本發(fā)明涉及檢測核酸合成和/或擴增的方法。

背景技術：
最知名的核酸擴增技術是基于名為聚合酶鏈式反應的酶促反應，通常簡稱為PCR。PCR再現(xiàn)了體外的細胞周期的合成階段，在此期間，遺傳物質(zhì)被復制，以便平均分配到各子細胞中。更具體地，傳統(tǒng)的PCR技術包括在不同的擴增循環(huán)前的核酸變性(在95至99℃下進行)步驟。此步驟是必須的，因為聚合酶，即酶使用單鏈核酸作為合成互補序列的模板是核酸擴增的原因。更具體地，所述聚合酶通過向那些存在于從核酸的小片段作為引物的模板鏈上順序地插入互補核苷酸來合成核酸的新鏈。在每一周期，所述核酸在高溫下變性(變性步驟)。隨后，溫度降至一定值以使引物結合到模板核酸的互補部分(退火步驟)。最后，發(fā)生聚合步驟，即：聚合酶開始從上述的引物合成核酸的新鏈。該變性-退火-聚合周期幾次重復以擴展即使是很少量的模板核酸。所選擇的聚合酶是耐熱的，因為其需要在高溫下經(jīng)歷很長一段時間。需要對核酸進行變性以擴增相同的使用要求，對于PCR的執(zhí)行，熱循環(huán)儀可使得工藝的不同步驟可在不同的溫度下操作以及從某一溫度快速過渡至另一溫度。此限制導致PCR幾乎不可用于簡易檢測，即，對于那些在現(xiàn)場需要以簡單和快速的方式進行以便及時采用最恰當決定的測試。環(huán)介導等溫擴增技術，簡稱LAMP，是一項很好的技術，可不需要熱循環(huán)儀來進行核酸擴增。LAMP允許核酸等溫擴增。換言之，在整個LAMP反應過程中，溫度不斷保持在60至65℃間。該恒溫條件容許整個LAMP擴增可在恒溫水浴、恒溫箱或熱塊中進行。在這種方式下，核酸擴增技術是可行的，其完全避免了進行PCR所需的復雜的熱循環(huán)儀。在這方面，LAMP顯示其為可在現(xiàn)場并以完全獨立于實驗室的方式進行核酸擴增方法的可選方法。即：LAMP似乎是特別適合的分析方法，被稱之為“即時檢測”。事實上，此類分析，可在現(xiàn)場不需要要求全能以及易于實現(xiàn)技術的熟練工作人員即可以一種簡易的方式進行。一方面，核酸擴增技術像PCR和LAMP，關于檢測可能的擴增核酸的步驟，目前仍然存在問題并因此限制了特別是即時檢測的進行。通常，以PCR方式或LAMP方式進行擴增的核酸可在嵌入劑的存在下通過進行凝膠而得以顯現(xiàn)。嵌入劑是當其被UV輻射激發(fā)時能發(fā)射熒光的分子。嵌入劑，例如溴化乙錠，通過進入擴增核酸的雙螺旋，可通過使用UV輻射顯現(xiàn)。在可選實施方式中，核酸擴增可通過在熒光前驅(qū)體的存在下進行擴增反應并通過使用合適的裝置測量測試樣品發(fā)射的熒光來進行實時監(jiān)控(實時分析)。最后，在近期，比濁法已成為廣泛應用的檢測核酸擴增(尤其是對于LAMP擴增核酸)的方法。隨著核酸擴增反應的進行，濁度計測量反應混合物中發(fā)生的濁度增加。核酸擴增時發(fā)生的反應混合物濁度的增加與磷酸根離子(來自于核苷酸)的釋放有關，而這，在鎂的存在下，沉淀為焦磷酸鎂并使溶液變得混濁。然而，通過嵌入劑方式的擴增核酸的可見性以及通過熒光分子的實時可視性或通過濁度計方式的可視性均是由能操作儀器并知道如何處理危害公眾及環(huán)境衛(wèi)生的材料，如嵌入劑的熟練工作人員將核酸擴增反應與臨時需要的裝置結構(實驗室或設備)相結合來進行的。此外，關于使用嵌入劑的另一特別受限的方面是，此類試劑是在擴增反應結束時或在瓊脂糖凝膠中加入到混合物中，如果后者是作為檢測方法使用。這需要打開發(fā)生反應的試管并因此提高了擴增核酸(不管其是包含在測試樣品中或是包含在陽性對照樣品中)污染環(huán)境的高風險性。盡管已進行了適當?shù)膬艋绦?，核酸帶來的環(huán)境污染仍可持續(xù)很長時間。更進一步地，該污染在不規(guī)則時間間隔下經(jīng)常增加發(fā)生的假陽性，甚至是在該問題顯然已經(jīng)解決的情況下也會發(fā)生。在這種情況下，為了確保消除污染，唯一的解決方法是再次設計測試并再次制定其以前的組成(例如，用于擴增的引物)。很顯然，這種情況，即環(huán)境污染，是絕對要避免的，尤其是在診斷試劑盒的建立過程中，因為試劑盒的驗證步驟是極其昂貴的過程。近年來，為了檢測LAMP-擴增DNA，Goto等人發(fā)現(xiàn)：通過向反應混合物中添加羥基萘酚藍(HNB)，是有可能隨著核酸擴增進行比色分析的(Goto等，生物技術(2009)Vol.46:167-172)。羥基萘酚藍(HNB)是金屬離子指示劑。如上所述，在LAMP擴增反應過程中，由于鎂與焦磷酸鹽形成復合物并沉淀，鎂濃度降低。隨著核酸擴增，鎂濃度的降低導致添加了HNB的反應混合物的顏色發(fā)生變化。具體地，混合物的顏色從深藍色調(diào)轉變成淺藍色調(diào)。然而，在標準的LAMP反應條件下，難以觀察到該色調(diào)的變化，尤其是當擴增為最小量時(即，樣品是弱陽性)以及當評估觀察者不熟練時。因此，核酸的擴增檢測仍然是一有待解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：
在此背景下，本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種靈敏的核酸合成和/或擴增的檢測方法，從而相對于現(xiàn)有技術體系，提高了結果的靈敏性進而可提高結果的可靠性。申請人已經(jīng)找到了檢測核酸的合成和/或擴增的比色法中所存在的技術問題的對策，其中，至少一種比色金屬指示劑以及至少一種鎂螯合劑(優(yōu)選一種溫和的鎂螯合劑)被加入到核酸擴增的反應混合物中。隨后，以此得到的反應混合物與被分析的樣品進行接觸以使得樣品中可能存在的核酸發(fā)生合成和/或擴增。最后，在擴增反應可能結束時，檢測反應混合物的起始顏色是否發(fā)生了變化。在擴增步驟的終點，反應混合物的顏色從落在紫羅蘭色(例如藍紫色、淡紫色或紫紅色)的顏色范圍到落在藍色(例如天藍色)的顏色范圍內(nèi)的明顯變化表明了所測試樣品中靶核酸的存在。申請人驚奇地注意到，相對于采用現(xiàn)有技術方法得到的檢測，采用本發(fā)明的方法顯著提高了擴增核酸的色度檢測。特別地，申請人實現(xiàn)了：采用本發(fā)明的方法，核酸擴增的檢測更為靈敏，即：其可檢測更低濃度的靶核酸，是穩(wěn)定的，即：其不會受到方法參數(shù)小變化的影響，因此，其比現(xiàn)有文獻中為實現(xiàn)這一目的的方法更為可靠。