本發(fā)明涉及生物醫(yī)學檢驗技術領域，具體涉及自動識別稀有細胞的方法及系統(tǒng)。

背景技術：

免疫熒光染色作為識別特異性細胞最常用的工具之一，其操作流程便捷，效果直接，在細胞鑒定、醫(yī)學診斷、抗體表達檢測等方面有著廣泛的應用。基于鋪片染色識別的激光捕獲顯微切割（Laser Capture Microdissection，LCM）計數(shù)，相比于流式分離單細胞技術，對細胞的損傷更小，更加有利于腫瘤的分子生物學研究。當鋪片細胞數(shù)量較少時，熒光顯微鏡下很容易肉眼尋找到目的細胞。然而，當細胞數(shù)量級較大（超過10⁵），同時目的細胞數(shù)量較為稀少時，人工搜尋符合熒光條件的特異性細胞變得極為困難。當特異性細胞對自身抗體的陽性表達不強時，熒光素多標情況下從數(shù)以十萬計的普通細胞中識別少量特異性細胞，人工尋找?guī)缀醪豢赡茏龅?。存在于癌癥轉移病人外周血中的循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells，CTC）便屬于這一類稀有細胞，大約每10億個正常血細胞中才會存在1-10個CTC。即使是使用各種正篩負篩富集方法大量減少血細胞后再進行熒光染色識別，由于熒光自發(fā)淬滅，CTC對特異性抗體表達不強，鋪片區(qū)域過大，肉眼極限等條件的限制，人工尋找CTC總是顯得異常艱難，亟需研發(fā)一種針對熒光圖像進行處理并識別目的細胞的技術。

技術實現(xiàn)要素：

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種自動識別稀有細胞的方法，包括：

圖像獲取步驟：將攜帶有稀有細胞的細胞富集液注入制備的涂片裝置，按照標準免疫染色流程對細胞染色并通過熒光顯微鏡進行多熒光通道拍照，得到熒光圖像；

圖像處理步驟：將所述熒光圖像利用圖像處理算法處理為背景灰度值嚴格為零且同時保留細胞輪廓內的真實熒光值的干凈圖像，對所述干凈圖像進行細胞輪廓提??；

統(tǒng)計識別步驟：對提取出的每個輪廓統(tǒng)計對應多熒光通道的每個通道的平均熒光強度值，根據(jù)統(tǒng)計結果確定出所述稀有細胞。

進一步地，所述涂片裝置包括載玻片，所述載玻片的一親水性表面緊密鍵合由聚二甲基硅氧烷PDMS構成的膜，所述膜的一部分沿封閉形狀缺失并形成凹槽于所述親水性表面。

優(yōu)選地，所述涂片裝置的制備包括：

按預定質量比配置PDMS和固化劑，攪拌使其充分混合，將均勻混合的PDMS和固化劑混合液導入干凈玻璃皿，抽真空去除攪拌過程中產生的氣泡，將去除氣泡后的混合液進行烘烤使其固化，冷卻后得到PDMS膜；

在所述PDMS膜的中間沿封閉形狀切割一區(qū)域，將切割后的PDMS膜與載玻片緊密鍵合，得到所述涂片裝置。

進一步地，所述圖像處理步驟包括：

背景處理子步驟：對所述熒光圖像進行先腐蝕后膨脹處理，得到強背景圖像，再將所述熒光圖像減去所述強背景圖像得到去背景圖像；

二值化子步驟：利用最大類間方差法對所述去背景圖像進行二值化處理，得到二值圖像；

恢復初始值子步驟：根據(jù)所述去背景圖像和所述二值圖像，利用圖像矩陣點乘算法確定干凈圖像，所述干凈圖像中背景灰度值為零，同時有熒光之處的灰度值恢復為對應的原始熒光灰度值。

優(yōu)選地，所述圖像處理步驟還包括：

在進行所述背景處理子步驟之前，將所述熒光圖像分割成若干塊小圖，對每個小圖分別執(zhí)行所述背景處理子步驟、二值化子步驟和恢復初始值子步驟，然后將小圖處理后的輸出結果進行拼接得到對應于所述熒光圖像的最終的干凈圖像。

