本發(fā)明屬于微生物藥物領(lǐng)域，具體涉及一株高產(chǎn)洋橄欖葉素類化合物的菌株及該類化合物的制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：
紅樹(shù)林是位于海洋與陸地之間的特殊生態(tài)系統(tǒng)，近年來(lái)從該環(huán)境中分離到了很多放線菌新種和新型化合物，這使得紅樹(shù)林放線菌資源的研究越來(lái)越受到人們的重視。洋橄欖葉素(elaiophylin)是一個(gè)具有C2-對(duì)稱性的十六元環(huán)大環(huán)雙內(nèi)酯抗生素，文獻(xiàn)報(bào)道該化合物具有抗革蘭氏陽(yáng)性菌(包括MRSA、VRE等)和抗部分真菌的活性；增強(qiáng)雷帕霉素抗白色念珠菌的活性；抗寄生蟲(chóng)活性；抗腫瘤活性，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞周期等；用作免疫抑制劑，能抑制NO合成，產(chǎn)生抗炎作用；作為瘤胃動(dòng)物增長(zhǎng)促進(jìn)劑；用作植物生長(zhǎng)抑制劑及作為P-typease專一性抑制劑(K+依賴性ATP酶)用于研究ATPase的作用機(jī)制等。迄今報(bào)道的洋橄欖葉素產(chǎn)生菌均為鏈霉菌，包括生孢鏈霉菌(S.melanosoprus)、吸水鏈霉菌(S.hygroscopicus)、白色鏈霉菌(S.albus)、紫黑鏈霉菌(S.violaceoniger)、假輪枝鏈霉菌(S.pseudoverticillus)、小小鏈霉菌(S.parvullus)等。目前，產(chǎn)量最高的發(fā)酵方法是以吸水鏈霉菌作為發(fā)酵菌種，最高發(fā)酵產(chǎn)量為2120mg/L。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的之一是提供三個(gè)新的洋橄欖葉素衍生物。本發(fā)明的目的之二是提供一種高產(chǎn)洋橄欖葉素衍生物的鏈霉菌。本發(fā)明的目的之三是提供一種利用所述鏈霉菌制備洋橄欖葉素衍生物的方法。本發(fā)明的目的之四是提供洋橄欖葉素衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種洋橄欖葉素衍生物，為2-甲基洋橄欖葉素、2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄欖葉素或13'-去2-脫氧巖藻糖-13'-O-甲基洋橄欖葉素。其中，2-甲基洋橄欖葉素為式Ⅰ所示化合物1，其分子式為C55H90O18，分子量為1038.6；2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄欖葉素為式Ⅱ所示化合物2，其分子式為C57H94O18，分子量為1066.6；13'-去2-脫氧巖藻糖-13'-O-甲基洋橄欖葉素為式Ⅲ所示化合物3，其分子式為C49H80O15，分子量為908.6。一種高產(chǎn)洋橄欖葉素衍生物的鏈霉菌，為保藏編號(hào)為CCTCCNO：M2015276的鏈霉菌219807(Streptomycessp.219807)。鏈霉菌219807從采自中國(guó)海南省三亞紅樹(shù)林的土壤樣品中分離得到，經(jīng)分類學(xué)研究和分子生物學(xué)研究鑒定為鏈霉菌(Streptomycessp.)，并保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏編號(hào)：CCTCCNO：M2015276；分類命名：鏈霉菌219807Streptomycessp.219807；保藏日期：2015年05月04日；保藏地址：中國(guó)武漢、武漢大學(xué))。該菌株的16SrRNA基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的鏈霉菌219807生產(chǎn)的洋橄欖葉素衍生物包括上述式Ⅰ-Ⅲ所示的化合物1-3和下述式Ⅳ所示的化合物4-7、式Ⅴ所示的化合物8：化合物4-8分別為：洋橄欖葉素、11-O-甲基洋橄欖葉素、11,11'-O-二甲基洋橄欖葉素、14'-去乙基-14'-甲基洋橄欖葉素、11',12'-脫水洋橄欖葉素。