相對于現(xiàn)有技術方法，本發(fā)明方法的靈敏度更高是由于這樣的一個事實：即可通過肉眼觀察到作為陰性樣品和弱陽性樣品間差異的明確顏色變化，而當采用現(xiàn)有技術方法時，僅可獲得相同顏色(從深藍到淺藍)的細小色調(diào)變化。事實上，當核酸以本發(fā)明的方法擴增時，如果核酸發(fā)生了擴增，擴增反應混合物的顏色從落在紫羅蘭色(例如藍紫色、淡紫色或紫紅色)的顏色范圍變化到落在藍色(例如天藍色)的顏色范圍內(nèi)。顏色差異是如此明顯，從而即使是非技術觀察者也可容易觀察出。只有向擴增反應混合物中加入至少一種比色金屬指示劑以及至少一種溫和的鎂螯合劑的組合，才可能提高擴增核酸可視性。從經(jīng)濟角度，也已經(jīng)證實本發(fā)明的方法比現(xiàn)有技術方法具有更多優(yōu)勢。事實上，其可在比標準(眾所周知，核苷酸是一種非常昂貴的起始材料，但是其是開展此類方法所必不可少的)更低的核苷酸濃度下進行。這使得在有使用本方法時，其成本的降低是不可忽視的，尤其是在大規(guī)模篩選時。最后，申請人已經(jīng)證實了，向可能的核酸擴增反應混合物中加入至少一種溫和的鎂螯合劑，在某些情況下，可促進擴增反應。附圖說明在下文中，本發(fā)明將結合附圖進行詳細描述，其中：圖1A顯示了在檸檬酸鈉存在下，通過現(xiàn)有檢測技術獲得的陽性生物樣品(含有擴增核酸)以及陰性生物樣品(不含核酸)間的顏色差異；圖1B顯示了通過本發(fā)明的方法獲得的陽性生物樣品(含有擴增核酸)以及陰性生物樣品(不含核酸)間的顏色差異；圖2A以灰色突出顯示了通過實時熱循環(huán)儀在SYBRGREEN(其為信號讀取通道)存在下進行LAMP反應的靶DNA擴增的典型曲線的增長行為；圖2B以黑色突出顯示了通過實時熱循環(huán)儀在羥基萘酚藍(其使用的信號讀取通道與SYBRGREEN通道相對應)存在下進行LAMP反應的靶DNA擴增的典型曲線的減少行為；圖3A-3C顯示了檸檬酸鈉對在SYBRSAFE存在下進行的LAMP反應并通過實時熱循環(huán)儀在SYBRGREEN通道讀取的靶DNA擴增曲線行為的影響。其中，檸檬酸鈉濃度為：0.5mM(圖3A)，1mM(圖3B)和1.5mM(圖3C)。具體實施方式本發(fā)明涉及核酸合成和/或擴增的比色檢測方法，其中，所述方法包括向核酸擴增的反應混合物中添加至少一種比色金屬指示劑以及至少一種溫和的鎂螯合劑。更具體地，根據(jù)本發(fā)明，所述的檢測核酸的合成和/或擴增的方法，包括以下步驟：(i)提供至少一組設計的用于以特定的方式與靶核酸的至少一個區(qū)域合成和/或擴增的引物；(ii)將步驟(i)中的一組引物與靶核酸用于擴增的反應混合物相結合，所述混合物包括至少一種比色金屬指示劑以及至少一種溫和的鎂螯合劑；(iii)將從步驟(ii)中獲得的反應混合物與生物樣品相接觸，以擴增樣品中可能存在的靶核酸的至少一個區(qū)域；以及(iv)檢測反應混合物可能的顏色改變。所述添加至少一種比色金屬指示劑和至少一種溫和的鎂螯合劑的組合，使得反應混合物的色度對最小量的擴增核酸也是敏感的。事實上，通過采用本發(fā)明所述的方法，少量的擴增核酸同樣也能引起反應混合物的顏色產(chǎn)生一定的變化。根據(jù)本發(fā)明的方法，混合物的顏色從落在紫羅蘭色(例如藍紫色、淡紫色或紫紅色)的顏色范圍到落在藍色(例如天藍色)的顏色范圍內(nèi)變化。相反，采用現(xiàn)有技術中的方法，核酸的擴增使得反應混合物的顏色從深藍色變成天藍色。本發(fā)明的方法可顯著提高陽性樣品(即，核酸被擴增的樣品)和陰性樣品(即：沒有發(fā)生核酸擴增的樣品)之間的色差。事實上，即使樣品僅是弱陽性的(少量的擴增核酸)，也可通過本發(fā)明的方法檢測到。要獲得這樣的結果，至少一種溫和的鎂螯合劑和至少一種比色金屬指示劑的組合是必不可少的。本發(fā)明所述方法的第一個方面涉及比色金屬指示劑，所述比色金屬指示劑優(yōu)選自：羥基萘酚藍、羊毛鉻黑T、8-羥喹啉+丁酰胺、鈦黃、二甲苯胺藍、鈣鎂試劑、二甲苯胺藍、百里酚藍、鉻菁R、茜素紅S、鄰甲酚酞、1,2,3-三羥基蒽醌、醌茜隱色體、醌茜素、對硝基苯-偶氮-對硝基苯-間苯二酚、丁酰胺、鉻變素2B、氨+酚酞、堿性次碘酸鹽、五次甲基巴比妥酸和二苯卡巴肼。所述指示劑的濃度變化范圍優(yōu)選0.05至0.2mM，更優(yōu)選0.1至0.15mM。為了本發(fā)明的目的，所述比色金屬指示劑特別優(yōu)選羥基萘酚藍。本發(fā)明所述方法的第二個方面涉及溫和的鎂螯合劑，所述溫和的鎂螯合劑優(yōu)選自：檸檬酸鈉、乙酸、ADP、天冬氨酸、ATP、正丁酸、檸檬酸、半胱氨酸、3,4-二羥基苯甲酸、O,O-二甲基紅棓酚、EDTA、EGTA、葡萄糖酸、谷氨酸、戊二酸、甘油酸、甘氨酸、羥基乙酸、雙甘氨肽、鳥苷、鄰羥基苯甲酸、次黃苷三磷酸、乳酸、蘋果酸、NTA、草酸、多磷酸鹽、丙酸、嘌呤、水楊醛、水楊酸、琥珀酸、酒石酸、四偏磷酸鹽、三偏磷酸鹽、三磷酸鹽、尿苷二磷酸。優(yōu)選地，所述溫和的鎂螯合劑的濃度變化范圍為0.5至2mM，更優(yōu)選0.8至1.2mM。為了本發(fā)明的目的，所述溫和的鎂螯合劑特別優(yōu)選檸檬酸鈉。在一優(yōu)選實施方式中，羥基萘酚藍與檸檬酸鈉結合使用。采用本發(fā)明的方法合成和/或擴增的核酸是DNA和/或RNA。假如進行擴增的核酸是RNA分子，后者優(yōu)選先通過例如是逆轉錄酶的酶進行逆轉錄。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述核酸或者cDNA先經(jīng)歷了逆轉錄，然后進行擴增。在本發(fā)明的上下文中，術語“核酸合成和/或擴增的方法”用來表示目的核酸的某一確定片段的增值所使用的方法。為了本發(fā)明的目的，所述核酸合成和/或增值的方法優(yōu)選LAMP、PCR或其變形。特別優(yōu)選環(huán)介導等溫擴增(LAMP)。所述LAMP技術是近年來發(fā)展起來的核酸擴增技術(NotomiT等，2000)。為便于更容易理解本發(fā)明所述方法的一些優(yōu)點，下面簡單描述了LAMP方法的原理。所述LAMP方法是基于使用特別設計用于特定的核酸序列，例如某一DNA分子，的一組四個引物(或寡核苷酸)。