本發(fā)明涉及將微流控芯片技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種基于微流控芯片的體外極低氧誘導(dǎo)功能性神經(jīng)元形成方法。

背景技術(shù)：

神經(jīng)元是腦部發(fā)揮功能的重要功能成分和單元，越來(lái)越多的研究人員發(fā)現(xiàn)，許多腦部疾病的發(fā)生與發(fā)展被認(rèn)為與神經(jīng)元的功能損傷或缺失有關(guān)。隨著科學(xué)研究的深入和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)體外功能性神經(jīng)元可直接應(yīng)用于腦部疾病的診斷、治療和檢測(cè)等多個(gè)方面，因此，體外培養(yǎng)和產(chǎn)生功能性神經(jīng)元對(duì)腦損傷和腦部疾病的研究與治療有著重大意義。

目前，體外神經(jīng)元的培養(yǎng)主要集中于原代提取，即從動(dòng)物腦部提取原代的功能性神經(jīng)元，但隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步和倫理的局限，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將逐步淡化，且動(dòng)物和人體具有一定的種屬差異，為了避免上述問(wèn)題，認(rèn)為誘導(dǎo)的功能性神經(jīng)元越來(lái)越受到研究人員的青睞。但由于神經(jīng)元生長(zhǎng)和增殖的微環(huán)境比較苛刻，培養(yǎng)方法復(fù)雜，且易失活，因此尋找行之有效的體外功能性神經(jīng)元的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。

微流控芯片技術(shù)作為一門迅速發(fā)展起來(lái)的科學(xué)技術(shù)，已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，更因其同細(xì)胞尺寸匹配、環(huán)境同生理環(huán)境相近、在時(shí)間和空間維度上能夠提供更為精確的操控，易于通過(guò)靈活設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞功能研究等特點(diǎn)而成為新一代細(xì)胞研究的重要平臺(tái)。另外，有研究表明神經(jīng)元生長(zhǎng)和增殖的微環(huán)境為低氧的，但將微流控技術(shù)與低氧培養(yǎng)微環(huán)境結(jié)合進(jìn)行功能性神經(jīng)元誘導(dǎo)的方法學(xué)研究尚處于空白階段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種基于微流控芯片的體外極低氧環(huán)境誘導(dǎo)功能性神經(jīng)元的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)將大鼠成熟腦星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)為功能性神經(jīng)元。

一種微流控芯片，該芯片主要由小皿、芯片主體組成；芯片主體上設(shè)有細(xì)胞培養(yǎng)池，芯片直接放置于小皿底部，細(xì)胞培養(yǎng)池底即為小皿底部表面。

所述芯片主體直接放置于小皿底部，無(wú)需封接，芯片主體上的細(xì)胞培養(yǎng)池的數(shù)量為7-15個(gè)。

一種基于微流控芯片的體外極低氧誘導(dǎo)功能性神經(jīng)元形成方法，其特征在于：采用上述微流控芯片，構(gòu)建極低氧環(huán)境活細(xì)胞培養(yǎng)室，將細(xì)胞直接培養(yǎng)在極低氧環(huán)境活細(xì)胞培養(yǎng)室中進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為2-30天；細(xì)胞每24小時(shí)換液一次；2-7天時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液為高糖DMEM培養(yǎng)基+3％胎牛血清(FBS)；8-21天時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM/F12培養(yǎng)基+3％胎牛血清(FBS)。

所述構(gòu)建極低氧環(huán)境活細(xì)胞培養(yǎng)室的方法為為：細(xì)胞培養(yǎng)池中的混合氣為CO₂、O₂與N₂的混合氣，通過(guò)調(diào)節(jié)O₂與N₂的混合氣的比例以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)盒中的O₂含量，實(shí)現(xiàn)缺氧環(huán)境的構(gòu)建。

所述構(gòu)建極低氧環(huán)境活細(xì)胞培養(yǎng)室中O₂與N₂的混合氣的比例可調(diào)，培養(yǎng)室中O₂的濃度為0.2％-21％。

