本發(fā)明涉及N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Lys),涉及它的制備方法，涉及它的抗血栓活性，涉及它的溶血栓活性，涉及它治療腦缺血大鼠的作用，因而本發(fā)明涉及它在制備抗血栓藥物,溶血栓藥物和治療缺血性中風(fēng)藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

缺血性中風(fēng)是一類較常見且危害嚴(yán)重的腦血管疾病，特點(diǎn)是發(fā)病率高、病死率高、致殘率高和復(fù)發(fā)率高。目前臨床治療缺血性中風(fēng)面臨沒有有效藥物的現(xiàn)實(shí)，尤其中風(fēng)面4h以上的患者非死即殘。發(fā)明對(duì)中風(fēng)面4h以上的患者有效的藥物是臨床的重要需求。發(fā)明人曾經(jīng)公開式II的咪唑啉化合物在中風(fēng)面24h的大鼠缺血性中風(fēng)模型上，顯示優(yōu)秀療效。即連續(xù)靜脈注射6天式II的咪唑啉化合物，每天1次，首次劑量為5μmol/kg，后5次的劑量為2μmol/kg具有優(yōu)秀療效。式中aa₁和aa₂可為同時(shí)存在,aa₁存在但aa₂不存在,或同時(shí)不存在；當(dāng)aa₁和aa₂同時(shí)存在時(shí),aa₁為R(Arg),且aa₂為G(Gly),A(Ala)或Q(Gln)；當(dāng)aa₁存在但aa₂不存在時(shí),aa₁為R(Arg)；aa₃可為S(Ser),V(Val)或F(Phe)。由于式II的咪唑啉化合物的2-位是4-氧乙酰-Lys。而該Lys的側(cè)鏈氨基和主鏈羧基分別與RGD抗血栓四肽及ARPAK溶栓肽相連接,所以結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜需要簡(jiǎn)化。

發(fā)明人經(jīng)過3年實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)用3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲?；嫔鲜街械?-取代苯基咪唑啉基,用Lys(Lys)二肽基代替上式中的長(zhǎng)肽基可以獲得結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和療效好的雙重意想不到的技術(shù)效果。按照這個(gè)發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人提出了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1.本發(fā)明的內(nèi)容之一是提供下式的N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Lys)

2.本發(fā)明的內(nèi)容之二是提供N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Lys)的制備方法,該方法由以下方法構(gòu)成:

(1)制備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-羧酸；

(2)制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Boc)-OBzl；

(3)制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys-OBzl；

(4)制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Lys)。

3.本發(fā)明的內(nèi)容之三是評(píng)價(jià)N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Lys)的抗血栓活性。

4.本發(fā)明的內(nèi)容之四是評(píng)價(jià)N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Lys)的溶血栓活性。

5.本發(fā)明的內(nèi)容之五是評(píng)價(jià)N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Lys)在腦缺血24h后治療腦缺血的活性。

附圖說明

圖1是N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Lys)的合成路線.i)丙酮,三氟乙酸,MgSO₄；ii)DCC,HOBt,NMM；iii)氯化氫-乙酸乙酯溶液(4M),冰??；iv)乙醇,Pd/C。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1液相接肽反應(yīng)通法

將N端保護(hù)的原料以無(wú)水DMF溶解，向得到的溶液中加入N-羥基苯并三氮唑(HOBt)。冰浴下緩慢加入用無(wú)水DMF溶解的N,N-二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)，0℃攪拌15分鐘得到反應(yīng)液(I)。羧端保護(hù)的原料也用無(wú)水DMF溶解，用N-甲基嗎啉(NMM)調(diào)pH至9，然后與反應(yīng)液(I)混合，用N-甲基嗎啉維持pH 9，室溫?cái)嚢?0小時(shí)，TLC監(jiān)測(cè)原料點(diǎn)消失后，反應(yīng)混合物過濾，濾液減壓濃縮，得到粘稠狀物質(zhì)用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液洗，5％KHSO₄水溶液洗，飽和NaCl水溶液洗，乙酸乙酯相加無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干,殘留物經(jīng)柱層析純化(二氯甲烷/甲醇,50/1)，得到 目標(biāo)化合物。