此外，LAMP使用能在等溫條件下通過“鏈置換”的方式進行靶核酸合成和擴增的耐熱聚合酶。所述的一組引物包括一對外引物F3和B3以及一對內(nèi)引物FIP和BIP。這些引物是特定的，因此它們能檢測和綁定靶DNA序列的六個不同側翼區(qū)來進行擴增。從靶DNA的5'-末端開始，所述側翼區(qū)為F3、F2、F1、B1c、B2c和B3c(“c”代表互補)。所述引物如此設計以在反應的初始步驟中促進發(fā)夾環(huán)結構的形成，因此，隨著反應的進行，從此類結構合成了大量的自引發(fā)DNA。具體地，外引物F3和B3是普通的單域引物，并能擴增整個靶DNA序列。所述內(nèi)引物(FIP和BIP)是混合(雙域)引物，且分別由區(qū)F1c和F2(FIP)和區(qū)B1c和B2(BIP)組成。內(nèi)引物對的每個引物能識別靶DNA六個區(qū)中的兩個，且該內(nèi)引物對在LAMP反應中執(zhí)行主任務(事實上，它們使用了比外引物對更高(過量)的濃度)。LAMP反應，其本質(zhì)包括兩個步驟：第一步形成實際擴增步驟，即第二步的啟動結構。在第一步中，內(nèi)引物先反應。具體地，F(xiàn)IP中的F1c區(qū)綁定至靶DNA的互補區(qū)(F2c)上，并通過聚合酶開始新合成DNA鏈的擴增。此時，外引物F3綁定至靶DNA的互補區(qū)(F3c)上，并從FIP開始替換新合成DNA鏈，釋放新合成DNA鏈。由于F1c區(qū)(來源于FIP)與新合成鏈的F1區(qū)雜交，從而在此類DNA鏈的3'-末端形成一環(huán)狀結構。引物BIP和B3在另一末端以類似的方式反應。在此步驟結束時，獲得了靶DNA，其具有在末端自雜交從而形成環(huán)的結構(定義為“自身結構”)特性。此類DNA將開始實際擴增步驟。該自身結構是新的靶DNA，在LAMP的擴增步驟中，從引物FIP和BIP開始擴增。擴增步驟從自身結構的游離3'末端開始擴增，并從綁定到環(huán)區(qū)F2c的FIP開始擴增。以這種方式，和與其互補的結構一起，再次形成如第一步中所形成的相同的自身結構。所述擴增反應總是從FIP和BIP持續(xù)開始，直到形成高擴增結構。另一對引物，定義為環(huán)前(LF)和環(huán)后(LB)引物，可加入到LAMP反應混合物中。此類引物的目的在于顯著加速反應，可減少甚至50％的反應時間。在利用LAMP方法進行核酸合成和/或擴增的實施例中，本發(fā)明的方法包括以下步驟：(i)提供至少一組設計的用于以LAMP方式對靶核酸序列的至少一個區(qū)進行擴增的引物；(ii)將所述引物組與反應混合物相結合以通過LAMP的方式對靶核酸進行擴增，所述反應混合物包括至少一種比色金屬指示劑以及至少一種(溫和的)鎂螯合劑；(iii)將生物樣品與從步驟(ii)中獲得的反應混合物相接觸，以擴增所述樣品中可能存在的靶核酸序列的至少一個區(qū)；以及(iv)檢測該反應混合物可能的顏色改變。在剛才所描述的步驟(i)至(iv)前可選擇性地進行核酸的變性步驟。優(yōu)選地，所述變性步驟在溫度為90-100℃，時間為1至10分鐘，優(yōu)選4至8分鐘下進行。同樣根據(jù)本實施例，添加至少一種比色金屬指示劑和至少一種溫和的鎂螯合劑的組合使得反應混合物的色度對擴增核酸的最小量也是敏感的，其中擴增核酸能引起反應混合物顏色的明確變化。以LAMP的方式進行的合成和/或擴增反應優(yōu)選在溫度為50至80℃，更優(yōu)選在55至70℃下進行。所述擴增反應可在恒溫浴和/或爐和/或熱塊中進行。進行所述擴增反應的時間優(yōu)選30至90分鐘，更優(yōu)選40至75分鐘。本發(fā)明所述方法的另一方面涉及核酸擴增的反應混合物。所述混合物優(yōu)選包括：至少一種聚合酶、含有鎂鹽的緩沖溶液、核苷酸三磷酸鹽混合物、和/或至少一種解鏈溫度調(diào)節(jié)劑。在本發(fā)明的上下文中，術語“解鏈溫度”指的是核酸的一半是雙螺旋(或雙鏈)狀態(tài)以及一半是變性(單鏈)狀態(tài)時的溫度。一般而言，本發(fā)明所述方法中所使用的聚合酶優(yōu)選在等溫條件下通過鏈置換活性的方式能擴增靶核酸(優(yōu)選，DNA)。在本發(fā)明的上下文中，術語“鏈置換活性”指的是聚合酶替換核酸鏈的能力，例如，在合成反應中發(fā)現(xiàn)DNA分子向下，而離開它整體(即，該術語表示的是不能水解的核酸鏈)。具體地，所述聚合酶是DNA聚合酶，優(yōu)選耐熱NDA聚合酶。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，特別優(yōu)選嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus)的耐熱DNA聚合酶的大部分片段。關于緩沖溶液，其優(yōu)選包括鎂鹽、KCl、Tris-HCl、NH4SO4、TritonX-100和/或吐溫20。優(yōu)選地，所述鎂鹽為MgSO4。所述鎂鹽所使用的濃度優(yōu)選1至8mM，更優(yōu)選1.5至7mM。在本發(fā)明的具體實施例中，還可在反應混合物種引入鎂，例如，以鎂離子(Mg2+)的形式，優(yōu)選以添加MgCl2的方式。在此方面，申請人已注意到鎂的使用，以氯化鹽的形式，增強了發(fā)生擴增反應前的起始反應混合物的紫色。關于脫氧核苷酸三磷酸鹽混合物，其包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP的混合物，濃度范圍優(yōu)選1000μM至3000μM。關于解鏈溫度調(diào)節(jié)劑，其選自：甜菜堿、三甲胺N-氧化物、脯氨酸、二甲基亞砜以及甲酰胺。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述解鏈溫度調(diào)節(jié)劑優(yōu)選甜菜堿，其濃度優(yōu)選0.6M至1.6M。關于引物組，其包括至少一對能識別并綁定靶核酸序列的引物。所述引物對優(yōu)選包括與靶核酸的5'區(qū)序列互補的正向引物以及與靶核酸的3'區(qū)序列互補的反向引物。在使用LAMP進行核酸的合成和/或擴增的實施例中，步驟(i)中的引物組包括至少一對內(nèi)引物以及至少一對外引物?？