本發(fā)明涉及一種核酸擴(kuò)增裝置、核酸擴(kuò)增方法以及核酸擴(kuò)增用芯片。

背景技術(shù)：

核酸的檢測(cè)是藥物研發(fā)、法醫(yī)學(xué)、臨床試驗(yàn)、農(nóng)產(chǎn)品和病原微生物類型鑒定等諸多領(lǐng)域的核心。通過(guò)分子系統(tǒng)發(fā)育分析而能夠檢測(cè)諸如癌癥、微生物感染和基因標(biāo)記等各種疾病是疾病和疾病發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)的診斷、標(biāo)記搜索、食品和環(huán)境安全評(píng)價(jià)、犯罪證據(jù)以及許多其它技術(shù)方面的通用技術(shù)。

用于檢測(cè)少量核酸(基因)的最強(qiáng)大的基礎(chǔ)技術(shù)之一為一種用于對(duì)通過(guò)核酸序列的部分或全部進(jìn)行呈指數(shù)地復(fù)制而獲得的產(chǎn)物進(jìn)行分析的方法。

PCR是一種對(duì)DNA的特定區(qū)域進(jìn)行選擇性擴(kuò)增的有效技術(shù)。利用PCR，可以從單一模板DNA分子快速地在模板DNA中復(fù)制產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)拷貝的目的DNA序列。在PCR中，重復(fù)進(jìn)行兩相或三相溫度循環(huán)(稱為“熱循環(huán)”)從而依次進(jìn)行以下各個(gè)反應(yīng)：變成單鏈的DNA變性；形成變性的單鏈DNA的引物退火；以及使用耐熱DNA聚合酶的引物延伸。重復(fù)該循環(huán)直至得到用于分析的足夠拷貝數(shù)量。原理上，PCR的每次循環(huán)可使拷貝數(shù)量增加一倍。實(shí)際上，隨著熱循環(huán)的繼續(xù)，所需反應(yīng)物的濃度降低，使得擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物的構(gòu)建最終停止。關(guān)于PCR大致細(xì)節(jié)，參見(jiàn)《PCR的臨床應(yīng)用》(Dennis Lo主編，于1998年由位于Totowa,New Jersey的Humana出版社出版)和《PCR協(xié)議-方法和應(yīng)用指南》(M.A.Innis等主編，于1990年由位于San Diego,California的學(xué)術(shù)出版社有限公司出版)。

雖然PCR是一種對(duì)期望DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增的有效技術(shù)，而在完成PCR后有必要通過(guò)凝膠電泳等進(jìn)行確認(rèn)，用以對(duì)擴(kuò)增的DNA進(jìn)行確定。因此，作為一種改進(jìn)的PCR方法，開(kāi)發(fā)了一種根據(jù)期望DNA的擴(kuò)增量的實(shí)時(shí)PCR進(jìn)化或熒光淬滅技術(shù)，從而使樣品中期望DNA的存在與否變得容易確認(rèn)。在傳統(tǒng)PCR方法中，當(dāng)在PCR之前樣品中模板DNA的量超出一定量時(shí)，PCR之后擴(kuò)增的DNA的量通常進(jìn)入平穩(wěn)狀態(tài)，而PCR之前的模板DNA的量無(wú)法進(jìn)行定量。而在實(shí)時(shí)PCR方法中，在PCR進(jìn)入平穩(wěn)狀態(tài)之前，可以對(duì)PCR過(guò)程中擴(kuò)增的DNA的量進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)；因此，可根據(jù)DNA的擴(kuò)增狀態(tài)來(lái)對(duì)PCR之前的模板DNA的量進(jìn)行定量。因此，實(shí)時(shí)PCR方法也被稱之為定量PCR方法。

利用實(shí)時(shí)PCR的目的DNA量的定量具有特殊的臨床效用，例如，用于監(jiān)測(cè)病毒載量的變化，用以確認(rèn)對(duì)諸如艾滋病病毒(HIV)等的病毒感染的治療效果。利用實(shí)時(shí)PCR的DNA定量對(duì)機(jī)會(huì)性感染的診斷也是有效的，比如皰疹病毒(HHV)，許多患者自從嬰兒期就已經(jīng)亞臨床感染并由于較弱的體質(zhì)等原因而發(fā)展。

PCR和實(shí)時(shí)PCR是通過(guò)熱循環(huán)對(duì)基因進(jìn)行呈指數(shù)地?cái)U(kuò)增的有效方法。用于PCR的通用熱循環(huán)裝置由于用作加熱器的鋁塊的熱容量較大，因而在溫度控制方面較為緩慢，通常需要1到2小時(shí)、甚至在某些情況下需要更長(zhǎng)時(shí)間才能進(jìn)行PCR的30-40次循環(huán)。因此，即使使用現(xiàn)有最先進(jìn)的基因測(cè)試裝置，分析過(guò)程往往需要1小時(shí)以上。自從該技術(shù)開(kāi)發(fā)以來(lái)，增加PCR的速度一直是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。業(yè)已開(kāi)發(fā)了用于提高速度的各種方法?？蓪⑻岣邿嵫h(huán)樣品的速度的方法分為以下三種類型。

在第一種方法中，樣品溶液被導(dǎo)入裝置中，在一定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行溫度循環(huán)并且使溶液保持在同一部位(非專利文獻(xiàn)(NPL)1和專利文獻(xiàn)(PTL)1)。該方法意于通過(guò)減少樣品的量而降低熱容量，從而增加熱循環(huán)的速度。然而，容納腔或加熱器本身的熱容量的減少有一定限度。因此，每次循環(huán)至少需要約30秒才能實(shí)現(xiàn)足夠的擴(kuò)增反應(yīng)。即使使用最快的裝置，完成PCR反應(yīng)也需要15分鐘以上。

