚合物的5mg/mL溶液添加到5mL的攪拌中的(500rpm)蒸餾水中并靜置24小時用于完全蒸發(fā)。

IBU改性的支化聚合物核p(HPMA₆₀-IBU₂₀-EGDMA_0.9)

在一般的納米顆粒制備過程中，在6-8小時期間將25mg的PEO₁₁₄-p(HPMA₁₂₀)和25mg的p(HPMA₆₀-IbuPMA₂₀-EGDMA_0.9)添加到10mL的甲醇中以確保在6-8小時內(nèi)完全溶解。將1mL的聚合物的5mg/mL溶液添加到5mL的攪拌中的(500rpm)蒸餾水中并靜置24小時用于完全蒸發(fā)。

可以使用以上實驗對納米顆粒的其他變體重復(fù)相同流程。對于游離的IBU添加，可以在溶解之前以期望的比率將其簡單地添加到甲醇中以得到顆粒內(nèi)包封的IBU和IBU-前體藥物的混合物。

示出可以制備不同類型的嵌段共聚物-三嵌段A-B-A(疏水-親水-疏水)聚合物并將其與支化聚合物和藥物包封組合使用的進(jìn)一步的實施例

為了示出在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以使用的化學(xué)過程的變體，制備雙官能引發(fā)劑并將其用作“A-B-A”三嵌段共聚物的制備中的“B”嵌段。然后將三嵌段共聚物與支化乙烯基聚合物和藥物分子組合使用以形成合適的共納米沉淀的顆粒。

PEG雙官能大分子引發(fā)劑的合成

在一般的合成期間，將OH-PEG₁₀₄-OH(M_n～4600g，1當(dāng)量，20g，4.3mmol)、TEA(3當(dāng)量，0.013mol，1.83mL)和DMAP(0.1當(dāng)量，4.0mmol，0.053g)添加到配備有氮氣入口/出口和攪拌棒的兩徑圓底燒瓶中的甲苯(80mL)中。將α-溴代異丁酰溴(3當(dāng)量，13mmol，1.61mL)稀釋在甲苯(20mL)中，并在15分鐘內(nèi)經(jīng)由滴液漏斗逐滴添加，并置于攪拌下24小時。然后過濾反應(yīng)混合物并在真空中除去過量的溶劑。將產(chǎn)物溶解在最少量的丙酮中，沉淀至40-60℃的冷石油醚(1:10產(chǎn)物：溶劑)并使其在40℃下在真空中干燥48小時。

p(HPMA_x-嵌段-PEG₁₀₄-嵌段-HPMA_x)嵌段聚合物的合成

在一般的合成期間，將Br-PEG₁₀₄-Br(1當(dāng)量，2.17g，0.43mmol，HPMA(80當(dāng)量，5.0g，34.6mmol)、苯甲醚(0.1ml)和無水甲醇(50wt％)添加到配備有氮氣入口/出口和攪拌棒的圓底燒瓶中。將無水甲醇(基于HPMA，50wt％)、CuCl(1當(dāng)量，0.042g，0.43mmol)和bpy(2當(dāng)量，0.135g，0.867mmol)添加到該溶液中，并在氮氣下脫氣反應(yīng)混合物15-20分鐘。將反應(yīng)置于攪拌下24小時并通過¹H NMR譜確認(rèn)高轉(zhuǎn)化率。通過添加甲醇(～50ml))終止反應(yīng)，然后使剩余溶液通過中性的氧化鋁柱以除去催化體系。通過在真空中濃縮溶液來純化產(chǎn)物并將聚合物沉淀到冷的己烷(1:10產(chǎn)物：溶劑)中。通過¹H NMR和GPC分析得到的嵌段共聚物。

如之前所描述的合成支化p(DEAEMA₅₀)聚合物。

藥物分子至由A-B-A三嵌段和支化聚合物核組成的共納米沉淀的顆粒中的包封

將溶解的藥物分子(利托那韋和洛匹那韋)的儲備溶液添加到樣品小瓶(每個最高達(dá)5wt％)，并使丙酮蒸發(fā)蒸發(fā)。將支化聚合物、A-B-A三嵌段聚合物(每種的比率變化)和丙酮添加到該小瓶中以組成5mg/mL的溶液。為了確保完全溶解，是該溶液翻轉(zhuǎn)24小時。在一般的共納米沉淀過程中，將1mL的聚合物/藥物溶液添加到5mL的攪拌中的水中。使溶液攪拌整夜以確保完全除去溶劑，以及隨后通過動態(tài)光散射測量納米顆粒分散體。

得到穩(wěn)定的納米顆粒，無論是包封單獨的利托那韋、單獨的洛匹那韋還是兩者的按重量計1:1的混合物。

包含支化聚合物和直鏈樹枝狀雜化物的顆粒

根據(jù)本發(fā)明的第二組顆粒是包含支化聚合物和直鏈樹枝狀雜化物的那些。

通過ATRP制備的聚合物和這種聚合物在顆粒中的組合的實例

以上已經(jīng)描述和限定了用于支化乙烯基聚合物和嵌段共聚物的組分的一些非限制性實例。

直鏈樹枝狀雜化物可以包含如以上提及的單體，以及另外地當(dāng)然包含樹枝狀分子。在此背景下，用于本發(fā)明的聚合物的組分的一些非限制性實例包括以下。

‐G2-M：具有以下結(jié)構(gòu)的2代樹枝狀分子引發(fā)劑：

‐G2-Bz：具有以下結(jié)構(gòu)的具有芐基官能化的末端的2代樹枝狀分子引發(fā)劑：

‐G1-M：具有以下結(jié)構(gòu)的1代樹枝狀分子引發(fā)劑：

‐G0-M：具有以下結(jié)構(gòu)的0代引發(fā)劑：

圖13示出了支化聚合物和直鏈樹枝狀雜化物的共納米沉淀的圖示。樹枝狀分子示出為楔。在一些實施例中(右上)，假設(shè)樹枝狀分子至少部分在顆粒內(nèi)，而在其他實施例中(右下)，假設(shè)樹枝狀分子主要暴露在表面上。當(dāng)使用pH響應(yīng)材料如DEAEMA時，這可以通過改變pH控制。

