本發(fā)明涉及微流控和生物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)，涉及微流控培養(yǎng)裝置及應(yīng)用其培養(yǎng)細(xì)胞或微生物的方法。

背景技術(shù)：

在自然界中，存在許多氣液界面交替分布的微環(huán)境，如土壤間隙、湖泊和海洋，人類的支氣管等。一些微生物和細(xì)胞如絲狀真菌、放線菌、藻類、支氣管上皮細(xì)胞等在氣液界面表現(xiàn)出與環(huán)境相適應(yīng)的特殊的分化形態(tài)。天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)是存在于土壤中的絲狀細(xì)菌，有著復(fù)雜的生命周期，成為研究多細(xì)胞分化的模式原核生物(K.et al.Streptomyces morphogenetics:dissecting differentiation in a filamentous bacterium.Nature Rev.Microbiol.2009.7(1):p.36-49)，全基因組測(cè)序已經(jīng)完成。鏈霉菌能夠產(chǎn)生一系列復(fù)雜的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如抗生素、抗腫瘤制劑、免疫抑制劑等(S.D.Bentley,et al.Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2).Nature.2002.417(6885):p.141-7.)，次級(jí)代謝產(chǎn)物分泌的起始往往與菌絲的分化相一致。因此，研究鏈霉菌的生長(zhǎng)分化對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。

傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室所用的絲狀真菌及放線菌的培養(yǎng)觀察方法主要是平板插片法，其主要缺陷在于無(wú)法實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地觀察生物體生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程，且操作較為復(fù)雜，無(wú)法對(duì)其生長(zhǎng)條件進(jìn)行精確的控制。

微流控學(xué)(Microfluidics)是利用微米尺度的通道網(wǎng)絡(luò)來(lái)操縱皮納升體積流體的科學(xué)與技術(shù)。微流控芯片可以對(duì)極微量樣品和試劑進(jìn)行處理和分析，實(shí)現(xiàn)高分辨率、高靈敏度的分離和檢測(cè)，成本低，縮短分析時(shí)間(G.M.Whitesides,et al.The origins and the future of microfluidics.Nature.2006.442(7101):p.368-373)。在微流控芯片上進(jìn)行功能單元集成的芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-On-a-Chip)技術(shù)應(yīng)用于生物學(xué)研究可以使復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)單化， 大幅度減少樣品體積，減少試劑的消耗，從珍貴的樣品中獲取盡可能多的信息，規(guī)?；奶幚砗蜋z測(cè)大批樣品，對(duì)細(xì)胞微環(huán)境的時(shí)空變化提供更大的控制性和預(yù)見性(E.K.Sackmann,et al.The present and future role of microfluidics in biomedical research.Nature.2014.507(7491):p.181-189)。

利用微流控芯片進(jìn)行微米尺度氣液界面的控制需要對(duì)氣液界面張力和微結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確的設(shè)計(jì)和控制。難點(diǎn)在于對(duì)于液面的定位控制。對(duì)于放線菌等具有氣液界面分化的細(xì)胞生物學(xué)研究，曾有報(bào)道利用皮升體積的液滴高通量的培養(yǎng)和篩選來(lái)自土壤的放線菌(E.Zang,et al.Real-time image processing for label-free enrichment of Actinobacteria cultivated in picolitre droplets.Lab Chip.2013.13(18):p.3707)。目前還未見用于實(shí)現(xiàn)氣液界面分化生長(zhǎng)和孢子收集的微流控裝置的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種微流控培養(yǎng)裝置及應(yīng)用其培養(yǎng)細(xì)胞或微生物的方法，可用于培養(yǎng)細(xì)胞或微生物在氣液界面分化生長(zhǎng)并可觀察其生長(zhǎng)情況。

本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種微流控培養(yǎng)裝置，包括基片和蓋片，所述蓋片一面開設(shè)有凹槽，所述蓋片設(shè)有凹槽的一面蓋設(shè)在所述基片之上；

所述基片的上表面與所述蓋片的凹槽之間形成液體輸送通道、氣體輸送通道及氣體腔室，所述氣體腔室環(huán)繞所述液體輸送通道設(shè)置，所述液體輸送通道與所述氣體輸送通道通過(guò)所述氣體腔室相連通，所述液體輸送通道與所述氣體腔室之間設(shè)有用于限制液體流出所述液體輸送通道的圍堰；

所述氣體輸送通道開設(shè)有與外界相連通的通氣孔及排氣孔；所述液體輸送通道開設(shè)有與外界相連通的輸液孔及排液孔；

所述液體輸送通道開設(shè)有培養(yǎng)微室。

以上所述的微流控培養(yǎng)裝置，所述圍堰結(jié)構(gòu)環(huán)繞所述培養(yǎng)微室以及所述液體輸送通道設(shè)置，所述圍堰的頂部距離所述基片上表面0.5μm至5μm。