第二種方法被稱之為連續(xù)流動(dòng)式PCR。在該方法中，樣品溶液通過(guò)微通道流經(jīng)彼此隔開(kāi)的多個(gè)溫度區(qū)，同時(shí)不停地進(jìn)行溶液的連續(xù)進(jìn)樣。在這種連續(xù)流動(dòng)式PCR方法中，已知的系統(tǒng)是通過(guò)使樣品溶液流經(jīng)三個(gè)控制為恒溫的加熱器上方的蛇形微通道而快速控制樣品溫度的(NPL 2)。由于這種連續(xù)流動(dòng)式PCR方法無(wú)需改變外部裝置(如容器和加熱器等)的溫度，因此理論上可期望達(dá)到最快的溫度控制。在極快的情況下，約7分鐘之內(nèi)完成DNA擴(kuò)增。然而，采用連續(xù)流動(dòng)式PCR進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR，有必要使得能夠?qū)Ω鱾€(gè)蛇形微通道的全區(qū)或在同一溫度區(qū)的每個(gè)蛇形微通道的30-50個(gè)區(qū)域進(jìn)行熒光觀察。具體地，需要可均勻地照射較大區(qū)域的激發(fā)光源和用于熒光觀察的高靈敏度攝像機(jī)或行掃描器，因此必然導(dǎo)致系統(tǒng)結(jié)構(gòu)體積較大且價(jià)格昂貴。

在第三種方法中，如第二種方法，彼此間隔的多個(gè)溫度區(qū)通過(guò)微通道而連接，并且使樣品溶液往復(fù)地(reciprocally)流經(jīng)相同微通道，且使得樣品溶液在每個(gè)溫度區(qū)停留一定時(shí)間段從而被加熱(專利文獻(xiàn)(PTL)2)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于進(jìn)行熱循環(huán)過(guò)程中樣品與各溫度區(qū)的接觸時(shí)間可以自由設(shè)置。然而，為了導(dǎo)入樣品并將其往復(fù)或旋轉(zhuǎn)地泵至這些溫度區(qū)，需要使用許多集成閥和泵以及用于觀察樣品溶液位置的檢測(cè)器，用于防止樣品溶液由于高溫側(cè)加熱的樣品中形成的小氣泡的膨脹或由于在氣液界面上形成的氣壓差(當(dāng)樣品溶液流經(jīng)具有從用于變性反應(yīng)95℃以上至用于退火反應(yīng)約60℃的溫度梯度的微通道時(shí))而非意愿地流出微通道中的期望溫度區(qū)位置，而且裝置小型化困難(NPL 3、NPL 4和PTL 3)。

使用PCR/實(shí)時(shí)PCR裝置的基因檢測(cè)市場(chǎng)在有利增長(zhǎng)。尤其是諸如病毒性肝炎、性傳播疾病和流感等傳染性疾病的基因檢測(cè)，在日本也迅速展開(kāi)。基因檢測(cè)對(duì)于癌癥治療的作用已變得明顯。例如，EGFR基因突變可用作施用癌劑Iressa的一個(gè)經(jīng)驗(yàn)法則。因此，對(duì)于肺癌、胰腺癌等中的EGFR基因、K-ras基因，EWS-Flil基因、TLS-CHOP基因，SVT-SSX基因以及c-kit基因的基因檢測(cè)最近已經(jīng)進(jìn)入保險(xiǎn)的覆蓋范圍。

在PCR中，引物被連接至模板DNA，并且位于引物序列之間的目的DNA專門(mén)由DNA聚合酶來(lái)檢測(cè)。雖然PCR可用于檢測(cè)DNA，但PCR不能直接檢測(cè)RNA。因此，為了檢測(cè)諸如流感病毒、諾如病毒(noroviruses)等RNA病毒，在以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的cDNA后再進(jìn)行PCR；也就是進(jìn)行所謂的RT-PCR。因此，實(shí)質(zhì)上必須進(jìn)行一個(gè)兩階段的步驟。此外，PCR和RT-PCR需要快速升溫和快速降溫，因而需要特殊的孵化器。因此，問(wèn)題在于：使PCR和RT-PCR的應(yīng)用自動(dòng)化并不容易。

近年來(lái)，通過(guò)在一個(gè)PCR系統(tǒng)中使用多對(duì)引物而同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)基因區(qū)域的多重PCR引起人們的關(guān)注。從多重PCR發(fā)展而來(lái)的實(shí)時(shí)多重PCR，旨在受其他目的基因的影響(串?dāng)_)較小并且不損害靈敏度的條件下單獨(dú)檢測(cè)和定量多個(gè)不同的目的基因。然而，據(jù)報(bào)道，由于可標(biāo)記的熒光物質(zhì)波長(zhǎng)重疊和種類問(wèn)題使得兩個(gè)以上的定量多重反應(yīng)往往很難進(jìn)行。

目前，基因檢測(cè)是在實(shí)驗(yàn)室或分析中心進(jìn)行的。然而，如果有可現(xiàn)場(chǎng)快速進(jìn)行基因測(cè)試的高速實(shí)時(shí)PCR裝置，則可以現(xiàn)場(chǎng)確定治療方案和對(duì)策。因此，這樣的裝置被認(rèn)為是可以取代目前的基因測(cè)試裝置的一個(gè)劃時(shí)代的技術(shù)。特別是，作為防止口蹄疫、高致病性流感之類的流行病的檢疫措施，用于對(duì)其進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速準(zhǔn)確的判斷并防止繼發(fā)性感染的傳播是非常重要的。因此，需要大量這樣的高速實(shí)時(shí)PCR裝置。