圖14至18中示出了聚合物的組合和在不同pH條件下得到的顆粒的性質(zhì)的一些實例。圖14至18使用縮寫CNP，其表示共納米沉淀。圖19示出了包含EBIB tBuMA-EGDMA和G2-M DEAEMA(圖14)的pH 7.8顆粒的SEM圖像。

^a作為如由動態(tài)光散射測量的z均值給出所有直徑。

^b作為如由動態(tài)光散射測量的表面電荷值給出所有ζ電位。

支化乙烯基聚合物和直鏈樹枝狀雜化物的組合的進(jìn)一步實例

通過ATRP制備的支化乙烯基聚合物和直鏈樹枝狀雜化物的組合的進(jìn)一步實例包括下表中所列的那些。這舉例說明了一些化學(xué)性質(zhì)(包括親水、疏水和pH響應(yīng))和不同的共聚物方式(包括嵌段共聚物和統(tǒng)計共聚物)。還將看出將嵌段共聚物方式可以與直鏈樹枝狀雜化物方式組合，即直鏈樹枝狀雜化物可以包含連接到一個嵌段，然后連接到另一個嵌段的樹枝狀分子。此外，代替G2-M或G2-Bz，可以使用G1-M、G0-M或EBIB，即可以通過較小的樹枝狀分子或通過非樹枝狀分子(在這樣情況下，與支化乙烯基聚合物共沉淀的材料不是直鏈樹枝狀雜化物而僅是直鏈聚合物，本發(fā)明涉及其的子集，即嵌段共聚物)的引發(fā)劑引發(fā)直鏈。

上表中的材料可以是例如以90:10支化:直鏈來共納米沉淀的。一個合適的方法包括：將0.2ml(在丙酮、THF或IPA中5mg ml^-1)直鏈聚合物和1.8ml(在丙酮、THF或IPA中5mg ml^-1)支化聚合物滴入10mL水中；以及使有機溶劑蒸發(fā)整夜以形成1mg ml^-1的納米顆粒在水中的分散體。

可以使用一定范圍的pH，以及可選地可以選擇條件和單體來提供特定的結(jié)構(gòu)。僅通過非限制性示例的方式，在低pH下胺部分(例如在DEAEMA或在樹枝狀分子中)的質(zhì)子化是指胺部分更可能向顆粒外暴露。

通過開環(huán)聚合制備的聚合物和顆粒中的這種聚合物的實例

本發(fā)明中可以使用的另一種聚合方法是開環(huán)聚合(ROP)。例如，可以在本領(lǐng)域已知的合適條件下通過與醇反應(yīng)使內(nèi)酯單體開環(huán)。

例如，通過芐醇可以引發(fā)己內(nèi)酯單體的聚合來產(chǎn)生芐基-聚己內(nèi)酯(本文中縮寫為Bz-PCL)。

單種內(nèi)酯環(huán)如聚己內(nèi)酯的開環(huán)導(dǎo)致直鏈聚合物。

通過使用支化物，例如具有連接在一起的兩個內(nèi)酯環(huán)的單體，例如BOD(4,4’-二環(huán)氧己烷基-7,7’-二酮)可以得到支化聚合物。以下方案示出了制備BOD的方法：

可以通過使用引發(fā)劑(例如Bz-OH))共聚單官能的內(nèi)酯(例如己內(nèi)酯)和二官能的內(nèi)酯(例如BOD)制備支化聚酯。

可以將這種支化聚已酸內(nèi)酯代替支化乙烯基聚合物與直鏈聚合物(即嵌段共聚物或直鏈樹枝狀雜化物)組合使用。

支化聚己內(nèi)酯(通過ROP制備)和我們已經(jīng)共納米沉淀的直鏈樹枝狀雜化物(通過ATRP制備)的組合的實例包括下表中所列的那些。如之前的，代替G2，可以替代使用G1、G0或EBIB。

還可以將ROP用于制備直鏈樹枝狀雜化物(或其他直鏈聚合物組分)，并可以組合ROP和ATRP。

可以在直鏈樹枝狀雜化物中使用聚酯，并且在此背景下用于ROP的合適引發(fā)劑的非限制性實例包括以下。

‐G2-pOH：以下結(jié)構(gòu)的帶有羥基基團(tuán)以引發(fā)ROP的2代樹枝狀分子：

‐G1-pOH：以下結(jié)構(gòu)的帶有羥基基團(tuán)以引發(fā)ROP的1代樹枝狀分子：

‐G0-pOH：以下結(jié)構(gòu)的0代引發(fā)劑：

可以與例如Bz-PCL₅₀-BOD_0.6的支化聚合物組合的直鏈樹枝狀雜化物的實例包括：

‐G1-p-PCL₅₀-DEAEMA₂₀

‐G2-p-PCL₅₀

‐G2-p-PCL₃₀

‐G2-p-PCL₂₀

用于ATRP和ROP聚合和用于制備在這些聚合中使用的材料的示例實驗流程

1.通過ATRP的聚合

1.1 ATRP樹枝狀分子引發(fā)劑合成

1.1.1 G1-M-OH的合成

將2-(二甲基氨基)乙基丙烯酸酯(6.0g，42mmol，6eq.)添加到包含異丙醇(IPA)(12mL)的50mL圓形2頸圓底燒瓶中。在正向N₂吹掃下將燒瓶脫氧10分鐘。逐滴添加溶解在IPA(12mL)中的1-氨基-2-丙醇(0.5246g，7.0mmol，1eq.)，同時在正向N₂流下在冰浴中攪拌溶液。在0℃下攪拌最終的混合物另外的10分鐘，之后使其溫暖至室溫并攪拌48小時。除去溶劑并使產(chǎn)物在真空中干燥整夜。測量的C,57.45；H,9.77；N,11.12％。C₁₇H₃₅N₃O₅要求,C,56.43；H,9.68；N,11.62％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.08(d,3H),2.18-2.62(m,22H),2.69(m,2H),2.89(m,2H),3.77(m,1H),4.16(m,4H)。¹³C NMR(100MHz,CDCl3)δ19.8,32.6,45.6,49.7,57.8,62.0,63.7,76.9,128.4,130.9,172.5。m/z(ES MS)362.3[M+H]+,384.3[M+Na]+。