進一步地，所述多熒光通道包括DAPI熒光通道、TRITC熒光通道和FITC熒光通道，所述統(tǒng)計識別步驟包括：

對提取出的每個輪廓，按照DAPI熒光值排序以去除輪廓內無細胞核的雜質；

按照TRITC熒光值排序，標記總細胞中TRITC熒光值相比預設低值還小的細胞；

按照FITC熒光值排序，如果所標記的細胞的FITC熒光值相比預設高值還大，則確定該細胞為所述稀有細胞；

進一步地，所述統(tǒng)計識別步驟還包括：在進行TRITC熒光值排序前，按照延伸度排序以去除奇怪形狀的雜質。

進一步地，所述方法還包括：在確定出所述稀有細胞后對所述稀有細胞進行計數(shù)。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種自動識別稀有細胞的系統(tǒng)，包括：

圖像獲取模塊，用于將攜帶有稀有細胞的細胞富集液注入制備的涂片裝置，按照標準免疫染色流程對細胞染色并通過熒光顯微鏡進行多熒光通道拍照，得到熒光圖像；

圖像處理模塊，用于將所述熒光圖像利用圖像處理算法處理為背景灰度值嚴格為零且同時保留細胞輪廓內的真實熒光值的干凈圖像，對所述干凈圖像進行細胞輪廓提??；

統(tǒng)計識別模塊，用于對提取出的每個輪廓統(tǒng)計對應多熒光通道的每個通道的平均熒光強度值，根據(jù)統(tǒng)計結果確定出所述稀有細胞。

進一步地，所述圖像處理模塊包括：

背景處理單元，用于對所述熒光圖像進行先腐蝕后膨脹處理，得到強背景圖像，再將所述熒光圖像減去所述強背景圖像得到去背景圖像；

二值化單元，用于利用最大類間方差法對所述去背景圖像進行二值化處理，得到二值圖像；

恢復初始值單元，用于根據(jù)所述去背景圖像和所述二值圖像，利用圖像矩陣點乘算法確定干凈圖像，所述干凈圖像中背景灰度值為零，同時有熒光之處的灰度值恢復為對應的原始熒光灰度值。

進一步地，所述多熒光通道包括DAPI熒光通道、TRITC熒光通道和FITC熒光通道，所述統(tǒng)計識別模塊包括：

DAPI處理單元，用于對提取出的每個輪廓，按照DAPI熒光值排序以去除輪廓內無細胞核的雜質；

TRITC處理單元，用于按照TRITC熒光值排序，標記總細胞中TRITC熒光值相比預設低值還小的細胞；

FITC處理單元，用于按照FITC熒光值排序，如果所標記的細胞的FITC熒光值相比預設高值還大，則確定該細胞為所述稀有細胞；

進一步地，所述統(tǒng)計識別模塊還包括：延伸處理單元，用于在進行TRITC熒光值排序前，按照延伸度排序以去除奇怪形狀的雜質。

本發(fā)明的有益效果是：通過將獲得的熒光圖像處理成背景灰度值嚴格為零，同時保留細胞輪廓內的真實熒光值，使得背景噪聲對細胞輪廓提取的影響降到最低，并且是對通過多熒光通道得到的熒光圖像，從更多參數(shù)確認識別細胞，提高了對稀有細胞的染色識別。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一種實施例的自動識別稀有細胞的方法的流程示意圖。

圖2為本發(fā)明一種實施例中涉及的涂片裝置的結構示意圖。

具體實施方式

以下通過具體實施方式結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。其中，以稀有細胞為CTC為例進行說明，當然，本發(fā)明同樣適用于其它類似CTC的稀有細胞。

實施例1

本實施例提供的一種自動識別稀有細胞的方法的流程示意圖如圖1所示，包括：將攜帶有稀有細胞的細胞富集液注入制備的涂片裝置、按照標準免疫染色流程對細胞染色并通過熒光顯微鏡進行多熒光通道拍照以得到熒光圖像的圖像獲取步驟S10，將熒光圖像利用圖像處理算法處理為背景灰度值嚴格為零且同時保留細胞輪廓內的真實熒光值的干凈圖像、然后對干凈圖像進行細胞輪廓提取的圖像處理步驟S20，以及對提取出的每個輪廓統(tǒng)計對應多熒光通道的每個通道的平均熒光強度值并根據(jù)統(tǒng)計結果確定出稀有細胞的統(tǒng)計識別步驟S30。下面對各步驟給出具體描述。