尤其是，為了實(shí)現(xiàn)在臨床情景中或在發(fā)生傳染病的現(xiàn)場(chǎng)立即進(jìn)行基因測(cè)試的服務(wù)需求，需要一種低成本操作的、高速和高度便攜式的實(shí)時(shí)PCR裝置。

引用列表

專利文獻(xiàn)

PTL 1：公開(kāi)號(hào)為2479452的加拿大專利申請(qǐng)

PTL 2:JP2003-200041A

PTL 3:WO2006/124458

非專利文獻(xiàn)

NPL 1:Neuzil等(實(shí)驗(yàn)室芯片，10:2632-2634(2010))

NPL 2:Kopp等(科學(xué)，280:1046-1048(1998))

NPL 3:Chiou等(分析化學(xué)，73:2018-2021(2001))

NPL 4:Brunklaus等(電泳療法，33:3222-3228(2012))。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問(wèn)題

本發(fā)明的目的是提供一種能夠現(xiàn)場(chǎng)使用并能進(jìn)行高速實(shí)時(shí)PCR的小型核酸擴(kuò)增裝置、用于該裝置的板以及核酸擴(kuò)增方法。

解決問(wèn)題的方案

為了實(shí)現(xiàn)了增加反應(yīng)效率以及提供一種較小的擴(kuò)增裝置的目的，本發(fā)明提供了一種往復(fù)流動(dòng)型(reciprocal-flow-type)高速實(shí)時(shí)核酸擴(kuò)增裝置，包括：設(shè)置在同一平面上的兩個(gè)溫度區(qū)；與各溫度區(qū)接觸的微通道，當(dāng)鼓風(fēng)機(jī)、風(fēng)扇等停止時(shí)，所述微通道的兩端設(shè)置為向大氣壓開(kāi)放；以及液體輸送機(jī)構(gòu)，籍此活塞式樣品溶液通過(guò)所述微通道在各個(gè)所述溫度區(qū)的精確位置之間進(jìn)行往復(fù)，從而進(jìn)行熱循環(huán)并同時(shí)確認(rèn)PCR溶液的通過(guò)以及測(cè)量每次熱循環(huán)的熒光強(qiáng)度。在另一個(gè)示例性實(shí)施例中，核酸擴(kuò)增方法包括通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄將RNA轉(zhuǎn)換為cDNA以及將所述cDNA進(jìn)行PCR處理。

具體地，本發(fā)明提供了以下核酸擴(kuò)增裝置、核酸擴(kuò)增方法、以及芯片。

(1)一種往復(fù)流動(dòng)型核酸擴(kuò)增裝置，包括：

加熱器，所述加熱器能夠形成變性溫度區(qū)和延伸/退火溫度區(qū)；

熒光檢測(cè)器，所述熒光檢測(cè)器能夠檢測(cè)樣品溶液在兩個(gè)溫度區(qū)之間的移動(dòng)；

一對(duì)液體輸送機(jī)構(gòu)，所述一對(duì)液體輸送機(jī)構(gòu)允許所述樣品溶液在兩個(gè)所述溫度區(qū)之間移動(dòng)，并且當(dāng)液體輸送停止時(shí)，所述液體輸送機(jī)構(gòu)設(shè)置為對(duì)大氣壓開(kāi)放；

基板，核酸擴(kuò)增用芯片可以放置在所述基板上；以及

控制機(jī)構(gòu)，所述控制機(jī)構(gòu)通過(guò)接收來(lái)自所述熒光檢測(cè)器的與所述樣品溶液的移動(dòng)有關(guān)的電信號(hào)來(lái)控制各液體輸送機(jī)構(gòu)的驅(qū)動(dòng)，

所述裝置能夠通過(guò)測(cè)量每次熱循環(huán)的熒光強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。

(2)一種核酸擴(kuò)增用芯片，包括至少一個(gè)微通道，所述微通道包括：

彎曲微通道，所述彎曲微通道分別用于根據(jù)(1)所述的核酸擴(kuò)增裝置的所述變性溫度區(qū)和所述延伸/退火溫度區(qū)；

直線中間微通道，所述直線中間微通道連接所述彎曲微通道；以及

連接部，所述連接部位于所述微通道的兩端，

所述連接部可連接至根據(jù)(1)所述的核酸擴(kuò)增裝置的所述液體輸送機(jī)構(gòu)。

(3)根據(jù)(1)所述的核酸擴(kuò)增裝置，其中，所述液體輸送機(jī)構(gòu)為微型鼓風(fēng)機(jī)或風(fēng)扇。

(4)一種核酸擴(kuò)增方法，包括以下步驟：

步驟1：將根據(jù)(2)所述的核酸擴(kuò)增用芯片放置在根據(jù)(1)所述的基板上，使得所述變性溫度區(qū)和所述延伸/退火溫度區(qū)分別包括彎曲微通道；

步驟2：將樣品溶液導(dǎo)入所述微通道中；

步驟3：將一對(duì)液體輸送機(jī)構(gòu)連接至位于所述微通道兩端的液體輸送機(jī)構(gòu)連接部；以及

步驟4：利用所述液體輸送機(jī)構(gòu)將所述樣品溶液在所述微通道的所述彎曲微通道之間進(jìn)行往復(fù)從而進(jìn)行熱循環(huán)，并同時(shí)使用在所述中間微通道中的至少一個(gè)熒光檢測(cè)器來(lái)測(cè)量每次熱循環(huán)的所述樣品溶液的熒光強(qiáng)度并確認(rèn)所述樣品溶液的通過(guò)，用以進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。