以上所述的微流控培養(yǎng)裝置，所述氣體腔室的高度為0.5μm-1mm。

以上所述的微流控培養(yǎng)裝置，所述培養(yǎng)微室在所述液體輸送通道的兩側(cè)或一側(cè)陣列分布。

以上所述的微流控培養(yǎng)裝置，所述培養(yǎng)微室與所述液體輸送通道連通 的一側(cè)的口徑逐漸縮小。

以上所述的微流控培養(yǎng)裝置，所述培養(yǎng)微室內(nèi)可容納的溶液體積為0.01nL～100μL。

以上所述的微流控培養(yǎng)裝置，所述液體輸送通道的長(zhǎng)度為5mm～200mm，通道的寬度為50μm-10mm，深度為10μm-1mm。

以上所述的微流控培養(yǎng)裝置，所述氣體輸送通道的寬度為50-10mm，深度為10μm～2mm。

以上所述的微流控裝置，設(shè)有可用于觀察所述培養(yǎng)微室與所述氣體腔室連接部分的結(jié)構(gòu)。

以上所述的微流控裝置，所述蓋片與所述基片為可拆卸連接。

本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種可觀察細(xì)胞或微生物在氣液界面生長(zhǎng)分化的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

a)細(xì)胞或微生物懸液接種于液體輸送通道或培養(yǎng)微室：將細(xì)胞或微生物懸液從以上任一所述的裝置的輸液孔注入所述液體輸送通道及所述培養(yǎng)微室中，細(xì)胞或微生物在培養(yǎng)微室內(nèi)芯片上貼壁或者懸浮生長(zhǎng)；

b)通入培養(yǎng)基：將細(xì)胞或微生物培養(yǎng)所需的液體培養(yǎng)基通過(guò)所述輸液孔注入所述液體輸送通道；

c)通入氣體：將細(xì)胞或微生物培養(yǎng)所需的氣體通過(guò)通氣孔注入氣體輸送通道和氣體腔室；對(duì)于依靠空氣即可生長(zhǎng)的細(xì)胞或微生物不做通氣處理；

d)細(xì)胞或微生物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程實(shí)時(shí)的觀察與記錄：引入所述培養(yǎng)微室的細(xì)胞或微生物在所述培養(yǎng)微室中生長(zhǎng)，長(zhǎng)到一定階段后在所述培養(yǎng)微室與所述氣體腔室的氣液界面進(jìn)行分化，細(xì)胞或微生物的氣生部分會(huì)長(zhǎng)入所述氣體腔室中，觀察記錄生長(zhǎng)情況。

本發(fā)明提供的微流控裝置可以容納細(xì)胞或微生物在裝置的液體輸送通道以及培養(yǎng)微室中，通過(guò)液體輸送通道持續(xù)供應(yīng)液體培養(yǎng)基，使細(xì)胞或微生物可在充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)下，持續(xù)生長(zhǎng)和發(fā)育分化。在液體輸送通道和培養(yǎng)微室周圍的氣體腔室中充滿空氣或培養(yǎng)所需的特殊配比氣體，細(xì)胞可通過(guò)培養(yǎng)微室邊緣的圍堰與基片間的空隙穿過(guò)氣液界面，在氣體腔室中生長(zhǎng)，完成其完整的氣生發(fā)育分化過(guò)程。微流控裝置可采用透明的玻璃、有機(jī)玻璃、聚碳酸酯等材質(zhì)，方便利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行成像，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞或微生物 完整生命周期的觀察；可以通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行精確的調(diào)節(jié)和控制，通過(guò)改變不同碳源、氮源、pH值或測(cè)試用的液體以及不同氣體的條件，研究液體及氣體對(duì)細(xì)胞或微生物生長(zhǎng)分化的影響。

本發(fā)明的裝置在細(xì)胞或微生物培養(yǎng)成熟后還可以通過(guò)液體輸入通道通入戊二醛等固定液，對(duì)細(xì)胞進(jìn)形態(tài)固定，打開蓋片，利用電子顯微鏡對(duì)細(xì)胞或微生物進(jìn)行高分辨率形態(tài)學(xué)分析與納米級(jí)表面結(jié)構(gòu)分析。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的微流控培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本發(fā)明的微流控培養(yǎng)裝置沿圖1的A-A方向的縱剖圖；

圖3是本發(fā)明圖2所示的微流控培養(yǎng)裝置中細(xì)胞或微生物生長(zhǎng)情況示意圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)流程示意圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1的微流控培養(yǎng)裝置實(shí)物的微室及液體輸送通道中充滿色素溶液的顯微放大照片；

圖6A為本發(fā)明實(shí)施例1的微流控培養(yǎng)裝置的微室中天藍(lán)色鏈霉菌0小時(shí)生長(zhǎng)的明場(chǎng)顯微成像觀察；

