本發(fā)明屬于菌類(lèi)制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種多孢菌的制備方法。

背景技術(shù)：

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)研究的一部分，通過(guò)檢測(cè)微生物細(xì)胞內(nèi)所有代謝物的狀態(tài)，代謝組學(xué)可以提供細(xì)胞在某一狀態(tài)精確的表型。目前分子檢測(cè)技術(shù)以及后基因組時(shí)代“組學(xué)”技術(shù)的發(fā)展促使代謝組學(xué)成為系統(tǒng)生物學(xué)研究的又一重要手段。

微生物代謝組學(xué)的研究目標(biāo)是針對(duì)微生物細(xì)胞內(nèi)代謝物組的檢測(cè)與分析。生命體細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程非?；钴S，某些代謝物轉(zhuǎn)換時(shí)間非常短暫，通常在1-2s，因此，代謝物樣品的過(guò)程對(duì)代謝組學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)造成巨大影響，甚至?xí)?dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果的產(chǎn)生。一般微生物代謝組學(xué)樣品的處理過(guò)程包括快速取樣、滅活和代謝物的提取三個(gè)過(guò)程。刺糖多孢菌是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁較厚，尤其是作為一種中性嗜鹽菌，它能耐受11g/L的氯化鈉，因此胞內(nèi)滲透壓極大，這進(jìn)一步加大了代謝組學(xué)樣品處理的難度。目前，還沒(méi)有通用的代謝組學(xué)樣品處理方法能夠快速有效的將微生物胞內(nèi)所有代謝物統(tǒng)一提取到提取液中,所以研究?jī)?yōu)化刺糖多孢菌代謝組學(xué)樣品處理方法對(duì)其代謝組學(xué)方面的研究具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種多孢菌代謝物的提取效果好、操作簡(jiǎn)便的制備方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明包括以下步驟。

1）將瓊脂、葡萄糖、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、MgSO4?7H2O滅菌20min。

2）將葡萄糖、MgSO4?7H2O、N-Z-AmineA、牛肉膏、酵母粉、滅菌20min。

3）將葡萄糖、玉米漿、MgSO4?7H2O、棉籽蛋白、蛋白胨、麥芽糖、CaCO3滅菌20min。

4）使用三角瓶，培養(yǎng)2天作為發(fā)酵所用的種子。

5）發(fā)酵培養(yǎng)使用三角瓶，每瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基接種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。

作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述瓊脂，2g/L；葡萄糖，10g/L；酵母粉，3g/L；牛肉膏，1g/L；蛋白胨10g/L；MgSO4?7H2O，2g/L；N-Z-AmineA，30g/L；牛肉膏，2g/L；玉米漿，15g/L；棉籽蛋白，24g/L；；麥芽糖，2g/L；CaCO3，5g/L。

作為另一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述使用250mL三角瓶，每瓶裝液30mL，置于30℃，200rpm下培養(yǎng)2天作為發(fā)酵所用的種子。

發(fā)酵培養(yǎng)使用250mL三角瓶，每瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基30mL，接1mL種子培養(yǎng)液，置于30℃75條件下，220rpm培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。

另外，本發(fā)明還包括以下步驟。

6）取10mL發(fā)酵液，用0.45μm微濾膜進(jìn)行過(guò)濾，并用預(yù)冷至4℃的蒸餾水洗滌兩次，抽干得到菌體，于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

7）冷甲醇滅活刺糖多孢菌培養(yǎng)72h，將2mL發(fā)酵液用注射器噴入8mL預(yù)冷至-80℃的冷甲醇中，5000轉(zhuǎn)離心2min，移除上清液，保存菌體于液氮中備用。

本發(fā)明有益效果。

本發(fā)明通過(guò)對(duì)刺糖多孢菌代謝組學(xué)樣品處理過(guò)程的優(yōu)化，建立了適于刺糖多孢菌代謝組學(xué)研究的樣品處理方法。首先對(duì)刺糖多孢菌菌體的滅活方法進(jìn)行了研究，通過(guò)考察快速過(guò)濾和冷甲醇淬滅兩種常用的代謝組學(xué)細(xì)胞滅活方式，發(fā)現(xiàn)冷甲醇淬滅能快速滅活細(xì)胞并能使細(xì)胞快速定格在某一特定的生理狀態(tài)，最終確定了冷甲醇淬滅作為刺糖多孢菌細(xì)胞滅活的方式。另外，還考察了冷甲醇提取，反復(fù)凍融和液氮研磨對(duì)刺糖多孢菌代謝物的提取效果。結(jié)果表明，液氮研磨更能有效地破碎刺糖多孢菌細(xì)胞，使胞內(nèi)代謝物盡可能的釋放到胞外。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明包括以下步驟。

