本發(fā)明涉及一種多腔室基因分析反應(yīng)裝置，屬于生物技術(shù)和機(jī)械電子交叉領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：基因的多重?zé)晒夥治鰪纳鲜兰o(jì)90年代開(kāi)始在分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用，典型的是熒光聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）技術(shù)，也稱(chēng)為實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，它基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FluorescenceResonanceEnergyTransfer，F(xiàn)RET）原理，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中加入熒光基團(tuán)或熒光探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后對(duì)未知基因模板進(jìn)行定量或定性分析的方法，進(jìn)行熒光PCR的熒光PCR儀主要部件包括產(chǎn)生溫度梯度的熱力學(xué)結(jié)構(gòu)、進(jìn)行熒光激發(fā)的激發(fā)光源、對(duì)發(fā)射光進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)系統(tǒng)以及數(shù)據(jù)獲取分析軟件工作站。市場(chǎng)上的主要熒光PCR儀品牌型號(hào)包括美國(guó)Lifetechnologies公司7500型、7300型、StepOnePlus、Viia7型熒光PCR儀，羅氏公司LightCycler480型、LightCycler96型熒光PCR儀，BioRad公司CFX96型熒光PCR儀，以及安捷倫Stratagene公司Mx3000P型、Mx3005P型熒光PCR儀。這些熒光PCR儀在分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究的基因含量、單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）或者基因突變測(cè)定，臨床檢驗(yàn)中病原微生物或者致病基因定性、定量檢測(cè)，食品衛(wèi)生檢疫中的食品安全檢測(cè)，以及一些生物類(lèi)恐怖襲擊檢測(cè)領(lǐng)域等，都有廣泛的應(yīng)用。上述市場(chǎng)主流熒光PCR儀，通用反應(yīng)管耗材是0.1或0.2ml容量的單個(gè)反應(yīng)管、八聯(lián)管或者96孔板，用于盛放含有PCR組分和基因模板的反應(yīng)液并用于擴(kuò)增熒光信號(hào)檢測(cè)，但在單個(gè)反應(yīng)管中由于儀器熒光檢測(cè)波長(zhǎng)的限制，通常在520±15nm（FAM熒光報(bào)告基團(tuán)、SYBRGreen染料）、558±12nm（VIC、HEX、JOE熒光報(bào)告基團(tuán)）、587±10nm（NED、Cy3熒光報(bào)告基團(tuán)）、623±14nm（ROX、TexasRed熒光報(bào)告基團(tuán)）以及682±14nm（Cy5熒光報(bào)告基團(tuán)）這5個(gè)波長(zhǎng)檢測(cè)分別檢測(cè)1個(gè)基因（在沒(méi)有采用擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線分析條件下），因此最多最能分析5個(gè)基因；如果該樣本有更多的基因需要分析，則需要額外增加反應(yīng)管，增加人工操作并降低一次檢測(cè)的樣本數(shù)量，這極大地限制了熒光PCR在更高通量基因分析中的應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于操作、節(jié)能環(huán)保的多腔室基因分析反應(yīng)裝置，可以實(shí)現(xiàn)10～50個(gè)基因的高通量分析，適合在分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床分子診斷、食品安全基因檢測(cè)以及生物恐怖襲擊類(lèi)基因檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種多腔室基因分析反應(yīng)裝置，其特征在于，該反應(yīng)裝置包含主管a、支管b、腔室c和封堵物質(zhì)d結(jié)構(gòu)，1個(gè)主管a連接2～10個(gè)支管b的一端，每一支管b的另一端連接反應(yīng)腔室c，支管b和腔室c之間裝配有封堵物質(zhì)d，每個(gè)腔室內(nèi)含核酸擴(kuò)增反應(yīng)組分，用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)和基因分析。