(5)根據(jù)(4)所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，所述熒光強(qiáng)度的測(cè)量是通過(guò)同時(shí)測(cè)量?jī)煞N以上熒光波長(zhǎng)來(lái)同時(shí)測(cè)量在一個(gè)微通道中的多個(gè)基因的實(shí)時(shí)PCR而進(jìn)行的。

(6)根據(jù)(4)或(5)所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，所述熒光強(qiáng)度的測(cè)量是通過(guò)使用從由每次熱循環(huán)的熒光強(qiáng)度的矩陣(擴(kuò)增曲線的二維數(shù)組)導(dǎo)出的循環(huán)次數(shù)Ct求得的校準(zhǔn)曲線而進(jìn)行的。

(7)根據(jù)(4)至(6)任一項(xiàng)所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，所述核酸擴(kuò)增方法選自由聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、一步法PCR、多重PCR、多重RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR以及實(shí)時(shí)RT-PCR組成的組。

(8)根據(jù)(4)到(7)任一項(xiàng)所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，所述核酸擴(kuò)增方法包括執(zhí)行中斷分析，所述中斷分析可通過(guò)在平坦的基板上形成兩個(gè)以上微通道而進(jìn)行，使得能夠?qū)νㄟ^(guò)各微通道的液體輸送操作進(jìn)行獨(dú)立地控制。

(9)根據(jù)(4)至(8)任一項(xiàng)所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，所述方法包括：

將微量吸管的過(guò)濾吸頭的端部連接至一個(gè)所述連接部，從而將樣品溶液導(dǎo)入至所述微通道中；

在所述吸頭與所述連接部相連接的狀態(tài)下移除所述微量吸管，然后將所述吸頭連接至一個(gè)所述液體輸送機(jī)構(gòu)。

(10)根據(jù)(4)至(9)任一項(xiàng)所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，導(dǎo)入至所述微通道中的所述樣品溶液的體積在5μL-50μL的范圍內(nèi)。

(11)根據(jù)(2)所述的核酸擴(kuò)增用芯片，所述芯片用于根據(jù)(4)至(10)任一項(xiàng)所述的核酸擴(kuò)增方法中。

發(fā)明的有益效果

根據(jù)本發(fā)明，由于每個(gè)微通道設(shè)置有兩個(gè)液體輸送機(jī)構(gòu)(優(yōu)選風(fēng)扇)和一個(gè)熒光檢測(cè)器，因此實(shí)現(xiàn)了低成本、緊湊型的便攜式裝置。

此外，由于樣品溶液在兩個(gè)溫度區(qū)之間往復(fù)，因此能夠通過(guò)同時(shí)快速地確認(rèn)PCR溶液的通過(guò)以及測(cè)量每次熱循環(huán)的熒光強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)更快的實(shí)時(shí)PCR。

在使用對(duì)樣品溶液進(jìn)行往復(fù)的熱循環(huán)的常規(guī)方法中，壓力源(如注射器泵)連接至微通道，通過(guò)重復(fù)地加壓和減壓而使活塞狀(plug-like)樣品溶液進(jìn)行往復(fù)。在此過(guò)程中，微通道在與壓力源連接一側(cè)的內(nèi)部必須是一個(gè)封閉系統(tǒng)，以便不泄漏微通道中活塞狀樣品溶液的壓力。當(dāng)施加到氣液界面的活塞狀樣品溶液的力(通過(guò)壓力源施加或減少壓力而產(chǎn)生)超過(guò)了活塞狀樣品溶液和微通道內(nèi)壁之間的靜摩擦力時(shí)，液體輸送開(kāi)始。另一方面，當(dāng)停止加壓或減壓而使活塞狀樣品溶液停止時(shí)，作用在氣液界面上的樣品溶液的壓力保持在壓力源側(cè)的封閉微通道之內(nèi)，并且溶液保持移動(dòng)一段時(shí)間直至能量完全被動(dòng)摩擦消耗然后停止。尤其是，當(dāng)樣品溶液被加熱到約95℃或更高進(jìn)行變性反應(yīng)(如在PCR中)，內(nèi)部壓力的變化對(duì)樣品溶液的影響很大(如粘度變化和小氣泡的形成)，壓力源(比如泵)停止之后的移動(dòng)量變化范圍較大。為了使樣品溶液停止在精確位置，有必要采取一些措施，如使用專用閥釋放微通道的內(nèi)部壓力以及對(duì)壓力源進(jìn)行復(fù)雜操作，以及使用專用傳感器來(lái)確認(rèn)溶液的位置等。

相比之下，盡管本發(fā)明通過(guò)使用鼓風(fēng)機(jī)、風(fēng)扇等進(jìn)行鼓風(fēng)而在微通道中施加或減少壓力以使活塞狀樣品溶液往復(fù)，當(dāng)溶液達(dá)到各溫度區(qū)上的精確位置或剛好達(dá)到各溫度區(qū)上的精確位置之前，在鼓風(fēng)機(jī)、風(fēng)扇等的鼓風(fēng)停止則液體輸送也立即停止。這是因?yàn)楫?dāng)鼓風(fēng)停止，微通道的內(nèi)部壓力瞬間對(duì)大氣壓開(kāi)放、作用于活塞狀溶液的壓力消失，從而液體輸送立即停止。因此，即使沒(méi)有釋放壓力以控制樣品溶液位置用的多個(gè)閥，也可以通過(guò)確認(rèn)樣品溶液僅在位于各溫度區(qū)之間的一個(gè)位點(diǎn)處的通過(guò)即可實(shí)現(xiàn)精確的位置控制。此外，由于也可以同時(shí)在該位點(diǎn)(在此確認(rèn)每次循環(huán)的往復(fù)液體的位置)使用熒光法，因此能夠?qū)崿F(xiàn)結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的實(shí)時(shí)PCR熱循環(huán)儀，其中只需使用直線微通道中的一個(gè)位點(diǎn)作為檢測(cè)點(diǎn)。