蛇x地，還可使用提供的另一對引物，定義為環(huán)狀引物。每對內(nèi)引物包括至少一正向內(nèi)引物(FIP)和至少一反向內(nèi)引物(BIP)；每對外引物包括至少一與F3c互補的正向外引物(F3)以及至少一反向外引物(B3)；每對環(huán)狀引物包括至少一內(nèi)環(huán)狀引物(LF)和至少一外環(huán)狀引物(LB)。組中的每一引物如此設計以便于在LAMP反應的第一步中優(yōu)選形成定義為“發(fā)卡環(huán)”的結構。每一內(nèi)引物均是任意選擇的核酸序列。為設計所述序列，其優(yōu)先考慮的是：-所述序列的長度優(yōu)選35至60個核苷酸，更優(yōu)選40至60個核苷酸；-所述序列的解鏈溫度優(yōu)選55至70℃，更優(yōu)選52至63℃；-GC百分比(即序列中鳥嘌呤+胞嘧啶含量占總核酸含量的百分比)優(yōu)選30至65％，更優(yōu)選35至55％；-所述序列(即，每個內(nèi)引物)使用的濃度優(yōu)選0.2至2mM，更優(yōu)選0.6至1.6mM。每一外引物均是任意選擇的核酸序列。為設計所述序列，其優(yōu)先考慮的是：-F1c或B1c的長度優(yōu)選20是30個核苷酸，更優(yōu)選17至22個核苷酸；F2和B2的長度優(yōu)選20至30個核苷酸，更優(yōu)選17至22個核苷酸；-F1c或B1c的解鏈溫度優(yōu)選63至68℃，更優(yōu)選52至63攝氏度；F2或B2的解鏈溫度優(yōu)選56至65℃，更優(yōu)選58至63℃；-GC百分比(即序列中鳥嘌呤+胞嘧啶含量占總核酸含量的百分比)優(yōu)選30至65％，更優(yōu)選35至55％；以及-每個外引物使用的濃度優(yōu)選0.1至2mM，更優(yōu)選0.1至1mM。每個環(huán)狀引物均是任意選自與F2和F1c以及B2和B1c序列互補的序列中的任意核酸序列。為設計所述序列，其優(yōu)先考慮的是：-所述序列優(yōu)選12至36個核苷酸，更優(yōu)選17至22個核苷酸；-所述序列的解鏈溫度優(yōu)選55至70℃，更優(yōu)選52至63℃；-GC百分比(即序列中鳥嘌呤+胞嘧啶含量占總核酸含量的百分比)優(yōu)選30至65％，更優(yōu)選35至55％；以及-所述序列(即：每個環(huán)狀引物)所使用的濃度優(yōu)選0.2至2mM，更優(yōu)選0.3至1mM。本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明所述方法在健康領域，特別是在人類健康方面的使用。此外，本發(fā)明的方法還可應用于農(nóng)業(yè)以及食品領域和/或獸醫(yī)領域。本發(fā)明的目的特別適用于使用上述的方法來檢測樣品中病原體的存在。在此實施例中，合成和/或擴增的是屬于(特定)病原體的核酸(DNA和/或RNA)。具體地，至少一種病原體選自：支原體屬(Mycoplasma)、李斯特菌屬(Listeria)、細螺旋體屬(Leptospira)、假單胞菌屬(Pseudomonas)或細小病毒屬(Parvovirus)。屬于支原體屬的病原體優(yōu)選親血的支原體。更優(yōu)選地，所述親血的支原體選自：血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmahaemominutum)、貓血巴爾通體(CandidatusMycoplasmaturicensis)、貓血支原體(Mycoplasmahaemofelis)、犬嗜血支原體(Mycoplasmahaemocanis)和Mycoplasmahaematoparvum。屬于李斯特菌屬(Listeria)的病原體優(yōu)選單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)。屬于細螺旋體屬(Leptospira)的病原體優(yōu)選鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans)。屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)的病原體優(yōu)選熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)。病毒性病原體優(yōu)選選自：犬細小病毒(CPV)以及貓細小病毒(FPV)。如上所述，在本實施例的上下文中，術語“檢測至少一種病原體的存在”指的是合成和/或擴增目的病原體特定核酸的至少一個片段。換言之，本發(fā)明的方法包括這種情況：通過使用特定的引物合成和/或擴增目的病原體的基因組區(qū)域。所述的合成和/或擴增可通過LAMP、PCR或它們的變形來進行。優(yōu)選地，所述合成和/或擴增LAMP的方式進行。另外，在本實施例中，如上所述，通過LAMP的方式進行合成和/或擴增反應，溫度優(yōu)選50至80℃，更優(yōu)選55至70℃。所述擴增反應可在恒溫浴和/或箱和/或熱塊中進行。進行所述擴增反應的持續(xù)時間優(yōu)選30至90分鐘，更優(yōu)選40至75分鐘。在以LAMP的方式合成和/或擴增所關注病原體的至少一個核酸片段的情況下，通過考慮上述以LAMP的方式進行核酸合成和/或擴增來設計步驟(i)的每個引物。具體地，在本實施例的上下文中：-所述至少一種正向內(nèi)引物優(yōu)選選自SEQIDNO：3、9、15、21、27、33和39；-所述至少一種反向內(nèi)引物優(yōu)選選自SEQIDNO：4、10、16、22、28、34和40；-所述至少一種正向外引物優(yōu)選選自SEQIDNO：1、7、13、19、25、31和37；-所述至少一種反向外引物優(yōu)選選自SEQIDNO：2、8、14、20、26、32和38。優(yōu)選地，所述內(nèi)引物對包括SEQIDNO：3和4或SEQIDNO：9和10或SEQIDNO:15和16，并且是特定于檢測貓和狗中親血型支原體。