1.1.2 G2-M-OH的合成

將2-(二甲基氨基)乙基丙烯酸酯(6.0g，42mmol，6eq.)添加到包含IPA(12mL)的50mL圓形2頸圓底燒瓶中。在正向N₂吹掃將燒瓶脫氧10分鐘。逐滴添加溶解在IPA(12mL)中的雙(3-氨基丙基)氨基)丙-2-醇(1.3221g，6.984mmol，1eq.)，同時在正向的N₂流下在冰浴中攪拌溶液。在0℃下攪拌最終的混合物另外的10分鐘，使其溫暖至室溫并攪拌48小時。除去溶劑并在使產(chǎn)物在真空中干燥整夜。測量的C,58.32；H,9.92；N,12.87％。C₃₇H₇₅N₇O₉要求,C,58.27；H,9.84；N,12.86％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.13(d,3H),1.67(m,4H),2.26-2.65(m,50H),2.77(m,8H),3.87(m,1H),4.17(m,8H)。m/z(ES MS)762.6[M+H]+,784.6[M+Na]+。

1.1.3 G0-M的合成

將1-二甲基氨基-2-丙醇(1.1207g，10.86mmol，1eq.)、三乙醇胺(TEA)(1.5390g，15.2mmol，1.4eq.)和二甲基氨基吡啶(DMAP)(132.7mg，1.086mmol，0.1eq.)添加到包含二氯甲烷(DCM)(160mL)的250mL的2頸圓底燒瓶中。在正向的N₂吹掃下使燒瓶脫氧10分鐘。逐滴添加α-溴代異丁酰溴(2.622g，1.4mL，11.4mmol，1.05eq.)，同時在正向的N₂流下在冰浴中攪拌溶液。使得反應(yīng)混合物溫暖至室溫并置于攪拌下整夜。用飽和的碳酸氫鈉(NaHCO₃)溶液(3x30mL)洗滌有機相。用無水Na₂SO₄干燥溶液。測量的C,42.87；H,7.20；N,5.55％。C₉H₁₈NO₂Br要求,C,42.86；H,7.14；N,5.55％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.27(d,3H),1.89(s,6H),2.17-2.55(m,8H),5.07(m,1H)。¹³C NMR(100MHz,CDCl3)δ17.6,30.9,46.1,56.1,63.5,70.6,76.9,170.8。m/z(ES MS)252[M+H]+。

1.1.4 G1-M的合成

將G1-OH(1.1207g，10.86mmol，1eq.)、TEA(1.5390g，15.2mmol，1.4eq.)和DMAP(132.7mg，1.086mmol，0.1eq.)添加到包含DCM(160mL)的250mL的2頸圓底燒瓶中。在正向的N₂吹掃下使燒瓶脫氧10分鐘。逐滴添加α-溴代異丁酰溴(2.622g，1.4mL，11.4mmol，1.05eq.)，同時在正向的N₂流下在冰浴中攪拌溶液。使得反應(yīng)混合物溫暖至室溫并置于攪拌下整夜。用飽和的碳酸氫鈉(NaHCO₃)溶液(3x160mL)洗滌有機相。用無水Na₂SO₄干燥溶液并使產(chǎn)物在真空中干燥整夜。測量的C,49.41；H,7.90；N,8.23％。C₂₁H₄₀N₃O₆Br要求,C,49.41；H,7.84；N,8.24％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.22(d,3H),1.89(s,6H),2.24-2.69(m,22H),2.83(m,4H),4.20(m,4H),5.0(m,1H)。¹³C NMR(100MHz,CDCl3)δ18.6,30.9,32.8,50.0,56.4,58.8,60.3,69.6,77.2,125.7,144.3,172.3。m/z(ES MS)510.2[M+H]+,534.2[M+Na]+。

1.1.5 G2-M的合成

將G2-OH(5.1431g，6.749mmol，1eq.)、TEA(0.9561g，9.449mmol，1.4eq.)和DMAP(82.5mg，0.6749mmol，0.1eq.)添加到包含DCM(160mL)的250mL的2頸圓底燒瓶中。在10分鐘正向的N₂吹掃下使燒瓶脫氧。逐滴添加α-溴異丁酰溴(1.629g，0.88mL，7.087mmol，1.05eq.)，同時在正向的N₂流下在冰浴中攪拌溶液。允許反應(yīng)混合物溫暖至室溫并置于攪拌下整夜。用飽和的碳酸氫鈉(NaHCO₃)溶液(3x160mL)洗滌有機相。用無水Na₂SO₄干燥溶液并使產(chǎn)物在真空中干燥整夜。測量的C,54.05；H,8.85；N,10.76％。C₄₁H₈₀N₇O₁₀Br要求,C,54.01；H,8.78；N,10.76％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.26(d,3H),1.56(m,4H),1.91(s,6H),2.22-2.67(m,50H),2.76(m,8H),4.19(m,8H),5.04(m,1H)。¹³C NMR(100MHz,CDCl3)δ24.5,25.5,28.4,45.6,62.2,64.2,77.2,173.5。m/z(ES MS)912.5[M+H]+,934.5[M+Na]+,950.5[M+K]+。