在本發(fā)明中，使用聚合酶鏈反應(yīng)(通常稱之為PCR)。PCR使用變性、形成相對(duì)鏈的引物對(duì)的退火以及引物延伸的多次循環(huán)來(lái)呈指數(shù)地增加目的核酸序列的拷貝數(shù)量。在其變體(也稱逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR))中，使用逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)來(lái)由mRNA制備互補(bǔ)DNA(cDNA)，然后通過(guò)PCR來(lái)擴(kuò)增cDNA，從而產(chǎn)生大量的DNA拷貝。

對(duì)于RT-PCR，可使用一步法RT-PCR。一步法RT-PCR是一種能夠從RT的孵育至PCR的循環(huán)以一個(gè)步驟快速方便地進(jìn)行RT-PCR且無(wú)需開(kāi)閉管或添加試劑的RT-PCR方法。在此技術(shù)領(lǐng)域，可使用一步法RT-PCR(比如QIAGEN的一步法RT-PCR MIX)用的各種試劑盒和協(xié)議并對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)選擇來(lái)進(jìn)行一步法RT-PCR。

PCR的各種其它排列，例如可參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,683,195，4,683,202和4,800,159；Mullis等，《酶學(xué)方法》，155：335(1987)；以及Murakawa等，《DNA》，7：287(1988)；以上各文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式結(jié)合于此。

附圖說(shuō)明

圖1示出了核酸擴(kuò)增裝置的構(gòu)造。

圖2示出了PCR芯片的構(gòu)造。

圖3示出了高速實(shí)時(shí)PCR中的核酸擴(kuò)增。

圖4示出了用于高速實(shí)時(shí)PCR中的大腸桿菌(Escherichia coli)的校準(zhǔn)曲線。

圖5示出了對(duì)各目的DNA長(zhǎng)度作圖的保留時(shí)間，該保留時(shí)間允許對(duì)目的DNA進(jìn)行充分?jǐn)U增，即使縮短退火時(shí)間和延伸反應(yīng)時(shí)間也沒(méi)有表現(xiàn)出任何Ct值的變化。

圖6示出了病原微生物A、病原微生物B和β肌動(dòng)蛋白基因(βactin gene)的多重PCR。

圖7示出了在使用不同的逆轉(zhuǎn)錄酶的高速一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR中，包含諾如病毒G1或諾如病毒G2基因序列的RNA的核酸擴(kuò)增。

圖8示出了在高速一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR中，包括諾如病毒G1或諾如病毒G2基因序列的不同濃度初始的RNA的核酸擴(kuò)增。

圖9示出了以循環(huán)次數(shù)Ct(其中在高速一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR中熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)和上升)對(duì)應(yīng)包含諾如病毒G1或諾如病毒G2基因序列的RNA作圖得到的校準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

參照?qǐng)D1-9，本發(fā)明反應(yīng)器的一個(gè)實(shí)施例解釋如下。

如圖1所示，用于高速實(shí)時(shí)PCR中的裝置配置為包括用于在其上放置PCR芯片的基板(圖中未示出)、PCR芯片的溫度控制部、用作液體輸送機(jī)構(gòu)的液體輸送微型鼓風(fēng)機(jī)、熒光檢測(cè)器、用作控制機(jī)構(gòu)的控制計(jì)算機(jī)、以及供電電池。

PCR芯片的溫度控制部配置為包括兩個(gè)筒形加熱器(cartridge heaters)，這兩個(gè)筒形加熱器以10mm的間隔并列設(shè)置從而與PCR芯片的蛇形微通道的密封面?zhèn)认嘟佑|且其間沒(méi)有任何空隙。為了控制這兩個(gè)加熱器的溫度，每個(gè)加熱器均連接有K型熱電偶。

通過(guò)控制計(jì)算機(jī)將筒形加熱器1控制為PCR所必需的DNA變性反應(yīng)所需要的溫度。該溫度(變性溫度區(qū))優(yōu)選為90-100℃，特別優(yōu)選為95℃。通過(guò)控制計(jì)算機(jī)將筒形加熱器2控制為DNA的退火反應(yīng)和延伸反應(yīng)(延伸/退火溫度區(qū))所需的溫度。該溫度優(yōu)選為40-75℃，尤其為55-65℃。DNA變性反應(yīng)溫度區(qū)以及退火反應(yīng)和延伸反應(yīng)溫度區(qū)優(yōu)選控制在恒定溫度。例如，通過(guò)PID(比例積分微分)控制使這兩個(gè)溫度區(qū)保持在恒定溫度。

使用微量吸管之類的將待輸送的PCR溶液定量至5-50μL范圍之內(nèi)的所需量，更優(yōu)選定量至5-25μL。在微量吸管中含有PCR樣品溶液狀態(tài)下，將微量吸管的一次性吸頭安裝在微通道的一端上。取下微量吸管本體之后，連接上與液體輸送微型鼓風(fēng)機(jī)連接的氣壓管(air pressure tube)作為替代，通過(guò)鼓風(fēng)而施加壓力，從而將樣品溶液進(jìn)樣至PCR芯片的微通道中。