圖6B為本發(fā)明實(shí)施例1的微流控培養(yǎng)裝置的微室中天藍(lán)色鏈霉菌培養(yǎng)20小時(shí)生長(zhǎng)的明場(chǎng)顯微成像觀察；

圖6C為本發(fā)明實(shí)施例1的微流控培養(yǎng)裝置的微室中天藍(lán)色鏈霉菌培養(yǎng)45小時(shí)生長(zhǎng)的明場(chǎng)顯微成像觀察；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例2的微流控培養(yǎng)裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例2的微流控培養(yǎng)裝置的局部放大圖；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例2的微流控培養(yǎng)裝置的實(shí)物圖。

以上附圖中，1為基片，2為蓋片；

21為液體輸送通道，211為輸液孔，212為排液孔，213為培養(yǎng)微室；

22為氣體輸送通道，221為通氣孔，222為排氣孔；

23為氣體腔室；

24為圍堰；

25為第二液體輸送通道。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行更加詳細(xì)的說(shuō)明，以便能夠更好地理解本發(fā)明的方案以及其各個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1

圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例1的微流控裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，包括基片1和蓋片2，蓋片2一面開設(shè)有凹槽，蓋片2設(shè)有凹槽的一面蓋設(shè)在基片1之上。

基片1的上表面與蓋片2的凹槽之間形成液體輸送通道21、氣體輸送通道22及氣體腔室23，氣體輸送通道22環(huán)繞液體輸送通道21設(shè)置，液體輸送通道21與氣體輸送通道22通過(guò)氣體腔室23相連通。液體輸送通道寬度為500μm，長(zhǎng)度為20mm，深度為40μm。

本實(shí)施例中基片1與蓋片2之間設(shè)有微柱組成的陣列，是許多個(gè)長(zhǎng)寬為50μm，高為1.5μm的微柱，可以起到支撐蓋片2的作用，在基片1與蓋片2之間形成一個(gè)1.5μm的狹縫，即形成了氣體腔室23。

氣體輸送通道22開設(shè)有與外界相連通的通氣孔221及排氣孔222；液體輸送通道21開設(shè)有與外界相連通的輸液孔211及排液孔212，輸液孔211的直徑為0.8mm。溶液接口直徑為0.6mm左右，能夠直接與連接外徑0.8mm的特氟龍泵管的注射器通過(guò)泵管連接。

液體輸送通道21開設(shè)有培養(yǎng)微室213，培養(yǎng)微室213的長(zhǎng)度為150μm，寬度為100μm，最大高度為15μm，培養(yǎng)微室213與液體輸送通道21相連接的一側(cè)口徑逐漸縮小。

微流控裝置的基片1和蓋片2均為玻璃(全氟硅烷化)材質(zhì)，整體透明，便于觀察記錄。

本實(shí)施例中的基片1和蓋片2表面均做了硅烷化處理，表面疏水，溶液表面張力較大，表面疏水化處理及培養(yǎng)微室213縮小的口徑保證溶液能被保留在培養(yǎng)微室內(nèi)的圍堰區(qū)域之內(nèi)，不存在泄漏。培養(yǎng)微室213的規(guī)格沒有固定要求，可根據(jù)要培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)。培養(yǎng)微室213縮小的口徑 還可以保證細(xì)胞在微室中生長(zhǎng)時(shí)不受輸送通道中液體流動(dòng)所產(chǎn)生的剪切力的影響。

本發(fā)明的微流控裝置使用的簡(jiǎn)要步驟如圖4所示，主要包括：

細(xì)胞或微生物懸液接種于微室：選取天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)作為模式菌株。天藍(lán)色鏈霉菌具有復(fù)雜的生命周期，包括機(jī)基內(nèi)菌絲、氣生菌絲及孢子絲階段，是研究多細(xì)胞分化的模式生物。將A3(2)從固體平板中刮下，置于MM(Minimal Medium)培養(yǎng)基中，用棉花過(guò)濾掉氣生菌絲，只剩下孢子，測(cè)量OD＝0.1左右，制成孢子懸液；用10μL移液器吸取孢子懸液從輸液孔211注入到液體輸送通道21及培養(yǎng)微室213中，隨后從排液孔212將通道中的溶液吸出，培養(yǎng)微室213由于具有收口構(gòu)型，液體輸送通道內(nèi)的液流對(duì)微室內(nèi)的沖激作用微弱，可保留引入的鏈霉菌孢子。

通入培養(yǎng)基：將液體培養(yǎng)基裝載到1mL的注射器中，并將注射器固定到可編程控制的注射泵上，以100nL/min的速度將液體培養(yǎng)基注入液體輸送通道21中，持續(xù)72小時(shí)。