一種利用鏈霉菌219807制備所述洋橄欖葉素衍生物(化合物1-8)的方法，包括如下步驟：(1)將鏈霉菌219807經(jīng)平板活化后接種于ISP2液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)接到DO培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵；所述的DO培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖10g/L，糊精25g/L，燕麥粉20g/L，棉籽餅粉10g/L，魚(yú)粉5g/L，酵母提取物2g/L，CaCO33g/L，pH值為6.0。(2)將步驟(1)獲得的發(fā)酵液經(jīng)固液分離后，菌絲體用丙酮超聲破碎提取，減壓濃縮至不含丙酮后，用乙酸乙酯萃取，濃縮得粗提物。(3)將步驟(2)獲得的粗提物在硅膠中用環(huán)己烷和丙酮組成的洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。(4)將步驟(3)獲得的含有目的化合物的洗脫液濃縮，通過(guò)半制備液相分離純化得到化合物1-8。步驟(3)中所述的硅膠優(yōu)選為300-400目的硅膠。優(yōu)選的，所述的利用鏈霉菌219807制備所述洋橄欖葉素衍生物(化合物1-8)的方法，包括如下步驟：(1)將鏈霉菌219807經(jīng)平板活化后接種于ISP2液體培養(yǎng)基中，28℃、220r/min振蕩培養(yǎng)3d，再以10％的接種量接種到DO培養(yǎng)基中，28℃、220r/min振蕩培養(yǎng)8d。(2)將步驟(1)獲得的發(fā)酵液經(jīng)固液分離后，菌絲體用丙酮超聲破碎提取三次，合并提取液，減壓濃縮至不含丙酮后，用等量乙酸乙酯萃取三次，得菌絲體提取物的乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮至干得粗提物。(3)將步驟(2)獲得的粗取物在硅膠中進(jìn)行梯度洗脫，依次用體積比分別為9:1、7:1、5:1、3:1、7:3、3:2、1:1、2:3、1:3、1:5的環(huán)己烷和丙酮組成的十個(gè)洗脫液進(jìn)行洗脫，依次獲得十個(gè)洗脫液洗出的組分。(4)將步驟(3)獲得含有目的化合物的各組分減壓濃縮或合并后減壓濃縮，再進(jìn)行C18半制備液相分離純化，得到化合物1-8。步驟(2)和(4)中所述減壓濃縮的溫度為35-37℃。本發(fā)明采用MTT法測(cè)試了所述洋橄欖葉素及其衍生物(化合物1-8)對(duì)子宮頸癌細(xì)胞Hela和乳腺癌細(xì)胞MCF-7的50％抑制濃度(IC50)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示洋橄欖葉素及其衍生物對(duì)所試驗(yàn)的腫瘤細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤活性。表明所述洋橄欖葉素衍生物可用作制備抗腫瘤藥物。而以所述洋橄欖葉素衍生物作為活性成分，與藥學(xué)上可接受的一種或多種載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗腫瘤的藥物組合物。所述藥物及藥物組合物可用于腫瘤相關(guān)疾病的治療。所述化合物也可與已知藥物組成復(fù)方制劑用于腫瘤相關(guān)疾病的治療。本發(fā)明中經(jīng)鏈霉菌219807發(fā)酵制備式Ⅰ-Ⅴ所示洋橄欖葉素衍生物的方法，可適用于其它能產(chǎn)生此類化合物的任何微生物。本發(fā)明中還包括式Ⅳ、式Ⅵ、式Ⅶ所示其它洋橄欖葉素衍生物，在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。式Ⅳ、式Ⅵ、式Ⅶ中的取代基團(tuán)如下：R1，R2＝氫或羥基包括但不限于甲氧基、乙氧基等C1～C5烷氧基取代基，乙烯氧基、丙烯氧基等C2～C6烯氧基取代基，C2～C6炔氧基、C3～C6環(huán)烷氧基、甲酰氧基、乙酰氧基等C1～C5酰氧基；苯氧基等C6～C12芳環(huán)氧基；C-11－C-12：可以是單鍵或雙鍵；C-11'－C-12'：可以是單鍵或雙鍵；R3＝R4＝氫或甲基，包括但不限于乙基、丙基等C2～C5飽和烷基取代基，乙烯、丙烯等C2～C6烯基取代基，C2～C6炔基、C3～C6環(huán)烷基；R5＝氫，包括但不限于甲基、乙基、丙基等C1～C5飽和烷基取代基，乙烯、丙烯等C2～C6烯基取代基，C2～C6炔基、C3～C6環(huán)烷基、甲?