PCR樣品溶液為PCR所需的組分與熒光探針(如Taqman探針、Cycleave探針或)和熒光染料(如SYBR綠)的預(yù)混合產(chǎn)物，從而能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。像這樣的熒光探針、實(shí)時(shí)PCR用試劑盒以及由外包公司合成的產(chǎn)品都可以使用。

熒光檢測(cè)器設(shè)置用于測(cè)量位于設(shè)置在各微通道中心處的直線微通道上的一個(gè)檢測(cè)點(diǎn)處的熒光強(qiáng)度。當(dāng)通過(guò)施加壓力而使從一個(gè)蛇形微通通道輸送來(lái)的PCR溶液流經(jīng)檢測(cè)點(diǎn)時(shí)，停止液體輸送微型鼓風(fēng)機(jī)，從而使PCR溶液可以保留在其它蛇形微通道中一定時(shí)間段。

可以對(duì)控制計(jì)算機(jī)進(jìn)行編程而使其同時(shí)控制與各微通道連接的兩個(gè)微型鼓風(fēng)機(jī)。在對(duì)位于各微通道的中心的檢測(cè)位點(diǎn)處的熒光強(qiáng)度進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)期間，交替地切換微型鼓風(fēng)機(jī)從而將PCR樣品溶液交替地移動(dòng)至各加熱器上方的各蛇形微通道一預(yù)定時(shí)間段，進(jìn)行熱循環(huán)。此外，在實(shí)時(shí)PCR方法中，控制計(jì)算機(jī)同時(shí)記錄每次循環(huán)的熒光強(qiáng)度的變化和計(jì)算循環(huán)次數(shù)(Ct值)，其中熒光強(qiáng)度隨著目的DNA由于實(shí)時(shí)PCR方法中的熱循環(huán)的擴(kuò)增而增加，且熒光強(qiáng)度超過(guò)一定的閾值，從而對(duì)目的DNA的初始量進(jìn)行定量。

用于高速實(shí)時(shí)PCR的PCR芯片(核酸擴(kuò)增用芯片)配置為包括COP樹(shù)脂基板和施加于基板上的聚烯烴透明密封，該COP樹(shù)脂基板包括通過(guò)注塑形成的四個(gè)并列的微通道。

各微通道配置為在兩個(gè)部分上蜿蜒折回，其寬度如圖2所示、其深度為700μm。各蛇形微通道折回四次，并使得位于各微通道中心處的直線微通道夾在多個(gè)蛇形微通道之間，且每個(gè)蛇形微通道部中可單獨(dú)容納至少25μL的溶液。

圖2中，使用加熱器對(duì)虛線圍成的區(qū)域(變性溫度區(qū)和延伸/退火溫度區(qū))進(jìn)行加熱而進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR中的熱循環(huán)。

微通道的兩端分別連接至穿透樹(shù)脂基板的小孔(液體輸送機(jī)構(gòu)的連接部)。即使樹(shù)脂基板的整個(gè)微通道側(cè)表面接合有聚烯烴透明密封，反應(yīng)溶液和空氣能通過(guò)小孔進(jìn)入各微通道中。

小孔配置為允許對(duì)一般用于生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的微量吸管安裝一次性的吸頭。在量取5-25μL的PCR溶液后，可直接連接一次性吸頭，籍此可在無(wú)需使用特殊儀器且不受污染等條件下導(dǎo)入PCR溶液。

通過(guò)在平坦的基板上形成兩個(gè)以上微通道或通過(guò)并列設(shè)置兩個(gè)以上分別含有微通道的平坦基板，使得中斷分析成為可能，從而可以獨(dú)立地控制通過(guò)各微通道的液體輸送操作。

優(yōu)選的，微通道包含的材料具有較高導(dǎo)熱性，在PCR所需的溫度范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，耐電解質(zhì)溶液和有機(jī)溶劑的腐蝕，并且不吸收核酸或蛋白質(zhì)。材料的實(shí)例包括玻璃、石英、硅和各種塑料。與多個(gè)溫度區(qū)相接觸的微通道的形狀不僅可以是直線微通道，也可以是彎曲微通道(如環(huán)形的蛇形微通道)，或螺旋形微通道。微通道的寬度或深度不一定是恒定的，并且微通道可能部分地具有不同的寬度或深度。

優(yōu)選地，使用相同的熒光檢測(cè)器進(jìn)行流經(jīng)微通道進(jìn)入不同溫度區(qū)的樣品溶液的通過(guò)的檢測(cè)以及每次熱循的環(huán)熒光強(qiáng)度的測(cè)量，但也可以使用不同的熒光檢測(cè)器。用于檢測(cè)樣品溶液在不同溫度區(qū)域之間的通過(guò)的方法不限于熒光檢測(cè)，還可以為光學(xué)方法，如比色法和光吸收法，或電法(例如利用電容或包含電化學(xué)反應(yīng)的變化)。與微通道相接觸的兩個(gè)以上溫度區(qū)可以從微通道的外部與之接觸，也可以包含在微通道內(nèi)。

在圖2所示的微通道中，變性溫度區(qū)和延伸/退火溫度區(qū)的兩個(gè)蛇形微通道通過(guò)直線中間微通道而彼此連接，在中間微通道中進(jìn)行樣品溶液的通過(guò)以及熒光的檢測(cè)。在圖2中，中間微通道沿著連接兩個(gè)小孔(液體輸送機(jī)構(gòu)的連接部)的直線進(jìn)行設(shè)置，并且在中間微通道中進(jìn)行測(cè)試溶液的通過(guò)和熒光的檢測(cè)。因此，即使將PCR芯片(核酸擴(kuò)增用芯片)翻轉(zhuǎn)(翻轉(zhuǎn)180度)后放置在基板上，也能使用熒光檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)熒光。