實(shí)施例2脫Boc通法

將Boc保護(hù)的肽類化合物用少量的無(wú)水乙酸乙酯溶解，冰浴攪拌下加入氯化氫-乙酸乙酯溶液(4M)。TLC顯示原料點(diǎn)消失后，反應(yīng)溶液用水泵反復(fù)抽干，除凈氯化氫氣體，殘留物用石油醚反復(fù)研磨，得到目標(biāo)化合物。

實(shí)施例3脫芐酯基通法

將芐基保護(hù)的肽類化合物用適量的乙醇溶解，加入鈀碳(反應(yīng)物量的10％)，通入氫氣室溫氫解。反應(yīng)結(jié)束后過濾,減壓濃縮，得到目標(biāo)化合物。

實(shí)施例4制備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸(1)

將5.0g(25mmol)3,4-二羥基-L-苯丙氨酸用250mL丙酮溶解。向得到的溶液中加入6.0g(30mmol)無(wú)水硫酸鎂。30分鐘后，冰浴下加入25mL三氟醋酸(TFA)，之后室溫?cái)嚢?6h，TLC(二氯甲烷/甲醇，1:1)顯示原料點(diǎn)消失。反應(yīng)液過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用丙酮溶解繼續(xù)減壓濃縮，反復(fù)3次。殘留物加200mL無(wú)水乙醚，析出5.8g(95％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e):238[M+H]⁺；¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ/ppm＝6.61(s,1H),6.45(s,1H),3.70(dd,J＝3.9,11.4Hz,1H),2.76(dd,J＝11.7,15.3Hz,1H),2.62(m,1H),1.41(s,3H),1.32(s,3H)。

實(shí)施例5制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Boc)-OBzl(2)

按照實(shí)施例1的方法，從1.19g(5.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸和2.83g(5.53mmol)HCl·Lys(Boc)-OBzl得到1.64g(59％)標(biāo)題化合物,為淺粉色粉末。ESI-MS(m/e):556[M+H]⁺；¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ/ppm＝8.64(s,1H),8.52(s,1H),8.14(d,J＝7.5Hz,1H),7.36(m,5H),6.74(m,1H),6.57(s,1H),6.37(s,1H),5.14(m,2H),4.30(m,1H),3.55(m,2H),3.32(m,2H),2.88(m,2H),2.57(d,J＝3.9Hz,1H),2.27(m,1H),2.15(s,1H),1.69(m,4H),1.36(s,9H),1.33(s,3H),1.25(s,3H)。

實(shí)施例6制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys-OBzl(3)

按照實(shí)施例2的通法，從1.50g(2.73mmol)N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Boc)-OBzl得到1.01g(82％)標(biāo)題化合物，為淺粉色固體，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS(m/e):456[M+H]⁺。

實(shí)施例7制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)- Lys[Boc-Lys(Z)]-OBzl(4)

按照實(shí)施例1的方法，從0.982g(2mmol)N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys-OBzl和0.836g(2.2mmol)Boc-Lys(Z)得到0.703g(43％)標(biāo)題化合物,為無(wú)色粉末。ESI-MS(m/e):818[M+H]⁺。

實(shí)施例8制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys[Lys(Z)]-OBzl(5)

按照實(shí)施例2的方法,從0.7g(0.86mmol)N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys[Boc-Lys(Z)]-OBzl制得0.615g(95％)標(biāo)題化合物,為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e):718[M+H]⁺。

實(shí)施例9制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Lys)(6)

按照實(shí)施例3的方法,以143mg(0.2mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲?；?Lys[Lys(Z)]-OBzl制得77mg(78％)標(biāo)題化合物,為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e):494[M+H]⁺.¹H NMR(800MHz,DMSO):δ/ppm＝9.044(b,1H),8.857(b,1H),8.345(t,J＝5.6Hz,2H).6.645(s,1H),6.498(s,1H),4.156(m,1H),3.634(m,1H),3.231(m,1H),3.165(m,1H),2.824(m,1H),2.787(m,3H),1.683(m,4H),1.578(s,3H),1.507(m,3H),1.440(s,3H),1.297(m,4H).¹³C NMR(125MHz,DMSO):δ/ppm＝173.80,168.78,145.09,144.97,123.55,121.94,120.34,118.74,115.35,112.57,53.32,52.71,51.51,49.06,38.97,38.77,31.64,31.22,30.69,29.34,28.89,28.40,27.25,22.92,21.73。