1）將瓊脂、葡萄糖、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、MgSO4?7H2O滅菌20min。

2）將葡萄糖、MgSO4?7H2O、N-Z-AmineA、牛肉膏、酵母粉、滅菌20min。

3）將葡萄糖、玉米漿、MgSO4?7H2O、棉籽蛋白、蛋白胨、麥芽糖、CaCO3滅菌20min。

4）使用三角瓶，培養(yǎng)2天作為發(fā)酵所用的種子。

5）發(fā)酵培養(yǎng)使用三角瓶，每瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基接種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。

所述瓊脂，2g/L；葡萄糖，10g/L；酵母粉，3g/L；牛肉膏，1g/L；蛋白胨10g/L；MgSO4?7H2O，2g/L；N-Z-AmineA，30g/L；牛肉膏，2g/L；玉米漿，15g/L；棉籽蛋白，24g/L；；麥芽糖，2g/L；CaCO3，5g/L。

所述使用250mL三角瓶，每瓶裝液30mL，置于30℃，200rpm下培養(yǎng)2天作為發(fā)酵所用的種子。

發(fā)酵培養(yǎng)使用250mL三角瓶，每瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基30mL，接1mL種子培養(yǎng)液，置于30℃75條件下，220rpm培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。

本發(fā)明還包括以下步驟。

6）取10mL發(fā)酵液，用0.45μm微濾膜進(jìn)行過(guò)濾，并用預(yù)冷至4℃的蒸餾水洗滌兩次，抽干得到菌體，于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

7）冷甲醇滅活刺糖多孢菌培養(yǎng)72h，將2mL發(fā)酵液用注射器噴入8mL預(yù)冷至-80℃的冷甲醇中，5000轉(zhuǎn)離心2min，移除上清液，保存菌體于液氮中備用。

本發(fā)明菌體破碎方式采用以下步驟。

1）冷甲醇提取取100mg濕菌體于離心管中，加入2mL預(yù)冷至-40℃的冷甲醇（60%），85混勻后在漩渦振蕩器中震蕩1min，然后5000轉(zhuǎn)離心4min（-4℃）。上述操作完成后將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，并于-80℃條件保存。

2）冷甲醇反復(fù)凍融取100mg濕菌體于離心管中，加入2mL預(yù)冷至-40℃的冷甲醇（60%），于液氮中冷凍2min，再在4℃條件下放置5min，如此反復(fù)凍融5次。然后5000轉(zhuǎn)離心4min（-4℃），轉(zhuǎn)移上清于另一離心管中保存在-80℃冰箱。

3）液氮研磨將濕菌體放置在預(yù)冷至-80℃的研缽中，在液氮中研磨5min成乳白色細(xì)粉。取100mg研磨的乳白色細(xì)粉于離心管中，加入2mL預(yù)冷的甲醇水溶液（-40℃）。

原始LC-MS數(shù)據(jù)通過(guò)Xcalibur2.0.5轉(zhuǎn)化成NetCDF格式以后，用在線XCMS軟件進(jìn)行滯留時(shí)間校正、峰匹配和峰解析。對(duì)信噪比S/N小于10的峰排除，不予進(jìn)行下一步的分析。對(duì)于代謝物種類(lèi)的推定，則根據(jù)它們的MS/MS離子碎片從各數(shù)據(jù)庫(kù)中檢測(cè)所的到。

根據(jù)樣品LC-MS/MS檢測(cè)的母離子及其ESI離子轟擊碎片結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索進(jìn)行定性。將離子碎片及其相對(duì)豐度輸入METLIN質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索框中可得到具有相似結(jié)構(gòu)的代謝物離子碎片圖，然后進(jìn)行比對(duì)。在20V電壓轟擊下，主要離子碎片有97.0,101.0和125.0，與數(shù)據(jù)庫(kù)中物質(zhì)進(jìn)行比對(duì)，推定該物質(zhì)為四氫嘧啶（ectoine）。

細(xì)胞內(nèi)的代謝物庫(kù)會(huì)隨著細(xì)胞周?chē)h(huán)境的變化迅速的改變。在代謝組學(xué)研究過(guò)程中，如何快速有效的淬滅細(xì)胞，并將細(xì)胞胞內(nèi)代謝物庫(kù)的組成停格在細(xì)胞特定的狀態(tài)，是代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵之一。鑒于以往并沒(méi)有關(guān)于刺糖多孢菌代謝組學(xué)的研究，對(duì)比了兩種代謝組學(xué)研究常用的細(xì)胞滅活方法，冷甲醇淬滅和快速離心的方法。將兩種滅活方式檢測(cè)到的代謝物及其相應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明，對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明所提交的權(quán)利要求書(shū)確定的保護(hù)范圍。