1.1.6 G2-Bz-OH的合成

將丙烯酸芐酯(6.7966g，42mmol，6eq.)添加到包含IPA(12mL)的50mL圓形2頸圓底燒瓶中。在正向的N₂吹掃下使燒瓶脫氧10分鐘。逐滴添加溶解在IPA(12mL)中的雙(3-氨基丙基)氨基)丙-2-醇(1.3221g，6.984mmol，1eq.)，同時在正向的N₂流下在冰浴中攪拌溶液。在0℃下攪拌最終的混合物另外的10分鐘，使其溫暖至室溫并攪拌48小時。除去溶劑并使產(chǎn)物在真空中干燥整夜。

1.1.7 G2-Bz的合成

將G2-Bz(1.664g，1.86mmol，1eq.)、TEA(0.2639g，2.6mmol，1.4eq.)和DMAP(22.8mg，0.1866mmol，0.1eq.)添加到包含DCM(110mL)的250mL的2頸圓底燒瓶中。在正向的N₂吹掃下使燒瓶脫氧10分鐘。逐滴添加α-溴代異丁酰溴(0.5354g，0.29mL，2.329mmol，1.25eq.)，同時在正向的N₂流下在冰浴中攪拌溶液。使得反應(yīng)混合物溫暖至室溫并置于攪拌下整夜。用飽和的碳酸氫鈉(NaHCO₃)溶液(3x110mL)洗滌有機相。用無水Na₂SO₄干燥溶液并使產(chǎn)物在真空中干燥整夜。測量的C,63.40；H,6.96；N,4.18％。C₅₃H₆₈N₃O₁₀Br要求,C,64.44；H,6.89；N,4.26％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.22(d,3H),1.54(m,4H),1.90(s,6H),2.24-2.65(m,18H),2.77(m,8H),5.00(m,1H),5.09(s,8H),7.33(m,20H)。¹³C NMR(100MHz,CDCl3)δ18.1,30.6,32.3,44.1,48.8,51.7,52.7,66.7,76.7,128.6,135.8,144.1,172.3。m/z(ES MS)988.4[M+H]+。

1.2 pH響應(yīng)支化物合成

1.2.1 1,4-丁二醇二(甲基丙烯酰氧基)-乙基醚(BDME)的合成

將1,4-丁二醇二乙烯基醚(BDVE)(5.6ml，35.21mmol)添加到配備有冷凝器、磁攪拌器和正向的氮氣流的兩頸250mL圓底燒瓶中。添加少量的自由基抑制劑4-叔丁基兒茶酚(刮刀末端)并使用氮氣吹掃使混合物脫氧15分鐘。一旦溶解，將溫度升高至70℃。在10分鐘內(nèi)通過隔片逐滴添加甲基丙烯酸(MAA)(14.9ml，175.8mmol)。用攪拌使反應(yīng)在70℃下進(jìn)行另外的6小時。該時間之后，通過冷卻和暴露于空氣停止反應(yīng)。將粗產(chǎn)物溶解在氯仿(100mL)中并用堿性H₂O(～pH12，3x 100ml)洗滌。收集組合的洗滌物并在NaSO₄上干燥，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。

(測量:的C 61.45；H 8.28％。C₁₆H₂₆O₆要求C 61.15；H 8.28％)；¹H NMR(400MHz；CDCl₃；Me₄Si)δ1.44(6H,d,CH₃CH),1.65(4H,m,CH₂CH₂CH₂),1.95(6H,s,CH₃C＝CH2),3.50-3.69(4H,m,OCH₂CH₂),5.60和6.15(4H,2s,CH₂＝CCH₃)和5.95-5.99(2H,q,CHCH₃)。¹³C NMR(400MHz；CDCl₃；Me₄Si)δ18.27(s),20.83(s),26.29(s)68.85(s),96.93(s),125.90(s),136.37(s)和167.01(s)。m/z(EI)314.2(M⁺-C₁₆H₂₆O₆要求314)。

1.3 HPMA的聚合

1.3.1 HPMA₅₀的聚合

在一般的合成中，目標(biāo)數(shù)均聚合度(DP_n)＝50單體單元P(HPMA)₅₀；n_HPMA/N_{引發(fā)劑}：50)，將bpy(173.3mg，1.1096mmol，2eq.)、HPMA(4g，27.7mmol，50eq.)和甲醇(MeOH))(基于HPM，56％v/v)置于25mL的圓底燒瓶中。攪拌溶液并使用氮氣(N₂)吹掃脫氧15分鐘。將Cu(I)Cl(54.9mg，0.5548mmol，1eq.)添加到燒瓶中并置于吹掃另外的5分鐘。在正向的N₂流下將G2-M(0.5054g，0.5548mmol，1eq.)添加到燒瓶中，并在30℃下使溶液聚合。當(dāng)如由¹H NMR(參見圖8)判斷的達(dá)到>99％轉(zhuǎn)化率時，通過暴露于氧和添加THF終止反應(yīng)。通過使混合物通過堿性氧化鋁柱除去催化劑殘留。在真空下除去THF以濃縮樣品，之后沉淀至己烷中并在真空烘箱中干燥整夜。

1.3.2 HPMA₅₀-EGDMA_x的聚合

在一般的合成中，目標(biāo)數(shù)均聚合度(DP_n)＝50單體單元P(HPMA)₅₀；n_HPMA/n_{引發(fā)劑}:50)，將bpy(173.3mg，1.1096mmol，2eq.)、HPMA(4g，27.7mmol，50eq.)、EGDMA(99.0mg，0.4993mmol，0.9eq)和甲醇(MeOH))(基于HPMA，38.9％v/v)置于25mL的圓底燒瓶中。攪拌溶液并使用氮氣(N₂)吹掃脫氧15分鐘。將Cu(I)Cl(54.9mg，0.5548mmol，1eq.)添加到燒瓶中并置于吹掃另外的5分鐘。在正向的N₂流下將EBIB(0.1082g，0.5548mmol，1eq.)添加到燒瓶中，并使溶液在30℃下聚合。當(dāng)如由¹H NMR判斷達(dá)到>99％的轉(zhuǎn)化率時，通過暴露于氧氣和添加THF終止反應(yīng)。通過使混合物通過堿性氧化鋁柱除去催化劑殘留。在沉淀到己烷中之前，在真空下除去THF以濃縮樣品。