在對病人血液樣本采用各種正向或負向篩選方法富集之后，通常細胞數(shù)量仍然會很大，由于血液中CTC數(shù)量極為稀少，涂片染色中的每一步都要特別注意避免細胞數(shù)量的丟失，如果涂片染色只是單純在載玻片上進行，由于細胞固定程度、液體流動等原因，難免會造成細胞隨液體溢散而丟失，同時，涂片區(qū)域難以控制，區(qū)域過小，會造成細胞非常密集，給后期圖像處理和識別增加難度；區(qū)域過大，掃描時間消耗過長，圖片過大也會導致后期分析計算的困難。對此，本實施例提出了一種涂片裝置，其包括載玻片，載玻片的一親水性表面緊密鍵合由聚二甲基硅氧烷（PDMS）構成的膜，膜的一部分沿封閉形狀缺失并形成凹槽于該親水性表面。具體地，該涂片裝置的制備過程如下：

按預定質量比配置PDMS和固化劑，攪拌使其充分混合，例如PDMS:固化劑按10:1進行混合；

把拋光的硅片光滑面放入大小合適的干凈玻璃皿中，將均勻混合的PDMS和固化劑混合液導入干凈玻璃皿，抽真空去除攪拌過程中產生的氣泡，之后把玻璃皿（去除氣泡后的混合液）置于烤箱中進行烘烤使其固化，例如在90℃下烘烤一小時；

烘烤結束后冷卻后至室溫得到PDMS膜，之后揭膜；

在PDMS膜的中間沿封閉形狀切割一區(qū)域，例如使用手術刀片在PDMS膜中間整齊切割出1.5cm*1.5cm的方形區(qū)域，剩下的PDMS膜實際上是中空的，中控部分就是1.5cm*1.5cm的方形區(qū)域；

將切割后剩下的PDMS膜與載玻片緊密鍵合，之后將邊緣切割整齊，即得到涂片裝置，如圖2所示。

由于PDMS特有的表面性質能保證其與載玻片緊密鍵合，凹槽能保證涂片染色時細胞不丟失，又能方便確定掃描區(qū)域；從而，通過設計的涂片裝置，既避免了稀有細胞在染色操作過程的流失，也能方便設定掃描區(qū)域（涂片區(qū)域），防止造成有細胞未被掃描而遺漏。

這里以有轉移的睪丸癌樣本作為具體示例對圖像獲取步驟S10進行說明。例如采集了4mL體積的初始血樣，經過紅細胞裂解之后按照尺寸大小經過微流控芯片富集（CTC尺寸一般大于正常白細胞），將富集得到的大尺寸細胞懸液注入涂片裝置的PDMS凹槽，按照標準免疫染色流程對細胞染色，然后通過熒光顯微鏡進行多熒光通道拍攝以得到熒光圖像，例如采用Nikon熒光掃描顯微鏡將該凹槽內的樣本進行三通道曝光掃描，F(xiàn)ITC通道綠色熒光識別CTC，TRITC通道橙色熒光識別白細胞，呈藍色熒光的DAPI通道識別細胞核。

在圖像處理步驟S20中，將得到的多通道熒光圖像進行處理。該步驟想要實現(xiàn)的功能為，對熒光圖像自動識別前景和背景，并對背景像素強制令其灰度值為零，同時保留住細胞輪廓內的原始熒光值；從而，經過此步驟S20處理之后，細胞輪廓圖像的提取不再受背景噪聲的影響，只要閾值最小值不為零，即可以很準確的提取到細胞輪廓。

在圖像處理領域，可以自動辨別背景最常見的方法為最大類間方差法（OTSU），其基本思想是對輸入的灰度圖像進行直方圖分析，當類間方差達到最大時，認為此時選取的灰度為最佳區(qū)分前景和背景的閾值。然而，當染色片子曝光時間過長，或者是片子本身染色質量的問題，常常會導致細胞周圍部分背景熒光值較強，部分背景熒光較弱，也即在圖像上除了細胞熒光，還出現(xiàn)了強弱兩種背景熒光，此時僅使用OTSU算法往往會失效（出現(xiàn)雙峰，背景識別不清）。因此，本實施例的圖像處理步驟S20采用的策略是：在OTSU算法前進行減背景處理。具體地，圖像處理步驟包括：對于熒光圖像首先利用先腐蝕后膨脹處理來提取強背景，得到強背景圖像，再將原圖像（熒光圖像）減去此強背景圖像，得到去背景圖像，之后對去背景圖像進行OTSU二值化處理，得到二值圖像；最后，利用圖像矩陣點乘算法處理去背景圖像和二值圖像，得到干凈圖像，該干凈圖像中背景灰度值為零，同時有熒光之處的灰度值恢復為對應的原始熒光灰度值。