優(yōu)選地，所述內(nèi)引物對包括用于檢測血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmahaemominutum)的SEQIDNO:3和4；用于檢測貓血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmaturicensi)的SEQIDNO:9和10；用于檢測貓血支原體(Mycoplasmahaemofelis)的SEQIDNO:15和16。優(yōu)選地，所述內(nèi)引物對包括SEQIDNO:21和22，并且是特定用于檢測李斯特菌屬(Listeria)，優(yōu)選用于檢測單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)樣品。優(yōu)選地，所述內(nèi)引物對包括SEQIDNO:39和40，并且是特定用于檢測細螺旋體屬(Leptospira)，優(yōu)選用于檢測鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans)樣品。優(yōu)選地，所述內(nèi)引物對包括SEQIDNO:33和34，并且是特定用于檢測假單胞菌屬(Pseudomonas)，優(yōu)選用于檢測熒光假單胞菌屬(Pseudomonasfluorescens)樣品。優(yōu)選地，所述內(nèi)引物對包括SEQIDNO:27和28，并且是特定用于檢測細小病毒屬(Parvovirus)，優(yōu)選用于檢測犬細小病毒(CPV)和/或用于檢測貓泛白細胞減少癥病毒(FPV)。優(yōu)選地，所述外引物對包括SEQIDNO:1和2或SEQIDNO:7和8或SEQIDNO:13和14，并且特定用于檢測支原體屬。優(yōu)選地，所述外引物對包括用于檢測血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmahaemominutum)的SEQIDNO:1和2；用于檢測貓血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmaturicensis)的SEQIDNO:7和8；用于檢測貓血支原體(Mycoplasmahaemofelis)的SEQIDNO:13和14。優(yōu)選地，所述外引物對包括SEQIDNO:19和20，并且特定用于檢測李斯特菌屬(Listeria)，優(yōu)選用于檢測單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)樣品。優(yōu)選地，所述外引物對包括SEQIDNO:37和38，并且是特定用于檢測細螺旋體屬(Leptospira)，優(yōu)選用于檢測鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans)樣品。優(yōu)選地，所述外引物對包括SEQIDNO:31和32，并且是特定用于檢測假單胞菌屬(Pseudomonas)，優(yōu)選用于檢測熒光假單胞菌屬(Pseudomonasfluorescens)樣品。優(yōu)選地，所述外引物對包括SEQIDNO:25和26，并且是特定用于檢測細小病毒屬，優(yōu)選用于檢測犬細小病毒(CPV)和/或用于檢測貓泛白細胞減少癥病毒(FPV)。在具體實施例中，本發(fā)明所涉及的引物組還包括一對環(huán)狀引物。優(yōu)選地，所述環(huán)狀引物對包括：SEQIDNO:5和6、SEQIDNO:11和12、SEQIDNO:17和18、SEQIDNO:23和24、SEQIDNO:29和30、SEQIDNO:35和36、或SEQIDNO:41和42。在優(yōu)選實施例中，所述環(huán)狀引物對包括：SEQIDNO:5和6、SEQIDNO:11和12、或SEQIDNO:17和18，且特定用于檢測支原體屬。優(yōu)選地，所述環(huán)狀引物對包括：用于檢測血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmahaemominutum)的SEQIDNO:5和6；用于檢測貓血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmaturicensi)的SEQIDNO:11和12；用于檢測貓血支原體(Mycoplasmahaemofelis)的SEQIDNO:17和18。在優(yōu)選實施例中，所述環(huán)狀引物對包括SEQIDNO:23和24，并且特定用于檢測檢測李斯特菌屬(Listeria)，優(yōu)選用于檢測單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)樣品。在優(yōu)選實施例中，所述外引物對包括SEQIDNO:41和42，并且特定用于檢測檢測細螺旋體屬(Leptospira)，優(yōu)選用于檢測鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans)樣品。在優(yōu)選實施例中，所述外引物對包括SEQIDNO:35和36，并且特定用于檢測檢測假單胞菌屬(Pseudomonas)，優(yōu)選用于檢測熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)樣品。優(yōu)選地，所述外引物對包括SEQIDNO:29和30，并且特定用于檢測細小病毒屬，優(yōu)選用于檢測犬細小病毒(CPV)和/或用于檢測貓泛白細胞減少癥病毒(FPV)。表I列出了本發(fā)明優(yōu)選實施例中所涉及的序列。表I與上述所列序列具有80-85％同源性的核苷酸序列均可考慮用于本發(fā)明所述的方法中。本發(fā)明所述方法中所采用的樣品可以是任何來源的核酸(DNA和/或RNA)。在優(yōu)選實施例中，所述樣品為任何來源的至少一種病原體或至少一種病原體的基因組，例如食物、水或土壤。所述樣品優(yōu)選生物樣品，例如血液及其衍生物(血漿、血清等)、尿液或任何生物液、組織片段、毛發(fā)、糞便或細胞。所述樣品可如此使用，或其經(jīng)過溶解。溶解的樣品中含有目的核酸。為了將核酸分子從樣品的其它組分中分離出來，還可對該溶解產(chǎn)物進行進一步純化。如上所述，將上述核酸擴增的反應混合物與樣品進行接觸的步驟是啟動可能存在于樣品中的靶核酸序列的合成和/或擴增反應必不可少的。