所述基因分析反應(yīng)裝置中的主管a、支管b、腔室c，為聚丙烯材料制備或者經(jīng)過(guò)蝕刻的微流控玻璃芯片，均為中空，可以容納液體或固體。所述基因分析反應(yīng)裝置中的腔室c，在進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)和基因分析時(shí)，不同基因采用不同熒光波長(zhǎng)分析，這些波長(zhǎng)為520±15nm、558±12nm、587±10nm、623±14nm以及682±14nm中的1～5個(gè)。所述基因分析反應(yīng)裝置中的封堵物質(zhì)d，為一種可計(jì)量微型閥門(mén)，能使定量體積液體通過(guò)管腔，或者將支管b和腔室c封閉隔斷。所述基因分析反應(yīng)裝置腔室中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)組分，含有有引物、熒光探針、脫氧核糖核苷三磷酸或者核糖核苷三磷酸、核酸聚合酶、核酸酶以及輔助酶作用的金屬離子，為液體狀態(tài)或玻璃化固體狀態(tài)；特別地，核酸擴(kuò)增反應(yīng)組分含有引物、熒光探針、脫氧核糖核苷三磷酸（即dNTPs，包括dATP、dGTP、dCTP、dUTP、dTTP）、TaqDNA聚合酶、尿嘧啶N糖基化酶（UNG酶）以及鎂離子。所述基因分析反應(yīng)裝置的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，是指PCR反應(yīng)，或者轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)（Transcription-MediatedAmplification，TMA）、鏈替代擴(kuò)增（StrandDisplacementAmplification，SDA）、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LigaseChainReaction，LCR）和依賴核酸序列的擴(kuò)增（Nucleic-AcidSequenceBasedAmplification，NASBA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-MediatedIsothermalAmplification，LAMP)、支鏈核酸信號(hào)放大系統(tǒng)（BranchedDNA，bDNA）、滾環(huán)擴(kuò)增（RollingCircleAmplification，RCA）這些核酸擴(kuò)增方法。所述基因分析反應(yīng)裝置使用時(shí)，當(dāng)基因核酸模板在外界壓力或電場(chǎng)作用下從主管分別經(jīng)支管流到各個(gè)反應(yīng)腔室中與核酸擴(kuò)增反應(yīng)組分混合，然后封堵物質(zhì)將腔室封閉，整個(gè)裝置放在具有熒光分析功能的熱循環(huán)儀上反應(yīng)，每個(gè)腔室中的基因核酸模板在熱循環(huán)或等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光分析，能實(shí)現(xiàn)5個(gè)基因的定性或定量檢測(cè)。裝置連接2個(gè)反應(yīng)腔室最多可以分析10個(gè)基因，連接10個(gè)腔室最多可以分析50個(gè)基因。所用基因核酸模板來(lái)源于動(dòng)物、植物、微生物、人工合成制備或擴(kuò)增獲得的DNA或者RNA。有益效果本發(fā)明根據(jù)上述設(shè)計(jì)的技術(shù)方案，在基因分析中使用設(shè)計(jì)的多腔室基因分析反應(yīng)裝置，所具有的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)和產(chǎn)生的有益效果如下：（1）高通量基因分析：傳統(tǒng)熒光PCR儀單個(gè)反應(yīng)管囿于波長(zhǎng)限制，一次檢測(cè)只能分析5個(gè)基因，而本發(fā)明反應(yīng)裝置最多能分析50個(gè)基因，大大提高了熒光PCR的基因分析工作效率。（2）節(jié)能環(huán)保：本發(fā)明反應(yīng)裝置體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，在相同基因分析數(shù)量上，和傳統(tǒng)熒光PCR比較具有輕便的特點(diǎn)，大大降低了試劑和耗材的消耗，達(dá)到節(jié)能環(huán)保的目的。