實(shí)驗(yàn)例1評(píng)價(jià)化合物8的抗血栓活性

將雄性SD大鼠(200±20g)，隨機(jī)分組，每組10只，飼養(yǎng)1天，停止喂食過夜。灌胃給予化合物6的生理鹽水溶液(劑量為1nmol/kg)或阿司匹林的生理鹽水溶液(劑量為167μmol/kg)或生理鹽水(劑量為10mL/kg)30min之后，大鼠用20％烏來糖的生理鹽水溶液麻醉，之后手術(shù)。分離大鼠的右頸動(dòng)脈和左頸靜脈，將準(zhǔn)確稱重的絲線置于旁路插管，管的一端插入左靜脈，另一端管插入右側(cè)動(dòng)脈并注射0.2mL肝素鈉抗凝。使得血流從右側(cè)動(dòng)脈流經(jīng)旁路插管進(jìn)入左側(cè)靜脈，15min之后取出附有血栓的絲線稱量，計(jì)算血液循環(huán)前后絲線的重量，得到的血栓重,以均值±SD mg表示并代表抗血栓活性，作t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)列入表1。結(jié)果表明口服1nmol/kg化合物6能有效地抑制血栓形成。說明本發(fā)明獲得了意想不到的技術(shù)效果。

表1 1nmol/kg化合物6的抗血栓活性

n＝10；a)與生理鹽水相比p<0.01.

實(shí)驗(yàn)例2評(píng)價(jià)化合物6的溶血栓活性

SD大鼠(雄性，200±20g)按1200mg/kg的劑量腹腔注射烏拉坦生理鹽水溶液進(jìn)行麻醉。麻醉大鼠后將其仰臥位固定，分離其右頸總動(dòng)脈，近心端處夾住動(dòng)脈夾，將近心端及遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，遠(yuǎn)心端的手術(shù)線結(jié)扎，遠(yuǎn)心端插管，將動(dòng)脈夾松開，取出約1mL動(dòng)脈血，置于1mL離心管中。往垂直固定的橡膠管(長(zhǎng)15mm，內(nèi)徑2.5mm，外徑5.0mm，管底用膠塞密封，para膜封緊)內(nèi)注入0.1mL大鼠動(dòng)脈血，隨后在管內(nèi)迅速插入一支不銹鋼材質(zhì)的血栓的固定螺栓(血栓固定螺旋用直徑為0.2mm的不銹鋼絲繞成，螺旋部分長(zhǎng)10mm，內(nèi)含15個(gè)螺圈，螺圈的直徑為1.0mm托柄與螺旋相連，長(zhǎng)約7.0mm，呈問號(hào)型)。血液凝固45min后，從玻璃管中小心取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精確稱其重量。

旁路插管由三部分構(gòu)成，中間段為長(zhǎng)60.0mm，內(nèi)徑3.5mm的聚乙烯膠管；兩端均為長(zhǎng)100.0mm，內(nèi)徑1.0mm，外徑2.0mm的相同的聚乙烯管，該管一端拉成尖管，長(zhǎng)約10.0mm(用于插入大鼠頸動(dòng)脈及靜脈)，外徑為1.0mm，其另一端的外部套一段長(zhǎng)為7.0mm，外徑為3.5mm的聚乙烯管(用于插入中段的聚乙烯膠管內(nèi))，3段管的內(nèi)壁均需要硅烷化(1％的硅油乙醚溶液)。將血栓包裹的血栓固定螺旋置于中段聚乙烯膠管內(nèi)，膠管的另外兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套，保證在循環(huán)的過程中不會(huì)漏血。用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IU/kg)，排除氣泡，備用。

分離大鼠的左頸外靜脈，近心端和遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端的血管，在暴露的左頸外靜脈上剪一小口，將上述制備好的旁路管道尖管由小口插入左頸外靜脈開口處，同時(shí)遠(yuǎn)離旁路管中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)內(nèi)血栓固定螺旋。用注射器通過另一端的尖管注入準(zhǔn)確量的肝素鈉的生理鹽水溶液(50IU/kg)，此時(shí)注射器不要撤離聚乙烯管，用動(dòng)脈夾夾住注射器與聚乙烯管之間的軟管。在右頸總動(dòng)脈的近心端用動(dòng)脈夾止血，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，在離動(dòng)脈夾不遠(yuǎn)處將右頸總動(dòng)脈剪一小口，從聚乙烯管的尖部拔出注射器，將聚乙烯管的尖部插入動(dòng)脈斜口的近心端。旁路管道的兩端均用4號(hào)手術(shù)縫線將動(dòng)靜脈固定。