在可能存在于樣品中的靶核酸序列的擴增反應結束時，只有在已經(jīng)發(fā)生所述序列的合成和/或擴增時，才能明顯觀察到該反應混合物的顏色變化。在實施本發(fā)明所述方法時，反應混合物的顏色變化比現(xiàn)有技術中的方法更為明確以及明顯，事實上，反應混合物的顏色從落在紫羅蘭色(例如藍紫色、淡紫色或紫紅色)的顏色范圍變成落在藍色(例如天藍色)的顏色范圍，然而，采用現(xiàn)有技術的方法，混合物的顏色從深藍色(擴增前)變成天藍色(擴增后)或者從紫紅色-藍紫色變成紫羅蘭色。如上所述，按照本發(fā)明的方法向反應混合物中添加至少一種比色金屬指示劑以及至少一種溫和的鎂螯合劑來進行核酸擴增，可觀察到反應混合物明顯的顏色變化?；旌鲜褂弥辽僖环N比色金屬指示劑以及至少一種溫和的鎂螯合劑還具有以下優(yōu)點：其所使用的核苷酸三磷酸鹽濃度低于現(xiàn)有技術方法中通常所使用的濃度。例如，核苷酸的濃度范圍為500至3000μM，優(yōu)選1500至2000μM。因此，本發(fā)明的方法可隨著反應混合物的顏色變化，通過肉眼(目視)觀察和/或監(jiān)控核酸的擴增。由于即使是最小量的序列被擴增時，反應混合物的顏色變化也是明確及明顯的，因此，幾乎沒操作過或非技術觀察者也可在反應結束后確定目的核酸序列是否發(fā)生了擴增。如前所述，本發(fā)明中所使用的核苷酸的濃度低于現(xiàn)有技術方法中通常所使用的濃度，從而顯著減小了實施本方法的成本，因為核苷酸三磷酸鹽十分昂貴。因此，從經(jīng)濟角度來看，本發(fā)明的方法也是十分具有優(yōu)勢的。通常，為監(jiān)控反應質(zhì)量，也就是，例如，為了核實反應是否正確地發(fā)生，或者反應物是否起作用，或者反應物是否發(fā)生污染，采用了一個或多個陽性對照和/或一個活多個陰性對照。因此，在本發(fā)明方法的上下文中，樣品可以是陽性對照或陰性對照。所述陽性對照是，例如，目的核酸(靶核酸)序列的至少一個區(qū)域。此區(qū)域本身可以是靶核酸的區(qū)域的序列(單獨)，例如，該區(qū)域的雙鏈DNA序列。在另一實施方式中，此序列可插入到任何克隆載體中。所述克隆載體含有本發(fā)明所述方法中可作為陽性對照的靶核酸的至少一個區(qū)域的序列。在特定實施方式中，該區(qū)域可被認為，不論是以其本身的核苷酸序列形式還是以插入到克隆載體上的區(qū)域的核苷酸序列形式，都可以是病原體基因組的一個區(qū)域，特別是本發(fā)明所述方法的作為靶的病原體的核酸序列的一個區(qū)域。采用本發(fā)明的方法，陽性對照樣品將在擴增反應(無論是PCR還是LAMP)結束時顯示出天藍色。因此，樣品將從落在紫羅蘭色(擴增前)范圍內(nèi)的顏色變化至落在藍色范圍內(nèi)的顏色，例如，天藍色(擴增后)，這反映了本發(fā)明的積極結果，即反應物的質(zhì)量和實驗條件。陰性對照可以是存在進行該方法所需要的所有反應物，但不存在將被擴增的核酸。因此，樣品在擴增前后具有相同的顏色，即，假使方法已正常發(fā)生(例如，沒有污染)，其也僅具有紫羅蘭色。換言之，通過使用至少一組陽性對照和至少一組陰性對照，可以監(jiān)控該方法的可靠性。為了以快速及簡單的方式證實和/或確認通過本發(fā)明所述方法得到的結果，本領域任何技術人員可使用通常的核酸可視化技術來進行：例如，由于插入劑或由UV-射線或適當波長的光激發(fā)的熒光物質(zhì)的結合而導致的濁度、凝膠和紫外線的增加，熒光增加。本發(fā)明的另一方面涉及實施本發(fā)明所述方法的試劑盒。所述試劑盒優(yōu)選包括以下試劑：-如本發(fā)明所述的至少一組引物；-至少一種含有鎂鹽的緩沖液；-至少一種核苷酸三磷酸鹽混合物；-至少一種聚合酶；-至少一種解鏈溫度調(diào)節(jié)劑；-至少一種比色金屬指示劑；-至少一種溫和的鎂螯合劑；-至少一組陽性對照；-至少一組陰性對照。如上所列出的試劑盒組分，和本發(fā)明所述方法中所描述的一致。此外，本發(fā)明所述的試劑盒還可包括不同的反應離心管，優(yōu)選塑料材質(zhì)的埃普多夫型離心管。更優(yōu)選的是，所述離心管的容量為0.2至0.5ml。所述反應離心管中含有反應物，所述反應物優(yōu)選冷凍干燥以使得它們可以在環(huán)境溫度下保存。具體地，根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒是用于檢測生物樣品中親血支原體的存在，所述親血支原體優(yōu)選選自：血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmahaemominutum)、貓血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmaturicensis)、貓血支原體(Mycoplasmahaemofelis)、犬嗜血支原體(Mycoplasmahaemofelis)和Mycoplasmahaemofelis。本發(fā)明的試劑盒還可用于檢測生物樣品中屬于李斯特菌屬(Listeria)、優(yōu)選單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的病原體。本發(fā)明的試劑盒還可用于檢測生物樣品中屬于細螺旋體屬(Leptospira)，優(yōu)選鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans)的病原體。本發(fā)明的試劑盒還可用于檢測生物樣品中屬于假單細胞菌屬(Pseudomonas)，優(yōu)選熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的病原體。本發(fā)明的試劑盒還可用于檢測生物樣品中病毒性病原體，優(yōu)選選自犬細小病毒(CPV)以及貓細小病毒(FPV)。在上述優(yōu)選實施例下，本發(fā)明的試劑盒包括本發(fā)明的方法說明書中所公開的引物組。實施例1為了遵循本領域已知方法的擴增反應，在LAMP方法中使用了羥基萘酚藍(GotoM等，生物技術，2009；MaXJ等，病毒學，2010，CardosoTC等，分子細胞探針，2010)。