（3）適合即時(shí)檢驗(yàn)（Point-of-caretesting，POCT）檢測(cè)：本發(fā)明裝置結(jié)合樣本核酸提取步驟，可以一步實(shí)現(xiàn)從樣本到檢測(cè)結(jié)果的全部過(guò)程，不僅操作簡(jiǎn)單，而且報(bào)告結(jié)果時(shí)間短，適合POCT檢測(cè)。附圖說(shuō)明附圖1為多腔室基因分析反應(yīng)裝置示意圖，展示了主管a、支管b，腔室c、封閉物質(zhì)d的連接順序，其中支管b，腔室c、封閉物質(zhì)d的數(shù)目最少分別有2個(gè)、最多有10個(gè)，即分別有一個(gè)反應(yīng)裝置有2～10個(gè)反應(yīng)腔室。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)技術(shù)常識(shí)對(duì)本發(fā)明作各種技術(shù)性改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例1：多腔室基因分析反應(yīng)裝置的制備和應(yīng)用（1）多腔室基因分析反應(yīng)裝置的制備按照說(shuō)明書(shū)附圖中主管a、支管b，腔室c、封閉物質(zhì)d的連接順序設(shè)計(jì)模具，并采用聚丙烯材料制備帶有2個(gè)腔室的基因分析反應(yīng)裝置。在2個(gè)腔室中分別裝入核酸擴(kuò)增引物探針，dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸聚合酶、UNG酶以及鎂離子，制備的2腔室基因分析反應(yīng)裝置用于血清樣本乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）的基因分型檢測(cè)。HBV基因分型引物探針采用文獻(xiàn)（JClinMicrobiol.2010Apr;48(4):1105–1111）表1中的As、Bps、Cps、D引物探針序列（4對(duì)HBV基因型引物、4條HBV基因型探針），但探針序列5’端依次分別采用FAM、JOE、Cy3、ROX熒光基團(tuán)標(biāo)記、3’端采用BHQ淬滅基團(tuán)標(biāo)記，分別基于HBVS抗原基因檢測(cè)我國(guó)常見(jiàn)的HBV基因型A、B、C、D。HCV基因分型引物探針采用文獻(xiàn)（JClinVirol.2005Oct;34(2):108-14）中的基因亞型引物探針（4對(duì)HCV基因型引物、4條HCV基因型探針），但針對(duì)HCV1-4基因型的探針Gt1probe～Gt4probe序列5’端依次分別采用FAM、JOE、Cy3、ROX熒光基團(tuán)標(biāo)記、3’端采用BHQ淬滅基團(tuán)標(biāo)記，基于HCV基因組5’端非編碼區(qū)序列檢測(cè)HCV1、2、3、4基因亞型。同時(shí)，采用本申請(qǐng)人申請(qǐng)的發(fā)明專(zhuān)利（201310742857.6，一種含內(nèi)參照的高靈敏Epstein-Barr病毒熒光定量PCR試劑盒）中采用的GAPDH基因引物探針作為內(nèi)參照引物探針，探針序列5’端Cy5熒光基團(tuán)標(biāo)記、3’端采用BHQ淬滅基團(tuán)標(biāo)記。將上述設(shè)計(jì)使用的HBV基因分型的12條引物探針、HCV基因分析型的12條引物探針、以及3條內(nèi)參照引物探針委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物為PAGE純化，探針為HPLC純化。在上述2個(gè)腔室的基因分析反應(yīng)裝置中，首先在2個(gè)腔室分別加入pH8.3的100mMTris-HCl3ul、500mMKCl3ul、10mMdNTPs（含有dATP、dGTP、dCTP、dUTP、dTTP各10mM）0.9ul、100mMMgCl21ul，TaqDNA聚合酶3U、UNG酶0.2U；然后在第1腔室加入8條濃度各10mMHBV基因型引物0.9ul、2條10mMGAPDH基因引物各0.45ul、4條濃度各10mMHBV基因型探針各0.6ul、10mMGAPDH基因探針0.3ul。第2個(gè)腔室加入SuperScript?III逆轉(zhuǎn)錄酶3U，8條濃度各10mMHCV基因型引物各0.9ul、2條10mMGAPDH基因引物各0.45ul、4條濃度各10mMHCV基因型探針各0.6ul、10mMGAPDH基因探針0.3ul。上述裝置放入臺(tái)式凍干機(jī)（Alpha1-4LSC型，德國(guó)Christ公司）凍干，此時(shí)核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物為無(wú)水玻璃化固體狀態(tài)，將反應(yīng)裝置置于4℃保存。