用頭皮針將生理鹽水(3mL/kg)或尿激酶的生理鹽水溶液(劑量為20000IU/kg)或化合物6 的生理鹽水溶液(劑量為1nmol/kg)通過旁路管的中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)，扎入遠(yuǎn)離血栓固定螺旋的近靜脈端，松開動(dòng)脈夾，使血流通過旁路管道從動(dòng)脈流向靜脈。將注射器中的溶液緩慢注入血液，通過血液循環(huán)，按靜脈-心臟-動(dòng)脈的順序作用于螺旋的血栓上。血液循環(huán)1h之后，從旁路管道中取出固定血栓的螺旋，精確稱量。計(jì)算每只大鼠旁路管道中固定血栓的螺旋血液循環(huán)前后血栓的重量差，以均值±SD mg表示并代表溶血栓活性，作t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)列入表2。結(jié)果表明1nmol/kg化合物6能有效地溶解形成的血栓。說明本發(fā)明獲得了意想不到的技術(shù)效果。

表2 1nmol/kg化合物6的溶血栓活性

n＝10；a)與生理鹽水比p<0.01,與尿激酶相比p>0.05.

實(shí)驗(yàn)例3評(píng)價(jià)化合物6對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠的治療作用

在雄性SD大鼠(體重300±20g)的頸部正中部豎直開約2cm長(zhǎng)切口,沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)緣分離出右頸總動(dòng)脈,頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈。用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾分別夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈開口處和頸總動(dòng)脈近心端,結(jié)扎頸外動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端,在頸外動(dòng)脈剪1小口,松開頸總動(dòng)脈近心端的動(dòng)脈夾,取10μL血,之后再用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈的近心端。將取得的10μL血放置在1mL EP管中常溫放置30分鐘使血液凝固,然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱中放置1小時(shí),使血液凝塊結(jié)實(shí)。大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉,劑量為400mg/kg。取出血液凝塊,加入1mL生理鹽水,用鋼鏟把血液凝塊搗成大小均一的細(xì)小血栓塊,制備細(xì)小血栓的懸液并轉(zhuǎn)移至1mL注射器內(nèi)。松開頸總動(dòng)脈近心端的動(dòng)脈夾，將1mL血栓混懸液緩慢從大鼠頸外動(dòng)脈向近心端經(jīng)過頸內(nèi)動(dòng)脈注入大鼠的大腦,然后結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端,打開頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈處得動(dòng)脈夾,恢復(fù)血流。等待蘇醒。大鼠蘇醒24小時(shí)后按Zealonga方法評(píng)定神經(jīng)功能缺損程度。0分表示無(wú)任何神經(jīng)功能缺失體征,1分表示未損傷側(cè)前肢不能伸展,2分表示向未損傷側(cè)行走,3分表示向未損傷側(cè)轉(zhuǎn)圈成追尾狀行走,4分表示意識(shí)障礙無(wú)自主行走,5分表示死亡。按照得分平均分組。各組大鼠經(jīng)尾靜脈每天注射1次化合物6劑量為1nmol/kg。連續(xù)注射6天，每天評(píng)分。結(jié)果列入表3。表3的數(shù)據(jù)表明,化合物6連續(xù)治療6天可使11只腦缺血24小時(shí)的大鼠神經(jīng)生物學(xué)評(píng)分為0分，可使1只腦缺血24小時(shí)的大鼠神經(jīng)生物學(xué)評(píng)分為神經(jīng)生物學(xué)評(píng)分為1分。因?yàn)椴幌褚呀?jīng)公開的化合物首次劑量需要5μmol/kg,后5次維持 劑量需要2μmol/kg,化合物6的6次劑量均為1nmol/kg。這樣一來,首次劑量和維持劑量分別降低了5000倍和2000倍。

表3 化合物6連續(xù)治療6天對(duì)腦缺血24小時(shí)大鼠神經(jīng)生物學(xué)評(píng)分的影響

n＝12,目標(biāo)化合物劑量＝1nmol/kg,鼠尾靜脈注射給藥。