1.4 DEAEMA的聚合

1.4.1 DEAEMA₅₀的聚合

在一般的合成中，目標(biāo)DP_n＝50單體單元PDEAEMA₅₀；n_DEAEMA/n_{引發(fā)劑}:50)，將bpy(134.9mg，0.8637mmol，2eq.)、DEAEMA(4g，21.59mmol，50eq.)和IPA(基于DEAEMA，56％v/v)置于25mL的圓底燒瓶中。攪拌溶液并使用氮氣(N₂)吹掃脫氧15分鐘。將Cu(I)Cl(42.8mg，0.4318mmol，1eq.)添加到燒瓶中并置于吹掃另外的5分鐘。在正向的N₂流下將G2-M(0.3934g，0.4318mmol，1eq.)添加到燒瓶中，并在40℃下使溶液聚合。當(dāng)如由¹H NMR判斷達(dá)到>99％的轉(zhuǎn)化率時，通過暴露于氧氣和添加丙酮終止反應(yīng)。通過使混合物通過堿性氧化鋁柱除去催化劑殘留。在真空下除去丙酮以濃縮樣品，之后沉淀至冷的石油醚(40℃-60℃)并在真空烘箱中干燥整夜。

1.4.2 DEAEMA₅₀-EGDMA_x的聚合

在一般的合成中，目標(biāo)DP_n)＝50單體單元PDEAEMA₅₀；n_DEAEMA/n_{引發(fā)劑}：50)，將bpy(134.9mg，0.8637mmol，2eq.)、DEAEMA(4g，21.59mmol，50eq.)、EGDMA(77.0mg，0.3886mmol，0.9eq)和IPA(基于DEAEMA，38.9％v/v)置于25mL的圓底燒瓶中。攪拌溶液并使用N₂吹掃脫氧15分鐘。將Cu(I)Cl(42.8mg，0.4318mmol，1eq.)添加到燒瓶中并置于吹掃另外的5分鐘。在正向的N₂流下將EBIB(84.2mg，0.4318mmol，1eq.)添加到燒瓶中，并在40℃下使溶液聚合。當(dāng)如由¹H NMR判斷達(dá)到>99％的轉(zhuǎn)化率時，通過暴露于氧氣和添加丙酮終止反應(yīng)。通過使混合物通過堿性氧化鋁柱除去催化劑殘留。在真空下除去丙酮以濃縮樣品，之后沉淀至冷的石油醚(40℃-60℃)并在真空烘箱中干燥整夜。聚合條件和流程與對以上直鏈聚合物所描述的那些相同。

1.4.3 DEAEMA₅₀-BDME_2.0的聚合

在一般的合成中，目標(biāo)DP_n)＝50單體單元PDEAEMA₅₀；n_DEAEMA/n_{引發(fā)劑}：50)，將bpy(134.9mg，0.8637mmol，2eq.)、DEAEMA(4g，21.59mmol，50eq.)、BDME(291.2mg，0.8637mmol，0.9eq)和IPA(基于DEAEMA，38.9％)置于25mL的圓底燒瓶中。攪拌溶液并使用N₂吹掃脫氧15分鐘。將Cu(I)Cl(42.8mg，0.4318mmol，1eq.)添加到燒瓶中并置于吹掃另外的5分鐘。在正向的N₂流下將EBIB(84.2mg，0.4318mmol，1eq.)添加到燒瓶中，并在40℃下使溶液聚合。當(dāng)如由1H NMR判斷達(dá)到>99％的轉(zhuǎn)化率時，通過暴露于氧氣和添加丙酮終止反應(yīng)。通過使混合物通過堿性氧化鋁柱除去催化劑殘留。在真空下除去丙酮以濃縮樣品，之后沉淀至冷的石油醚(40℃-60℃)并在真空烘箱中干燥整夜。聚合條件和流程與對以上直鏈聚合物所描述的那些相同。

1.5 tBuMA的聚合

1.5.1 tBuMA₅₀的聚合

在一般的合成中，目標(biāo)數(shù)均聚合度(DP_n)＝50單體單元(tBuMA₅₀)；n_tBuMA/n_{引發(fā)劑}：50)，將bpy(175.7mg，1.125mmol，2eq.)、tBuMA(4g，28.129mmol，50eq.)和含水異丙醇(IPA/H₂O)(92.5/7.5％)(基于tBuMA，50.4％v/v)置于50mL圓底燒瓶中。攪拌溶液并使用氮氣(N₂)吹掃脫氧15分鐘。將Cu(I)Cl(55.7mg，0.5626mmol，1eq.)添加到燒瓶中并置于吹掃另外的5分鐘。在正向的N₂流下將G2-M(0.3934g，0.5626mmol，1eq.)添加到燒瓶中，并在20℃下使溶液聚合，且從反應(yīng)混合物中定期取出樣品用于¹H NMR分析。當(dāng)如由¹H NMR判斷達(dá)到>99％的轉(zhuǎn)化率時，通過暴露于氧氣和添加THF終止反應(yīng)。通過使混合物通過堿性氧化鋁柱除去催化劑殘留。在真空下除去THF以濃縮樣品，之后沉淀至己烷中并在真空烘箱中干燥整夜。