例如，如圖2所示，PCR芯片可以固定到兩個(gè)加熱器上，其固定方式使得PCR芯片附著在虛線圍成的各蛇形微通道部的密封面上，并且使用后，PCR芯片可能被取下、拋棄處理以及替換用于特定用途。兩個(gè)液體輸送微型鼓風(fēng)機(jī)用于PCR芯片的各個(gè)微通道。各微型鼓風(fēng)機(jī)分別通過(guò)氣壓管與連接至微通道兩端的兩個(gè)一次性吸頭連接。交替地操作各個(gè)微型鼓風(fēng)機(jī)，從而實(shí)現(xiàn)液體的雙向輸送。也可以同時(shí)對(duì)不同的樣品進(jìn)行熱循環(huán)，例如，根據(jù)微通道的數(shù)量來(lái)增加液體輸送微型鼓風(fēng)機(jī)的數(shù)量，以進(jìn)行多重PCR。

本發(fā)明上下文中的“多重PCR”是指在單一的反應(yīng)溶液中使用包含兩種以上的正向引物和反向引物的引物集的PCR。本發(fā)明上下文中的“引物集”是指一種或兩種或更多種的正向引物和反向引物的組合。在本發(fā)明中，也可以使用甚至僅包含一種反向引物的引物集作為多重PCR的引物集，只要使用該反向引物與兩種以上的正向引物組合(作為引物對(duì))生產(chǎn)出不同的擴(kuò)增產(chǎn)品即可。

在本發(fā)明的多重PCR中，同時(shí)測(cè)量熒光強(qiáng)度用以檢測(cè)對(duì)應(yīng)于不同熒光波長(zhǎng)的目的基因的擴(kuò)增。雖然可以使用多個(gè)熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，即使使用一個(gè)波長(zhǎng)的光，檢測(cè)也是可行的。

參照實(shí)例，本發(fā)明述及如下。然而本發(fā)明并不限于這些實(shí)例。

實(shí)例1：大腸桿菌的定量

使用本發(fā)明的高速實(shí)時(shí)PCR用PCR芯片和裝置，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行定量。

將大腸桿菌(DH5α株)在卵磷脂肉湯(Lecithin bouillon)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)。當(dāng)制備出濃度為1×10⁴cfu/μL的大腸桿菌懸浮液后(基于瓊脂平板培養(yǎng)基試驗(yàn)(agar plate medium assay)的菌落計(jì)數(shù)(colony count))，制備一系列10倍稀釋液并用作進(jìn)行定量識(shí)別的標(biāo)準(zhǔn)樣品。

實(shí)時(shí)PCR中擴(kuò)增的目的DNA為大腸桿菌-特異uid A基因(GenBank登錄號(hào)：NC_000913.3)的一個(gè)106bp的DNA序列。使用5’-GTG TGA TAT CTA CCC GCT TCG C-3’(序列號(hào)：1)作為PCR的正向引物、使用5’-AGA ACG GTT TGT GGT TAA TCA GGA-3’(序列號(hào)：2)作為反向引物，PCR溶液中的各引物的最終濃度調(diào)整為300nM。實(shí)時(shí)PCR的探針序列為5’-FAM-TCG GCA TCC GGT CAG TGG CAG T-MGB-3’(序列號(hào)：3)。在PCR溶液中的探針的最終濃度調(diào)整為200nM。

另一種試劑使用日本寶生物(Takara Bio)公司的HS DNA聚合酶，其最終濃度為0.1U/μL。將包含在產(chǎn)品包中的FAST Buffer I和dNTP Mixture按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的濃度進(jìn)行混合并用作PCR用預(yù)混合物。使用微量吸管將0.5μL不同濃度的大腸桿菌懸液混合與12μL PCR用預(yù)混合物進(jìn)行混合，將其中吸有PCR溶液的微量吸管的一次性吸頭的端部插入位于PCR芯片的微通道的第一端處的小孔中，然后釋放出微量吸管中的溶液。將另一微量吸管用空的一次性吸頭安裝在微通道的第二端上(其第一端已經(jīng)安裝有前述含有PCR溶液的微量吸管的一次性吸頭)。將液體輸送微型鼓風(fēng)機(jī)用管連接到各個(gè)一次性吸頭上。作為高速實(shí)時(shí)PCR熱循環(huán)，其工藝條件包括在98℃下加熱30秒進(jìn)行DNA聚合酶的熱啟動(dòng)，進(jìn)而98℃下再加熱2秒，然后在58℃下加熱4秒，如此循環(huán)45次。高速實(shí)時(shí)PCR是通過(guò)液體輸送微型鼓風(fēng)機(jī)的程序控制進(jìn)行的。

如圖3所示，高速實(shí)時(shí)PCR中每次循環(huán)的熒光強(qiáng)度繪制的S形曲線(sigmoid curve)與由已知實(shí)時(shí)PCR裝置得到的曲線類似。熒光增強(qiáng)率的變化依賴于大腸桿菌的初始濃度。

當(dāng)跨越熒光強(qiáng)度的期望閾值的循環(huán)次數(shù)定義為Ct，對(duì)大腸桿菌的初始濃度繪制校準(zhǔn)曲線，得到了良好的線性度，如圖4所示。由于非模板對(duì)照(no template control(NTC)，即0cfu/μL)的Ct值為45次以上，結(jié)果證實(shí)，甚至在濃度為100cfu/μL也是可以進(jìn)行定量。檢測(cè)靈敏度被證實(shí)為與現(xiàn)有的實(shí)時(shí)PCR裝置相當(dāng)。