一種具體實現(xiàn)中采用Matlab提供的圖像處理工具箱實現(xiàn)圖像處理步驟S20，例如，對于熒光圖像A，利用Matlab提供的開函數(shù)imopen（其實現(xiàn)的是先腐蝕后膨脹處理）提取強背景，在將原圖像A減去此強背景（即A-imopen(A)），之后進行二值化處理，將有熒光的前景輪廓全部置為1，背景熒光值全部置為0，得到二值圖像B，利用圖像矩陣點乘算法C=B.*(A-imopen(A))，得到干凈圖像C，該干凈圖像中，被認為是背景的地方，熒光值全為零；有細胞熒光的地方，熒光值恢復為初始值。熒光圖像經過Matlab預處理之后，背景會變得非常干凈，對于灰度范圍是0-255的8bit熒光圖，背景處理后最理想的情況是，閾值只要設置為1-255，就可以將細胞輪廓大致提取出來，不再敏感地受到背景灰度的影響。

對于得到的干凈圖像，提取出細胞輪廓，可以通過熒光閾值限制、形狀限制、面積大小限制、坐標位點限制等來進行目標輪廓選取，例如按照熒光閾值、面積大小和圓度值對細胞輪廓進行提取，具體可參考已有相關技術實現(xiàn)，在此不作詳述；然后對該輪廓內的各種參數(shù)進行分析和排序，由于極大程度地去除了背景影響，對每個輪廓內統(tǒng)計的各個通道平均熒光強度值較為可信，則可最終判定目的細胞（即稀有細胞）。通常染色鑒定CTC的判斷標準為CK（cytokeratin，細胞角蛋白，腫瘤標記物）陽性，CD45（白細胞共同抗原）陰性，DAPI（識別細胞核）陽性，分析這三個熒光通道的相對強弱，結合細胞形狀和核型，就可以對CTC做出判斷。

在統(tǒng)計識別步驟S30中，首先按照DAPI熒光值排序，可以把輪廓內無細胞核的雜質去除；之后按照CD45-TRITC熒光值排序，標記總細胞數(shù)量5%的TRITC熒光最弱的細胞（通常CTC含量不會超過此比例）；再按照CK-FITC熒光值排序，如果發(fā)現(xiàn)有前一步標記過的細胞其FITC熒光值較強，即為最疑似的CTC，最終由人工確認并計數(shù)該細胞。一種優(yōu)選實施例中，在進行TRITC熒光值排序前，按照延伸度（Elongation）排序，進一步將奇形怪狀的雜質去除。

這里仍以前述的示例進行舉例，將得到的三通道熒光圖像按照前述流程處理，排除雜質圖像影響后提取得到的細胞輪廓數(shù)為5755，由于CTC幾乎都不表達CD45抗體，因此首先按照TRITC灰度值排序，對前200具有最低TRITC熒光值的細胞打上“×”標記，之后再按照FITC熒光值排序，按照FITC強弱依次觀察帶有“×”標記的細胞，得到最疑似CTC的細胞（即稀有細胞）。

在確定出稀有細胞后，還可以對稀有細胞進行計數(shù)等后續(xù)處理。

基于上述方法實施例，本發(fā)明一種實施例還提供了一種自動識別稀有細胞的系統(tǒng)，其包括：圖像獲取模塊，用于將攜帶有稀有細胞的細胞富集液注入制備的涂片裝置，按照標準免疫染色流程對細胞染色并通過熒光顯微鏡進行多熒光通道拍照，得到熒光圖像；圖像處理模塊，用于將所述熒光圖像利用圖像處理算法處理為背景灰度值嚴格為零且同時保留細胞輪廓內的真實熒光值的干凈圖像，對所述干凈圖像進行細胞輪廓提取；統(tǒng)計識別模塊，用于對提取出的每個輪廓統(tǒng)計對應多熒光通道的每個通道的平均熒光強度值，根據(jù)統(tǒng)計結果確定出所述稀有細胞。所述圖像處理模塊包括：背景處理單元，用于對所述熒光圖像進行先腐蝕后膨脹處理，得到強背景圖像，再將所述熒光圖像減去所述強背景圖像得到去背景圖像；二值化單元，用于利用最大類間方差法對所述去背景圖像進行二值化處理，得到二值圖像；恢復初始值單元，用于根據(jù)所述去背景圖像和所述二值圖像，利用圖像矩陣點乘算法確定干凈圖像，所述干凈圖像中背景灰度值為零，同時有熒光之處的灰度值恢復為對應的原始熒光灰度值。所述多熒光通道包括DAPI熒光通道、TRITC熒光通道和FITC熒光通道，所述統(tǒng)計識別模塊包括：DAPI處理單元，用于對提取出的每個輪廓，按照DAPI熒光值排序以去除輪廓內無細胞核的雜質；TRITC處理單元，用于按照TRITC熒光值排序，標記總細胞中TRITC熒光值相比預設低值還小的細胞；FITC處理單元，用于按照FITC熒光值排序，如果所標記的細胞的FITC熒光值相比預設高值還大，則確定該細胞為所述稀有細胞；進一步地，所述統(tǒng)計識別模塊還包括：延伸處理單元，用于在進行TRITC熒光值排序前，按照延伸度排序以去除奇怪形狀的雜質。各模塊及其涉及的各單元的實現(xiàn)及功能描述可參考前述方法實施例的相應部分，在此不作詳述。