（2）多腔室基因分析反應(yīng)裝置的在血清HBV/HCV基因分型中應(yīng)用采集經(jīng)臨床核酸定量檢測(cè)確定為病毒性肝炎的患者血清5例，采用本申請(qǐng)人發(fā)明專(zhuān)利（ZL201010621890.X，一種用于生物樣品中核酸提取純化的細(xì)胞裂解試劑）中病毒DNA/RNA磁珠結(jié)合共提取方法，每例樣本提取獲得核酸100ul，立即進(jìn)行檢測(cè)。取上述制備保存的2個(gè)腔室的基因分析反應(yīng)裝置，平衡到室溫，在主管a加入上述提取的100ul核酸模板，在外界壓力作用下，液體模板分別流入2個(gè)腔室各30ul時(shí)，相應(yīng)的微型閥關(guān)閉，腔室中固體反應(yīng)組分被核酸模板液體溶解，反應(yīng)體系為30ul。將反應(yīng)裝置轉(zhuǎn)入帶熒光分析功能的熱循環(huán)儀擴(kuò)增檢測(cè)，反應(yīng)程序?yàn)?0℃10min、94℃5min后，按照94℃15sec、60℃1min循環(huán)擴(kuò)增40次，并在每次循環(huán)的60℃采集FAM、JOE、Cy3、ROX、Cy5五個(gè)波長(zhǎng)（對(duì)應(yīng)520±15nm、558±12nm、587±10nm、623±14nm以及682±14nm）熒光信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后按照軟件分析，以有明顯擴(kuò)增、呈現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線的結(jié)果判斷為陽(yáng)性。5例樣本檢測(cè)結(jié)果如表1所示，上述制備的基因分析反應(yīng)裝置對(duì)臨床病毒性肝炎患者樣本能完整地在一次檢測(cè)中完成HBV、HCV基因分型結(jié)果的測(cè)定，和目前常規(guī)使用的熒光PCR方法比較，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速的優(yōu)點(diǎn)。表1本發(fā)明基因分析反應(yīng)裝置對(duì)血清HBV/HCV基因分析結(jié)果結(jié)果血清1血清2血清3血清4血清5HBV基因型C型B型A型C型D型HCV基因型3型1型4型2型1型內(nèi)參照陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性實(shí)施例2：多腔室基因分析反應(yīng)裝置的制備和應(yīng)用（1）多腔室基因分析反應(yīng)裝置的制備按照說(shuō)明書(shū)附圖中主管a、支管b，腔室c、封閉物質(zhì)d的連接順序設(shè)計(jì)模具，并采用玻璃硅材料和微機(jī)電系統(tǒng)（MEMS，Micro-Electro-MechanicalSystem）技術(shù)，在硅片上刻蝕加工制備了帶有2個(gè)腔室的微流控芯片基因分析反應(yīng)裝置。在2個(gè)腔室中分別裝入核酸擴(kuò)增引物探針，dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、UNG酶以及鎂離子，制備的2腔室基因分析反應(yīng)裝置用于泌尿生殖道樣本常見(jiàn)性傳播疾病病原體（沙眼衣原體，淋球菌，解脲支原體，生殖支原體，人乳頭瘤病毒6、11、16、18型）的核酸檢測(cè)檢測(cè)。沙眼衣原體（CT）、淋球菌（NG）、解脲支原體（UU）、生殖支原體（Mg）核酸檢測(cè)引物探針采用文獻(xiàn)（IntJMolEpidemiolGenet.2013Sep12;4(3):167-74）表1中的引物探針序列（CT-Plasmid-FP/CT-Plasmid-RP/CT-Plasmid-Probe、NG-FP/NG-RP/NG-Probe、UP-UU-FP/UP-UU-RP/UU-Probe、MG-FP/MG-RP/MG-Probe，共4對(duì)引物、4條探針），但探針序列5’端依次分別采用FAM、JOE、Cy3、ROX熒光基團(tuán)標(biāo)記、3’端采用BHQ淬滅基團(tuán)標(biāo)記，不同波長(zhǎng)分別檢測(cè)臨床常見(jiàn)的CT、NG、UU、Mg病原體。HPV6/11兩個(gè)亞型，16/18兩個(gè)亞型引物探針?lè)謩e采用本申請(qǐng)人申請(qǐng)的發(fā)明專(zhuān)利（201511007550.7，一種高靈敏人乳頭瘤病毒6,11型核酸檢測(cè)試劑盒；201110448224.5，人乳頭瘤病毒（HPV）16,18型多通道熒光PCR檢測(cè)方法與試劑盒）引物探針，其中6/11兩個(gè)亞型共用1對(duì)引物，6型探針序列5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)、11型探針序列5’端標(biāo)記改為JOE熒光基團(tuán)，16/18兩個(gè)亞型各有1對(duì)引物及探針，16型探針序列5’端標(biāo)記改為Cy3熒光基團(tuán)，18型探針序列5’端標(biāo)記改為ROX熒光基團(tuán)，HPV6/11/16/18檢測(cè)4條探針的3’端均采用BHQ淬滅基團(tuán)標(biāo)記。