通入氣體：本實(shí)施例中的氣體為空氣，由于空氣的擴(kuò)散速度很快，只需保持空氣通入通道的入口敞開，即可保證氣體微室內(nèi)氣生菌絲的生長(zhǎng)。

天藍(lán)色鏈霉菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程實(shí)時(shí)觀察與記錄：將微流控裝置放置于顯微鏡恒溫培養(yǎng)罩內(nèi)，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察鏈霉菌的生長(zhǎng)情況，并連續(xù)拍照記錄。圖6A為0小時(shí)：在培養(yǎng)微室成功接種單個(gè)天藍(lán)色鏈霉菌的孢子(白色箭頭所指)。圖6B為20小時(shí)：孢子經(jīng)過(guò)20小時(shí)的生長(zhǎng)，長(zhǎng)出了基內(nèi)菌絲(白色箭頭所指)；圖6C為45小時(shí)：溶液菌絲透過(guò)圍堰結(jié)構(gòu)，向空氣微室中生長(zhǎng)出氣生菌絲和孢子絲(白色箭頭所指)。利用本微流控芯片，可以清楚地觀察到天藍(lán)色鏈霉菌在不同階段的完整的生長(zhǎng)發(fā)育情況。

需要說(shuō)明的是，當(dāng)細(xì)胞或微生物生長(zhǎng)成熟時(shí)，可通過(guò)溶液輸入通道21打入戊二醛，對(duì)菌絲進(jìn)行固定，再將微流控裝置的蓋片打開，利用電子顯微鏡觀察細(xì)胞和微生物的高分辨率結(jié)構(gòu)或表面細(xì)微結(jié)構(gòu)。

為了進(jìn)一步說(shuō)明以上微流控裝置的操作，圖5展示了本發(fā)明實(shí)施例1的微流控裝置的實(shí)物圖。通道內(nèi)通入紅色素溶液。

需要說(shuō)明的是，可以根據(jù)需要向液體輸送通道中注入不同成分的培養(yǎng)基，研究不同的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽離子及pH對(duì)原核或真核細(xì)胞生長(zhǎng)分化 的影響。

也可以根據(jù)需要向氣體輸送通道注入不同成分的氣體，研究氧氣、二氧化碳等氣體對(duì)細(xì)胞或微生物生長(zhǎng)分化的影響。

實(shí)施例2

本發(fā)明也可以實(shí)現(xiàn)多次氣液交替界面的控制，以實(shí)現(xiàn)對(duì)自然環(huán)境中的土壤等復(fù)雜相界面中微生物和細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的模擬。圖7是本發(fā)明的實(shí)施例2的結(jié)構(gòu)示意圖。

裝置的通道結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1類似，從中間較寬的液體輸送通道21入口處通入放線菌孢子懸液，并持續(xù)流入培養(yǎng)基，在第二液體輸送通道25中可以通入培養(yǎng)基或含有其他不同組分的溶液，需要說(shuō)明的是，第二液體輸送通道25可以根據(jù)需要設(shè)有多個(gè)，各液體輸送通道周圍設(shè)置有與實(shí)施例1結(jié)構(gòu)相同的圍堰，以避免通道內(nèi)的液體漏出，第二液體輸送通道25外側(cè)還設(shè)置了氣體輸送通道22，各液體輸送通道之間形成氣體腔室23，并通過(guò)氣體腔室23分隔開，形成多個(gè)氣液界面的交替分布。孢子在培養(yǎng)微室213中生長(zhǎng)發(fā)育，長(zhǎng)出基內(nèi)菌絲，接觸到空氣后分化為氣生菌絲，再次遇到培養(yǎng)基后可以長(zhǎng)入其中，并發(fā)生可逆分化。通道的寬度范圍是200μm-1000μm。周圍的液體通道寬度為100μm，培養(yǎng)微室213長(zhǎng)度為350μm，寬度為200μm，最大高度為15μm。

利用第二液體輸送通道25，可以在氣生菌絲發(fā)育分化到一定階段后，通入培養(yǎng)基、水、重金屬溶液、有機(jī)油性液體或其它試劑溶液，觀察放線菌的氣生菌絲在遇到不同液體時(shí)的生長(zhǎng)分化行為。本方法的優(yōu)勢(shì)在于，可以連續(xù)創(chuàng)造多個(gè)氣液界面，并可對(duì)溶液成分進(jìn)行精確控制，實(shí)時(shí)觀察放線菌的生長(zhǎng)行為。

圖9是本發(fā)明的實(shí)施例2的微流控裝置的實(shí)物圖，為了演示功能，其中液體輸送通道21以及培養(yǎng)微室213通入紅色色素溶液、第二液體輸送通道25通入了綠色色素溶液。在各液體輸送通道之間，為氣體腔室。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也 無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。