本實施例的自動識別稀有細胞的方法或系統(tǒng)相比傳統(tǒng)在實驗掃描部分和圖像分析部分均作出了改進，在實驗掃描部分采用了自行設計的涂片裝置，PDMS特有的表面性質能保證其與載玻片緊密鍵合，該凹槽能保證涂片染色時細胞不丟失，又能方便確定掃描區(qū)域；在圖像分析部分，首先將初始熒光圖像處理成背景灰度值嚴格為零，同時保留細胞輪廓內的真實熒光值，然后將處理后的圖像按照熒光閾值分割提取細胞輪廓并后續(xù)分析，由于圖像背景熒光嚴格為零，背景噪聲對細胞輪廓提取的影響將被降到最低，相比于普通的基于圖像識別的細胞計數(shù)方法（這些方法通常用簡單的同一閾值分割來人為設定一個閾值，存在閾值設置過高時非稀有細胞輪廓被選擇、而閾值設置過低時引入非常多背景噪聲的問題），該方法從更多參數(shù)確認識別細胞，并能實現(xiàn)多個熒光灰度值的排序，非常適用于所有類似CTC等稀有細胞的染色識別和計數(shù)，為臨床實踐提供較可靠的支持。

實施例2

本實施例和實施例1的不同之處在于，考慮到熒光掃描顯微鏡進行多通道熒光掃描時得到的圖像通常很大，例如大于5G，Matlab計算時被分配到的內存十分有限，處理這樣大的矩陣顯然非常緩慢，因此，本實施例相比實施例1，在進行前述圖像處理步驟S20時，首先將熒光圖像分割成若干塊小圖，例如保證每張小圖不大于30M，Matlab按照文件名搜索循環(huán)讀入小圖并處理，即對每個小圖分別執(zhí)行背景處理、二值化和恢復初始值等子步驟，然后將所有小圖處理后的輸出結果進行拼接，即可得到對應于原始熒光圖像的最終的干凈圖像。此外，批處理小圖像相比較于對整張大圖分析，在某些背景熒光較強的區(qū)域，背景識別更加準確。

實施例3

本實施例和實施例1或實施例2的不同之處在于，在得到干凈圖像后，可以對干凈圖像添加偽彩以便人工觀察。具體如何添加偽彩可以參考已有相關技術實現(xiàn)，在此不作詳述。

綜上，本發(fā)明提供的自動識別稀有細胞的方法或系統(tǒng)，其涉及到諸如循環(huán)腫瘤細胞等稀有細胞的免疫染色，圖像鑒定識別和計數(shù)，通過設計PDMS涂片凹槽，既避免了稀有細胞在染色操作過程中的流失，也能方便設定掃描區(qū)域，防止造成有細胞未被掃描而遺漏；在圖像識別部分經過背景處理之后的細胞熒光圖像背景十分干凈，背景熒光值嚴格為零，細胞輪廓保持原有形狀，輪廓內的灰度值保持原始值不變。由于對背景進行特殊化處理，使得能夠精確提取出細胞輪廓，從而對提取出的輪廓進行的熒光參數(shù)統(tǒng)計的結果可靠，由此可以很容易且準確地在圖像中確定出CTC。

本領域技術人員可以理解，上述實施方式中各種方法的全部或部分步驟可以通過程序來指令相關硬件完成，該程序可以存儲于一計算機可讀存儲介質中，存儲介質可以包括：只讀存儲器、隨機存儲器、磁盤或光盤等。

以上內容是結合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換。