1.5.2 tBuMA₅₀-EGDMA_0.95的聚合

在一般的合成中，目標(biāo)數(shù)均聚合度(DP_n)＝50單體單元(tBuMA₅₀)；n_tBuMA/n_{引發(fā)劑}：50)，將bpy(175.7mg，1.125mmol，2eq.)、tBuMA(4g，28.13mmol，50eq.)、EGDMA(105.9mg，0.5345mmol)和含水異丙醇(IPA/H2O)(92.5/7.5％)(基于tBuMA，38.4％v/v)放置到50mL的圓底燒瓶中。攪拌溶液并使用氮氣(N₂)吹掃脫氧15分鐘。將Cu(I)Cl(55.7mg，0.5626mmol，1eq.)添加到燒瓶中并置于吹掃另外的5分鐘。在正向的N₂流下將EBIB(0.1097g，0.5626mmol，1eq.)添加到燒瓶中，并在20℃下使溶液聚合，并從反應(yīng)混合物中定期取出樣品用于¹H NMR分析。當(dāng)如由¹H NMR判斷達(dá)到>99％的轉(zhuǎn)化率時，通過暴露于氧氣和添加THF終止反應(yīng)。通過使混合物通過堿性氧化鋁柱除去催化劑殘留。在真空下除去THF以濃縮樣品，之后沉淀至己烷中并在真空烘箱中干燥整夜。

1.6 DEAEMA-tBuMA的聚合

1.6.1 G2-DEAEMAx-stat-tBuMA_y的聚合

在一般的合成中，目標(biāo)DP_n＝50單體單元PDEAEMA₂₅-tBuMA₂₅；n_DEAEMA/n_{引發(fā)劑}：50)，將bpy(134.9mg，0.8637mmol，2eq.)、DEAEMA(2g，10.80mmol，25eq.)、tBuMA(1.5352，10.80mmol，25eq.)和IPA/H₂O(92.5/7.5％)(基于DEAEMA/tBuMA，30.6％v/v)置于50mL的圓底燒瓶中。攪拌溶液并使用氮氣(N₂)吹掃脫氧15分鐘。將Cu(I)Cl(42.8mg，0.4318mmol，1eq.)添加到燒瓶中并置于吹掃另外的5分鐘。在正向的N₂流下將G2-M(0.3934g，0.4318mmol，1eq.)添加到燒瓶中，并在40℃下使溶液聚合。當(dāng)如由¹H NMR判斷達(dá)到>99％的轉(zhuǎn)化率時，通過暴露于氧氣和添加丙酮終止反應(yīng)。通過使混合物通過堿性氧化鋁柱除去催化劑殘留。在真空下除去丙酮以濃縮樣品，之后沉淀至冷的石油醚(40℃-60℃)并在真空烘箱中干燥整夜。

1.6.2 EBIB-DEAEMAx-stat-tBuMA_y-EGDMA₀.9的聚合

在一般的合成中，目標(biāo)DP_n＝50單體單元PDEAEMA₂₅-tBuMA₂₅；n_DEAEMA/n_{引發(fā)劑}:：50)，將bpy(134.9mg，0.8637mmol，2eq.)、DEAEMA(2g，10.80mmol，25eq.)、tBuMA(1.5352，10.80mmol，25eq.)、EGDMA(77mg，0.9mmol，0.9eq.)和IPA/H₂O(92.5/7.5％)(基于DEAEMA/tBuMA，30.6％v/v)置于50mL的圓底燒瓶中。攪拌溶液并使用氮氣(N₂)吹掃脫氧15分鐘。將Cu(I)Cl(42.8mg，0.4318mmol，1eq.)添加到燒瓶中并置于吹掃另外的5分鐘。在正向的N₂流下將EBIB(84.2mg，0.4318mmol，1eq.)添加到燒瓶中，并在40℃下使溶液聚合。當(dāng)如由¹H NMR判斷達(dá)到>99％的轉(zhuǎn)化率時，通過暴露于氧氣和添加丙酮終止反應(yīng)。通過使混合物通過堿性氧化鋁柱除去催化劑殘留。在真空下除去丙酮以濃縮樣品，之后沉淀至冷的石油醚(40℃-60℃)并在真空烘箱中干燥整夜。

1.6.3 G2-DEAEMA_x-嵌段-tBuMA_y的聚合

在一般的合成中，目標(biāo)DP_n＝50單體單元PDEAEMA₂₅-tBuMA₂₅；n_DEAEMA/n_{引發(fā)劑}:50)，將bpy(134.9mg，0.8637mmol，2eq.)、DEAEMA(4g，21.59mmol，50eq.)和IPA(基于DEAEMA，38.9％v/v)置于50mL的圓底燒瓶中。攪拌溶液并使用氮氣(N₂)吹掃脫氧15分鐘。將Cu(I)Cl(42.8mg，0.4318mmol，1eq.)添加到燒瓶中并置于吹掃另外的5分鐘。在正向的N₂流下將G2-M(0.3934mg，0.4318mmol，1eq.)添加到燒瓶中，并在40℃下使溶液聚合。使反應(yīng)達(dá)到80-90％轉(zhuǎn)化率，之后將溶解在H₂O/IPA(92.5/7.5％)(基于tBuMA，27.3％v/v)中的tBuMA(1.5352，10.80mmol，25eq.)、bpy(134.9mg，0.8637mmol，2eq.)和Cu(I)Cl(42.8mg，0.4318mmol，1eq.)添加到反應(yīng)混合物中并使其聚合整夜。當(dāng)如由¹H NMR判斷達(dá)到>99％的轉(zhuǎn)化率時，通過暴露于氧氣和添加丙酮終止反應(yīng)。通過使混合物通過堿性氧化鋁柱除去催化劑殘留。在真空下除去丙酮以濃縮樣品，之后沉淀至冷的石油醚(40℃-60℃)并在真空烘箱中干燥整夜。