申請人在實施現(xiàn)有技術的方法時，在LAMP擴增前，得到了藍色的反應混合物，隨著目的核酸擴增反應的進行，反應混合物的并不是總能觀察到變色。這是因為，采用現(xiàn)有技術的方法，在核酸擴增前的擴增反應液為深藍色，在目的核酸可能擴增結束時為淺藍色，很難與起始混合物的顏色明確區(qū)分開來。圖1A顯示了當采用Goto等人的方法時的陽性樣品和陰性樣品。我們提示，陽性樣品提供的關于樣品何處的核酸被擴增的信息，因此其提供了當核酸擴增發(fā)生時，在擴增結束后的反應混合物顏色的信息。陰性樣品提供了關于樣品何處的核酸未被擴增的信息，因此其提供了反應混合物起始、即擴增前的顏色信息。為了增強核酸擴增前后的色度差，即使是非技術人員也能簡便及快速地監(jiān)控同樣的擴增，故向混合物中加入了溫和的鎂螯合劑。所述溫和的鎂螯合劑采用的檸檬酸鈉。其采用以下濃度：0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.50、1.75、2、2.5、3、4.5mM。LAMP擴增的反應混合物中檸檬酸鈉和羥基萘酚藍的加入，使得擴增前，混合物的顏色為紫羅蘭色。在核酸可能的擴增結束時，混合物為天藍色，這可與反應混合物的起始顏色(擴增前)中清楚區(qū)分開來。圖1B顯示了采用本發(fā)明所述方法時的陽性樣品以及陰性樣品。結果表明，與文獻中已知的方法相比，本發(fā)明的方法明顯提高了反應起始和結束時的顏色差。為了驗證檸檬酸鈉在提高陰性樣品的紫羅蘭色和陽性樣品的天藍色間對比性方面的實際功能，使用了實時熱循環(huán)儀。使用SYBRGREEN來讀取通道。事實上，申請人已驚奇地發(fā)現(xiàn)，在這些實驗條件下，熱循環(huán)儀能讀取傳統(tǒng)LAMP擴增的結果以及反應混合物中添加有羥基萘酚藍的LAMP的結果。在羥基萘酚藍的存在下，隨著反應混合物中的著色劑從紫羅蘭色變成天藍色，對應于靶DNA擴增的曲線具有降低的表現(xiàn)(見圖2B)，取代了傳統(tǒng)LAMP中的增加表現(xiàn)(見圖2A)。實驗工作被分為兩步，第一步為驗證如上所述的讀取方法，以及第二步為評估向LAMP反應混合物中加入檸檬酸鈉的效果。關于第一步，通過實時熱循環(huán)儀來驗證結果的讀取方法，制備了10個含有羥基萘酚藍(在10個不同的離心管中)的LAMP反應混合物樣品，以及10個含有SYBRSAFE的LAMP反應混合物樣品。相同量的陽性對照(5μl，對應于約90，0000靶)以相同的稀釋液的量添加到樣品中。所述樣品在65℃下溫育1小時。比較了兩個樣品池(即：含有以及不含羥基萘酚藍的反應混合物)的曲線。在相同循環(huán)量的擴增曲線中，所述的兩種樣品顯示出了增加表現(xiàn)(在具有SYBRSAFE的LAMP曲線中)以及減弱表現(xiàn)(在具有萘酚羥基藍的LAMP曲線中)(見圖2A-B)。兩種樣品的曲線的表現(xiàn)也是相同的(兩種曲線均在相同的循環(huán)量處進入平穩(wěn)狀態(tài))。此結果可確定實時熱循環(huán)儀可作為讀取添加有羥基萘酚藍的LAMP反應混合物顏色的“非標準”儀器。所述第二步包括驗證檸檬酸鈉對LAMP反應混合物的顏色變化的影響。具體地，制備了三種LAMP反應混合物，其中，所述三種LAMP反應混合物種添加有羥基萘酚藍以及濃度依次增加的檸檬酸鈉。進行分析的檸檬酸鈉的濃度依次為：0.5mM(圖3-A)、1mM(圖3-B)和1.5mM(圖3-C)。三種混合物中添加了相同量的陽性對照(9,000靶)。樣品于65℃下溫育1小時。三種不同檸檬酸鈉濃度的擴增曲線的行為(圖3A、3B、3C)表明：混合物中檸檬酸鈉的濃度越高，擴增反應開始時測得的信號與擴增結束時的信號間的差距越大。在5mM濃度下反應被抑制。這些結果表明：檸檬酸鈉在陽性樣品中(即：在核酸被擴增的離心管中)，能有效使得反應混合物結束時的顏色趨向天藍色。此外，已經(jīng)證實向含有羥基萘酚藍的LAMP反應混合物中添加檸檬酸鈉能提高陰性樣品(即：由于核酸未發(fā)生擴增，顏色仍為紫羅蘭色的樣品)和陽性樣品(即：由于核酸被擴增，顏色為天藍色的樣品)間的反差。實際上，采用本發(fā)明的方法，陽性和陰性樣品間的色差[紫羅蘭色(陰性)-藍色(陽性)]比Goto等人不添加檸檬酸鈉的方法[深藍色(陰性)-天藍色(陽性)更為明確以及易于檢測。圖1中已經(jīng)顯示了視覺結果，其中，圖1A顯示出了采用現(xiàn)有技術比色方法的樣品，其不包括向LAMP反應混合物中添加羥基萘酚藍和檸檬酸鈉組合物的步驟，而圖1B顯示了采用本發(fā)明方法的樣品。顯然，當采用Goto等人的方法時(圖1A)，陽性樣品和陰性樣品間的色差沒有采用本發(fā)明的方法(圖1B)時明顯。實施例2為了證明檸檬酸鈉沒有抑制LAMP擴增反應，申請人使含有陽性對照(貓血支原體(Mycoplasmahaemofelis)、血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmahaemominutum)、貓血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmaturicensis)、單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogene)、鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、細小病毒(Parvovirus)作為對照，已經(jīng)進行了測試)的樣品進行了使用和不使用檸檬酸鈉的LAMP擴增反應。具體地，制備了含有4mM和6mM鎂以及分別含有和不含1.5mM檸檬酸鈉的4個樣品。具體地，這些樣品是：樣品1：LAMP反應混合物含有4mM鎂；樣品2：LAMP反應混合物含有4mM鎂，1.5mM檸檬酸鈉；樣品3：LAMP反應混合含有6mM鎂；樣品4：LAMP反應混合物含有6mM鎂，1.5mM檸檬酸鈉；LAMP于65℃下持續(xù)了70分鐘，所得到的結果(單位為：分鐘)已列于下表中。每一樣品都按1:10和1:20稀釋進行了測試。從所得到的時間值可知，含有檸檬酸鈉的樣品具有較低的時間值，也就是說，它們加快了反應。因此，可以推測：檸檬酸鈉的加入不會抑制LAMP擴增反應，相反，在某些情況下，這樣的加入有利于反應。