本發(fā)明提供了一種新穎、快捷、有效的功能性神經(jīng)元的制備方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1)芯片制作方法簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和技術(shù)集成，即可完成需求；2)誘導(dǎo)方法快捷、有效，無(wú)需多種誘導(dǎo)因子的加入和復(fù)雜誘導(dǎo)程序的進(jìn)行，只需在低氧環(huán)境中短期誘導(dǎo)即可得到功能性神經(jīng)元，且成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源廣泛，無(wú)細(xì)胞來(lái)源上的限制，因此能夠大量誘導(dǎo)得到功能性神經(jīng)元， 為臨床應(yīng)用提供充足的細(xì)胞來(lái)源。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明微流控芯片整體結(jié)構(gòu)示意圖；其中，1為小皿，2為芯片主體，3為細(xì)胞培養(yǎng)池；

圖2低氧誘導(dǎo)過(guò)程中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，每4天采集一次圖像數(shù)據(jù)，共采集24天；

圖3誘導(dǎo)24天后，對(duì)細(xì)胞的表征情況，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(GFAP)，神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物(Nestin)和神經(jīng)元標(biāo)記物(bIII-tub、NeuN、GABA、Syn)；

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此而限制本發(fā)明。

一種微流控芯片，構(gòu)型如圖1所示。該芯片主要由小皿1、芯片主體2組成；芯片主體2上設(shè)有細(xì)胞培養(yǎng)池3，芯片主體2直接放置于小皿1底部，細(xì)胞培養(yǎng)池3底即為小皿1底部表面。

芯片主體2直接放置于小皿1底部，無(wú)需封接，芯片主體2上的細(xì)胞培養(yǎng)池3的數(shù)量為7-15個(gè)。

實(shí)施例1

體外極低氧環(huán)境誘導(dǎo)功能性神經(jīng)元的方法

利用實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)制作的微流控芯片，體外提取的新生SD大鼠的原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過(guò)連續(xù)培養(yǎng)10天后，體外發(fā)育為成熟的腦星形膠質(zhì)細(xì)胞。將這部分細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，接種于芯片的細(xì)胞培養(yǎng)池中，細(xì)胞懸液濃度為1×10^6-2×10⁶cells/mL，靜置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中24小時(shí)待細(xì)胞完全貼壁，所用細(xì)胞培養(yǎng)液為高糖DMEM+10％FBS。細(xì)胞貼壁后，換液為高糖DMEM+3％FBS，放 置入極低氧活細(xì)胞培養(yǎng)室中，培養(yǎng)室中的氧氣濃度為0.2％。連續(xù)培養(yǎng)7天，每24小時(shí)換液一次。從第8天開(kāi)始，細(xì)胞所用培養(yǎng)液為DMEM/F12+3％FBS，每24小時(shí)換液一次，直至第24天結(jié)束。整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程中每4天拍照一次，結(jié)果如圖2所示。

實(shí)施例2

功能性神經(jīng)元標(biāo)記物表征

在經(jīng)過(guò)24天的極低氧誘導(dǎo)之后，將細(xì)胞培養(yǎng)芯片從極低氧活細(xì)胞培養(yǎng)室中取出，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色，監(jiān)測(cè)蛋白為星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(GFAP)，神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物(Nestin)和神經(jīng)元標(biāo)記物(bIII-tub、NeuN、GABA、Syn)，方法如下：4％多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定，PBS緩沖液沖洗三次，每次10min；0.1％Triton X-100致孔劑作用10min，PBS緩沖液沖洗三次，每次10min；山羊封閉血清作用1h，一抗(GFAP、Nestin、bIII-tub、NeuN、GABA、Syn)1:100稀釋，4℃過(guò)夜孵育，PBS緩沖液沖洗三次，每次10min；二抗(TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG)1:50稀釋，常溫孵育1h，PBS緩沖液沖洗三次，每次10min；沖洗完畢后加入1:2000稀釋的DAPI工作液，熒光顯微鏡下拍照，記錄各種標(biāo)記物蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示。