1.6.4 EBIB-DEAEMA_x-嵌段-tBuMA_y-EGDMA0_.9的聚合

在一般的合成中，目標(biāo)DP_n＝50單體單元PDEAEMA₂₅-tBuMA₂₅；n_DEAEMA/n_{引發(fā)劑}：50)，將bpy(134.9mg，0.8637mmol，2eq.)、DEAEMA(4g，21.59mmol，50eq.)和IPA(基于DEAEMA，38.9％v/v)置于50mL的圓底燒瓶中。攪拌溶液并使用氮氣(N₂)吹掃脫氧15分鐘。將Cu(I)Cl(42.8mg，0.4318mmol，1eq.)添加到燒瓶中并置于吹掃另外的5分鐘。在正向的N₂流下將EBIB(84.2mg，0.4318mmol，1eq.)添加到燒瓶中，并在40℃下使溶液聚合。使反應(yīng)達(dá)到80-90％轉(zhuǎn)化率，之后將溶解在H₂O/IPA(92.5/7.5％)(基于tBuMA，27.3％v/v)中的tBuMA(1.5352，10.80mmol，25eq.)、bpy(134.9mg，0.8637mmol，2eq.)、EGDMA(77mg，0.9mmol，0.9eq.)和Cu(I)Cl(42.8mg，0.4318mmol，1eq.)添加到反應(yīng)混合物中并使其聚合整夜。當(dāng)如由1H NMR判斷達(dá)到>99％的轉(zhuǎn)化率時，通過暴露于氧氣和添加丙酮終止反應(yīng)。通過使混合物通過堿性氧化鋁柱除去催化劑殘留。在真空下除去丙酮以濃縮樣品，之后沉淀至冷的石油醚(40℃-60℃)并在真空烘箱中干燥整夜。

2.通過ROP的聚合

2.1 ROP樹枝狀分子引發(fā)劑合成

2.1.1 G1-pOH的合成

將2-(二甲基氨基)乙基丙烯酸酯(6.0g，42mmol，6eq.)添加到包含IPA(12mL)的50mL圓形2頸圓底燒瓶中。在正向的N₂吹掃下使燒瓶脫氧10分鐘。逐滴添加溶解在IPA(12mL)中的乙醇胺(0.4266g，6.9843mmol，1eq.)，同時在正向的N₂流下在冰浴中攪拌溶液。在0℃下攪拌最終的混合物另外的10分鐘，之后使其溫暖至室溫并攪拌48小時。除去溶劑并使產(chǎn)物真空中干燥整夜。

2.1.2 G2-pOH的合成

將CDI(39.137g，0.241mol)添加到配備有回流冷凝器、磁攪拌器和干燥N₂入口的500mL的2頸RBF中。添加干燥甲苯(350mL)并用N₂吹掃燒瓶10分鐘。在60℃下攪拌溶液，并通過溫?zé)岬淖⑸淦魈砑邮宥〈?35.7g，46mL，0.483mol)(注意：叔丁醇是低熔點固體，因此在35℃的水浴中加熱它以使其熔融為液體以容易地通過注射器從瓶中將其取出)。在正向的氮氣流下在60℃下將混合物置于攪拌6小時。之后，逐滴添加BAPA(16.077g，17.14mL，0.121mol)，同時攪拌并保持在60℃的溫度。添加時，白色固體沉淀開始在燒瓶中形成(咪唑)。在正向的氮氣流下在60℃下將反應(yīng)置于攪拌另外的18小時，然后使其冷卻至室溫。過濾淺黃色的溶液以除去任何固體咪唑，并在真空中濃縮。將剩余的油溶解在二氯甲烷(250mL)中，用蒸餾水(3x250mL)且最終用飽和鹽水溶液(150mL)洗滌。用無水Na₂SO₄干燥有機層，過濾并在真空中濃縮以給出作為白色固體粉末的G1-BAPA。物除去任何殘余的剩余溶劑，將化合物置于高真空下整夜。(38g,95％)測量的C,57.84；H,10.45；N,12.91％。C₁₆H₃₃N₃O₄要求,C,57.98；H,10.04；N,12.68％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)5.19(s,br,NH–添加D₂O時消失),3.21(t,4H),2.65(t,4H),1.65(q,4H),1.44(s,18H)¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)156.48,79.34,47.77,39.29,30.11,28.79。m/z(ES MS)332.3[M+H]⁺

將1,4-二噁烷(200mL)中的G1-BAPA(20g，0.06mol)16mmol)、溴乙醇(7.54g，0.6mol)、30mg的碘化鈉和碳酸鉀(25.0g，1.8mol)的混合物回流整夜。在濃縮反應(yīng)混合物之后，將其用乙酸乙酯(200mL)萃取，用水(100mL)洗滌，在硫酸鈉上干燥，并且過濾，并在降低的壓力下除去溶劑。通過快速層析(2:1，乙酸乙酯-己烷)純化粗產(chǎn)物產(chǎn)生G1-OH。

在1L RBF中，將G1-OH(33.70g)溶解在乙酸乙酯(330mL)中并非常緩慢地添加濃HCl(35.03g，30mL，d＝1.1836％活性)。CO₂開始釋出。保持反應(yīng)容器打開并攪拌6小時。然后在真空中除去乙酸乙酯，并進(jìn)行剩余油的粗¹H NMR(D₂O)。粗¹H NMR示出不完全的脫羧的標(biāo)志(參見第7頁的質(zhì)譜)，所以將油再溶解在250mL乙酸乙酯中并加熱至55℃持續(xù)5小時。除去乙酸乙酯之后，將粗油溶解在4M NaOH(300mL)中，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(60℃)上濃縮至一半(約)。隨后，用CHCl₃(300mL)萃取油混合物兩次。然后組合有機層，用無水Na₂SO₄干燥，過濾并在真空中濃縮以給出作為淺黃色油的雙(3-氨基丙基)氨基)丙醇。

將2-(二甲基胺基)乙基丙烯酸酯(6.0g，42mmol，6eq.)添加到包含IPA(12mL)的50mL圓形2頸圓底燒瓶中。在正向的N₂吹掃下使燒瓶脫氧10分鐘。逐滴添加溶解在IPA(12mL)中的雙(3-氨基丙基)氨基)丙醇(1.2271g，6.984mmol，1eq.)，同時在正向的N₂流下在冰浴中攪拌溶液。在0℃下攪拌最終的混合物另外的10分鐘，使其溫暖至室溫并攪拌48小時。除去溶劑并使產(chǎn)物在真空中干燥整夜。