實施例3支原體屬(Mycoplasma)污染的檢測為了驗證本發(fā)明的有效性，通過本發(fā)明的方法擴增了從貓全血中提取的DNA樣品以驗證是否被下述病原體污染：貓血支原體(Mycoplasmahaemofelis)、血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmahaemominutum)和貓血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmaturicensis)。通過商業(yè)試劑盒(Macherey-Nagel)從血液樣品中提取了DNA。通過本發(fā)明的方法以及通過采用PCR已經(jīng)證實可以檢測樣品可能的污染。驗證了20個樣品，且所獲得的結果如下所示：采用PCR得到的結果：-血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmahaemominutum)：9個陽性樣品(其中2個陽性樣品也是貓血支原體(Mycoplasmahaemofelis)，2個樣品也是貓血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmaturicensis))；-貓血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmaturicensis)：2個陽性樣品(其中該2個陽性樣品也是血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmahaemominutum))；-貓血支原體(Mycoplasmahaemofelis)：3個陽性樣品(其中2個也是血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmahaemominutum))；-陰性樣品：10個。采用本發(fā)明的方法獲得的結果：-血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmahaemominutum)：9個陽性樣品(其中2個陽性樣品也是貓血支原體(Mycoplasmahaemofelis)，2個樣品也是貓血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmaturicensis))；-貓血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmaturicensis)：2個陽性樣品(其中該2個陽性樣品也是血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmahaemominutum))；-貓血支原體(Mycoplasmahaemofelis)：3個陽性樣品(其中2個也是血巴爾通氏體(CandidatusMycoplasmahaemominutum))；-陰性樣品：10個。采用下述方法對比檢測了本發(fā)明所獲得的結果：a)在熱循環(huán)儀上實時監(jiān)控；b)含有和不含檸檬酸鈉的羥基萘酚藍的顏色變化。共進行了20組對照測試。根據(jù)本發(fā)明的方法，只有當向反應混合物中加入羥基萘酚藍和檸檬酸鈉的組合時，兩種檢測方法的結果才表現(xiàn)出了100％的一致。單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的污染檢測為了檢測單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)，測試了19個從單核細胞增生李斯特菌的細胞培養(yǎng)物種提取的DNA樣品。通過商業(yè)試劑盒(Macherey-Nagel)從血液樣品中提取了DNA。采用下述方法對比檢測了本發(fā)明所獲得的結果：a)在熱循環(huán)儀上實時監(jiān)控；b)含有和不含檸檬酸鈉的羥基萘酚藍的顏色變化。共進行了20組對照測試。根據(jù)本發(fā)明的方法，只有當向反應混合物中加入羥基萘酚藍和檸檬酸鈉的組合時，兩種檢測方法的結果才表現(xiàn)出了100％的一致。此外，在質(zhì)粒(具體為pCRTM4-載體作為質(zhì)粒)上進行了測試，其中，所述質(zhì)粒中已經(jīng)引入了被擴增的李斯特基因組的相同區(qū)相對應的DNA片段。測試通過一系列不同稀釋濃度(以10為基數(shù))的質(zhì)粒發(fā)生LAMP反應的方式進行，并且檢測到了2靶/μl(對應于起始質(zhì)粒以10為基數(shù)的第九次稀釋)的LAMP測試敏感度。熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的污染檢測為了檢測熒光假單胞菌的污染，用商業(yè)試劑盒(Macherey-Nagel)測試了從熒光假單胞菌的細菌培養(yǎng)物中提取的18個DNA樣品。所述樣品經(jīng)過本發(fā)明方法的處理，且采用實時監(jiān)控和顏色變化的方式對發(fā)生的擴增進行了檢驗。結果明確表明：只有本發(fā)明的方法能檢測所有DNA樣品中熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的存在。鉤端螺旋體(Leptospira)污染的檢測為了檢測鉤端螺旋體(Leptospira)，測試了以商業(yè)試劑盒(Macherey-Nagel)從尿液(其陽性已知)中提取的11個DNA樣品。以本發(fā)明的方法和PCR對所述樣品進行了二聯(lián)檢測。結果表明：本發(fā)明的方法能檢測11種樣品中的11種陽性。參考的PCR方法已檢測到了11中樣品中的11中陽性。本發(fā)明的方法可通過肉眼觀察使用實時監(jiān)控以及反應混合物顏色變化的結果。兩種可視化方法顯示出了100％的結果一致性。細小病毒(Parvovirus)的污染檢測為了檢測細小病毒(Parvovirus)，分析了以商業(yè)試劑盒(Macherey-Nagel)從標本(其陽性已知)中提取的9種DNA樣品。以PCR以及本發(fā)明的方法對樣品進行了分析，且結果的重合性得到了驗證。最后，以實時監(jiān)控以及使用混合物顏色的變化對通過本發(fā)明的方法擴增后得到的產(chǎn)物進行了檢測。結果表明，采用兩種不同方法得到的結果顯示了100％的一致性。