；⒁阴；菴1～C5?；槐交菴6～C12芳環(huán)基團(tuán)；R6＝氫，包括但不限于甲基、乙基、丙基等C1～C5飽和烷基取代基，乙烯、丙烯等C2～C6烯基取代基，C2～C6炔基、C3～C6環(huán)烷基、甲?；⒁阴；菴1～C5酰基；苯基等C6～C12芳環(huán)基團(tuán)。而以所述洋橄欖葉素衍生物作為活性成分，與藥學(xué)上可接受的一種或多種載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗腫瘤的藥物組合物。所述藥物及藥物組合物可用于腫瘤相關(guān)疾病的治療。所述化合物也可與已知藥物組成復(fù)方制劑用于腫瘤相關(guān)疾病的治療。本發(fā)明中所述的鏈霉菌219807(保藏編號(hào)為CCTCCNO.M2015276的中國(guó)海南省三亞紅樹(shù)林土壤放線菌鏈霉菌)是一株高產(chǎn)洋橄欖葉素的菌株，產(chǎn)量達(dá)到4486mg/L。附圖說(shuō)明圖1是2-甲基洋橄欖葉素(化合物1)的高分辨質(zhì)譜圖。圖2是2-甲基洋橄欖葉素(化合物1)的1H-NMR譜。圖3是2-甲基洋橄欖葉素(化合物1)的13C-NMR譜。圖4是2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄欖葉素(化合物2)的高分辨質(zhì)譜圖。圖5是2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄欖葉素(化合物2)的1H-NMR譜。圖6是2-甲基-11,11'-O-二甲基洋橄欖葉素(化合物2)的13C-NMR譜。圖7是13'-去2-脫氧巖藻糖-13'-O-甲基洋橄欖葉素(化合物3)的高分辨質(zhì)譜圖。圖8是13'-去2-脫氧巖藻糖-13'-O-甲基洋橄欖葉素(化合物3)的1H-NMR譜。圖9是13'-去2-脫氧巖藻糖-13'-O-甲基洋橄欖葉素(化合物3)的13C-NMR譜。圖10是洋橄欖葉素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例1鏈霉菌219807的分離、鑒定與保藏從采自中國(guó)海南省三亞紅樹(shù)林的土壤樣品中分離得到菌株219807，并經(jīng)分類學(xué)研究和分子生物學(xué)研究鑒定為鏈霉菌(Streptomycessp.)，并保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏編號(hào)：CCTCCNO：M2015276；分類命名：鏈霉菌219807Streptomycessp.219807；保藏日期：2015年05月04日；保藏地址：中國(guó)武漢、武漢大學(xué))。鏈霉菌219807的16SrRNA基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。實(shí)施例2鏈霉菌219807大量發(fā)酵及其發(fā)酵物樣品前處理方法將鏈霉菌219807經(jīng)平板活化后接種于ISP2液體培養(yǎng)基中，28℃、220r/min振蕩培養(yǎng)3d，按照10％接種量接種到5LDO培養(yǎng)基中，28℃、220r/min振蕩培養(yǎng)8d，獲得發(fā)酵液。將發(fā)酵液經(jīng)固液分離后，菌絲體用丙酮超聲破碎提取，減壓濃縮至不含丙酮后，用乙酸乙酯萃取，濃縮得粗提物。所述的ISP2液體培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖4g/L，酵母提取物4g/L，麥芽提取物10g/L，pH值為7.2；所述的DO培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖10g/L，糊精25g/L，燕麥粉20g/L，棉籽餅粉10g/L，魚(yú)粉5g/L，酵母提取物2g/L，CaCO33g/L，pH值為6.0。實(shí)施例3化合物的分離及結(jié)構(gòu)確認(rèn)(1)化合物分離將實(shí)施例2中獲得的粗提物溶于適量甲醇后拌入硅膠，采用干法上樣在300～400目的硅膠中進(jìn)行梯度洗脫，依次用體積比分別為9:1、7:1、...