2.2二官能己內(nèi)酯的合成

2.2.24,4’-二環(huán)氧己烷基-7,7’-二酮(BOD)的合成

將過氧化脲(CO(NH₂).H₂O₂)(20g，0.21mol)添加到包含甲酸(100mL)的500mL圓底燒瓶中。在室溫下攪拌溶液2h。然后將燒瓶浸入冰浴中以控制由該流程的以下階段導(dǎo)致的放熱。在5-10min期間將雙環(huán)己酮(10g，0.05mol)緩慢添加到溶液中。攪拌反應(yīng)混合物4h，同時定期更換冰浴。然后將200mL水添加到混合物中，隨后用氯仿萃取(200mL x 4)。收集有機餾份，并用飽和的碳酸氫鈉水溶液洗滌，然后用Na₂SO₄干燥整夜。在降低的壓力下除去溶劑之后，分離白色粉末并通過NMR分析，并與文獻(xiàn)報告的值比較。

2.3通過ROP的聚合

2.3.1 ε-己內(nèi)酯的開環(huán)聚合

對于目標(biāo)數(shù)均聚合程DP＝50的CL的均聚的一般流程如下。用氮氣吹掃50mL單頸圓底燒瓶15分鐘。通過注射器和針頭添加SnOct₂催化劑(0.0018g，0.0044mmol)并進(jìn)一步吹掃燒瓶。將蒸餾的CL(3.773g，3.5mL，33.06mmol)引入到50mL燒瓶中，并吹掃燒瓶另外的10分鐘。經(jīng)由注射器添加無水G1pOH(0.2316g，0.6666mmol)。然后將燒瓶浸入預(yù)熱的110℃下的油浴中，并強力攪拌～20小時的要求反應(yīng)時間。通過將反應(yīng)浸入冰浴終止反應(yīng)，并通過溶解在THF中純化聚合物并將其沉淀到己烷中。

2.3.2 ε-己內(nèi)酯和4,4’-bioxepanyl-7,7’-二酮(PCL-BOD)的開環(huán)聚合

對于目標(biāo)數(shù)均聚合度DP＝50的CL的均聚的一般流程如下。用氮氣吹掃包含BOD(0.9183g，4.059mmol)的50mL單頸圓底燒瓶15分鐘。通過注射器和針頭添加SnOct₂催化劑(0.0079g，0.0195mmol)并進(jìn)一步吹掃燒瓶。將蒸餾的CL(23.28g，21.6mL，204mmol)引入到50mL燒瓶中，并吹掃燒瓶另外的10分鐘。經(jīng)由注射器添加無水BzOH(0.7315g，0.7mL，6.764mmol)。然后將燒瓶浸入預(yù)熱的110℃下的油浴中，并強力攪拌～20小時的要求反應(yīng)時間。通過將反應(yīng)浸入冰浴終止反應(yīng)，并通過溶解在THF中純化聚合物并將其沉淀到己烷中。

體外細(xì)胞存活率實驗

研究了根據(jù)本發(fā)明的攜帶SN38的納米顆粒對小鼠CT-26細(xì)胞的存活率的影響。發(fā)現(xiàn)雖然SN38是降低細(xì)胞存活率的原因，納米顆粒載體本身對細(xì)胞存活率沒有影響。

使用了以下聚合物組合物(支化聚合物和嵌段共聚物的混合物)：

JF1：p(HPMA₅₀-共-EGDMA_0.9):p(PEG₁₁₄-嵌段-HPMA₁₂₀)50:50wt％

JF2：p(nBuMA₅₀-共-EGDMA_0.8):p(PEG₁₁₄-嵌段-HPMA₁₂₀)50:50wt％

JF3：p(tBuMA₂₅-共-HPMA₂₅-共-EGDMA_0.9):p(PEG₁₁₄-嵌段-HPMA₁₂₀)50:50wt％

遵循以下流程。

納米顆粒樣品-SN-38的5wt％包封

1.將30uL樣品(JF1-3)添加到970uL培養(yǎng)基中(最終濃度是4uM)

2.將15uL樣品(JF1-3)添加到970uL培養(yǎng)基和15uL水中(最終濃度是2uM)

3.將7.5uL樣品(JF1-3)添加到970uL培養(yǎng)基和22.5uL水中(最終濃度是1uM)

對于DMSO中的SN38

1.制備2.5mM的儲備SN38溶液(在2000uL DMSO中2mg)

2.將1.6uL的儲液添加到968.4uL培養(yǎng)基中，然后添加30uL無菌水(最終濃度是4uM)

3.將2uL儲液添加到2ul的DMSO中(1:2連續(xù)稀釋)，將其1.6uL添加到968.4uL培養(yǎng)基和30uL無菌水中(最終濃度是2uM)

4.將2uL先前的中間儲液添加至2ul的DMSO中(1:2系列稀釋)，將其1.6uL添加到968.4uL培養(yǎng)基和30uL無菌水中(最終濃度是1uM)

對于對照

1.添加1.6uL的DMSO到968.4uL培養(yǎng)基，然后添加30uL無菌水

2.將30uL無菌水添加到970uL培養(yǎng)基中

對于空白

1.將30uL樣品(B1-3)添加到970uL培養(yǎng)基中(最終濃度是4uM)

2.將15uL樣品(B1-3)添加到970uL培養(yǎng)基和15uL水中(最終濃度是2uM)

3.將7.5uL樣品(B1-3)添加到970uL培養(yǎng)基和22.5uL水中(最終濃度是1uM)

將培養(yǎng)基抽吸到96孔板上并用100uL的每種溶液(一式三份)給藥，隨后用96孔板讀數(shù)器檢測，吸光度490nm。

如圖20所示，在48小時溫育周期之后，5wt％SN38包封的納米顆粒樣品和SN38在DMSO/水中的樣品導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低(相比對照的100％，約25％至45％)。相反，空白樣品(即包含納米顆粒的聚合物成分而不包含SN38的那些)導(dǎo)致在允許誤差內(nèi)的100％細(xì)胞存活率。