同時(shí)，采用本申請(qǐng)人申請(qǐng)的發(fā)明專(zhuān)利（201310742857.6，一種含內(nèi)參照的高靈敏Epstein-Barr病毒熒光定量PCR試劑盒）中采用的GAPDH基因引物探針作為內(nèi)參照引物探針，探針序列5’端Cy5熒光基團(tuán)標(biāo)記、3’端采用BHQ淬滅基團(tuán)標(biāo)記。將上述設(shè)計(jì)使用的CT、NG、UU、Mg核酸檢測(cè)的12條引物探針、HPV6/11/16/18型檢測(cè)10條引物探針、以及3條內(nèi)參照引物探針委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物為PAGE純化，探針為HPLC純化。在上述2個(gè)腔室的微流控芯片基因分析反應(yīng)裝置中，首先在2個(gè)腔室分別加入pH8.3的100mMTris-HCl3ul、500mMKCl3ul、10mMdNTPs（含有dATP、dGTP、dCTP、dUTP、dTTP各10mM）0.9ul、100mMMgCl21ul，TaqDNA聚合酶3U、UNG酶0.2U；然后在第1腔室加入8條濃度各10mMCT、NG、UU、Mg引物各0.9ul、2條10mMGAPDH基因引物各0.45ul、4條濃度各10mMCT、NG、UU、Mg探針各0.6ul、10mMGAPDH基因探針0.3ul，加入去離子水補(bǔ)足體積到26ul，用微型閥門(mén)密封腔室。第2個(gè)腔室加入6條濃度各10mMHPV6/11/16/18基因型引物各0.9ul、2條10mMGAPDH基因引物各0.45ul、4條濃度各10mMHPV6/11/16/18基因型探針各0.6ul、10mMGAPDH基因探針0.3ul，加入去離子水補(bǔ)足體積到26ul，用微型閥門(mén)密封腔室。上述微流控芯片基因分析反應(yīng)裝置置于-20℃保存。（2）多腔室基因分析反應(yīng)裝置的在泌尿生殖道分泌物病原體檢測(cè)中應(yīng)用收集臨床性病門(mén)診患者泌尿生殖道分泌物漂洗液樣本10例，取漂洗液樣本200ul，13000rpm離心10min后棄上清，在沉淀中加入50ul含有20mMNaOH、1%吐溫20的核酸裂解液，漩渦混勻后100℃保溫10min，13000rpm離心2min，每例樣本吸取上清獲得核酸提取物約50ul，立即進(jìn)行檢測(cè)。取上述制備保存的2個(gè)腔室的基因分析反應(yīng)裝置，平衡到室溫，在主管a加入上述提取的50ul核酸模板，在外界壓力作用下，液體模板分別流入2個(gè)腔室各4ul時(shí)，相應(yīng)的微型閥關(guān)閉。將反應(yīng)裝置轉(zhuǎn)入帶熒光分析功能的熱循環(huán)儀擴(kuò)增檢測(cè)，反應(yīng)程序?yàn)?0℃2min、94℃5min后，按照94℃15sec、60℃1min循環(huán)擴(kuò)增40次，并在每次循環(huán)的60℃采集FAM、JOE、Cy3、ROX、Cy5五個(gè)波長(zhǎng)（對(duì)應(yīng)520±15nm、558±12nm、587±10nm、623±14nm以及682±14nm）熒光信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后按照軟件分析，以有明顯擴(kuò)增、呈現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線的結(jié)果判斷為陽(yáng)性。10例樣本檢測(cè)結(jié)果如表2所示，上述制備的基因分析反應(yīng)裝置對(duì)臨床性病門(mén)診患者泌尿生殖道樣本中常見(jiàn)的8種性傳播疾病病原體（沙眼衣原體，淋球菌，解脲支原體，生殖支原體，人乳頭瘤病毒6、11、16、18型）一次檢測(cè)獲得信息，和目前常規(guī)使用的熒光PCR方法比較，具有體積微小、操作簡(jiǎn)便快速、報(bào)告結(jié)果時(shí)間短的優(yōu)勢(shì)。表2本發(fā)明基因分析反應(yīng)裝置對(duì)泌尿生殖道分泌物病原體基因分析結(jié)果樣本病原體內(nèi)參照樣本病原體內(nèi)參照分泌物1CT，UU，HPV6陽(yáng)性分泌物6CT，UU，HPV6陽(yáng)性分泌物2NG，HPV6/11陽(yáng)性分泌物7HPV6/11/16/18陽(yáng)性分泌物3UU，Mg，HPV6/11陽(yáng)性分泌物8CT，HPV16陽(yáng)性分泌物4HPV16/18陽(yáng)性分泌物9UU，HPV6/11陽(yáng)性分泌物5CT，NG，HPV11陽(yáng)性分泌物10NG，Mg，HPV18陽(yáng)性當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3