高速實(shí)時(shí)PCR處理時(shí)間為每45次循環(huán)用時(shí)6分鐘40秒。相比之下，在現(xiàn)有市售裝置中甚至高速熱循環(huán)裝置的PCR處理時(shí)間為每45次循環(huán)用45分鐘。因此，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了一種能夠以極高的速度定量微生物或DNA的高速實(shí)時(shí)PCR。

實(shí)例2：高速PCR擴(kuò)增條件的檢查

高速實(shí)時(shí)PCR的進(jìn)行重復(fù)了三個(gè)步驟，即DNA變性反應(yīng)、退火反應(yīng)和延伸反應(yīng)；在延伸反應(yīng)中，使用與DNA模板序列對(duì)應(yīng)的DNA聚合酶從復(fù)制用3’端對(duì)各引物進(jìn)行延伸。其中，DNA變性反應(yīng)和退火反應(yīng)不依賴于目的DNA的長(zhǎng)度，并在短時(shí)間內(nèi)完成。然而，延伸反應(yīng)需要的時(shí)間依賴于目的DNA的長(zhǎng)度和使用的DNA聚合酶的酶活性。在熱循環(huán)高速實(shí)時(shí)PCR中，適當(dāng)?shù)臅r(shí)間設(shè)置也是必要的。

使用10⁴拷貝數(shù)量的大腸桿菌(DH5α株)16S核糖體RNA基因(登錄號(hào)：KC_768803.1)作為模板DNA。在得到的模板DNA中，在約200-800bp的范圍內(nèi)改變目的DNA長(zhǎng)度，進(jìn)行45次循環(huán)的高速實(shí)時(shí)PCR。

使用5’-GTT TGA TCC TGG CTC A-3’(序列號(hào)：4)作為通用正向引物序列，使用5’-FAM-CGG GTG AGT AAT GTC TGG-TAMRA-3’(序列號(hào)：5)作為通用探針。下述反向引物的組合使用依賴于目的DNA的長(zhǎng)度。長(zhǎng)度約200bp的目的DNA的反向引物序列為5’-CTT TGG TCT TGC GAC G-3’(序列號(hào)：6)。約400bp的目的DNA的反向引物序列為5’-GCA TGG CTG CAT CAG-3’(序列號(hào)：7)。約600bp的目的DNA的反向引物序列為5’-CTG ACT TAA CAA ACC GC-3’(序列號(hào)：8)；以及約800bp的目的DNA的反向引物序列為5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’(序列號(hào)：9)。Tm值均設(shè)置為約50℃。

圖5為保留時(shí)間對(duì)應(yīng)各目的DNA長(zhǎng)度繪制的曲線圖，該保留時(shí)間允許對(duì)目的DNA進(jìn)行充足的擴(kuò)增，而且即使縮短退火時(shí)間和延伸反應(yīng)時(shí)間，Ct值也沒(méi)有表現(xiàn)出任何變化。對(duì)于約100bp的短目的DNA，使用上述uid A基因的結(jié)果并繪制在同一曲線圖中。圖5示出了：即使目的DNA的長(zhǎng)度相同，退火反應(yīng)時(shí)間和延伸反應(yīng)時(shí)間依賴于所使用的DNA聚合酶的活性而不同。當(dāng)使用HS DNA聚合酶時(shí)，延伸率約為每秒78bp。當(dāng)使用ExTaq HS DNA聚合酶時(shí)，延伸率約為每秒22bp。

理論上，當(dāng)目的DNA的長(zhǎng)度為0bp時(shí)(對(duì)應(yīng)于圖5中的x軸截距)，無(wú)論使用哪種DNA聚合酶，排除延伸反應(yīng)的退火反應(yīng)時(shí)間約為2.7秒。該結(jié)果與前述發(fā)現(xiàn)是一致的。因此，從理論上，最高速度的實(shí)時(shí)PCR可以基于圖5并對(duì)應(yīng)于目的DNA的長(zhǎng)度來(lái)設(shè)定時(shí)間而進(jìn)行。

實(shí)例3：多重PCR高速實(shí)時(shí)PCR

作為高速實(shí)時(shí)PCR應(yīng)用在從同一樣品中確認(rèn)多個(gè)目的DNA存在與否的多重PCR方法的一個(gè)應(yīng)用實(shí)例，使用可同時(shí)檢測(cè)三種熒光的多色熒光檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)和人類白細(xì)胞衍生β肌動(dòng)蛋白基因(human-leukocyte-derivedβactin gene)。

多色熒光檢測(cè)器能夠?qū)λ{(lán)色激發(fā)、綠色激發(fā)和紅色激發(fā)的各個(gè)熒光進(jìn)行共軸定量。該檢測(cè)器可以通過(guò)3種熒光探針?lè)謩e檢測(cè)熒光增強(qiáng)，即使用FAM標(biāo)記探針、Texas red標(biāo)記探針以及Cy5標(biāo)記探針在PCR芯片上的微通道的同一檢測(cè)點(diǎn)處進(jìn)行檢測(cè)。甚至當(dāng)使用多色熒光檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)器的放置方式要使得可以在位于微通道中心處的直線微通道上的同一檢測(cè)點(diǎn)處同時(shí)檢測(cè)3種熒光強(qiáng)度。當(dāng)通過(guò)施加壓力而從一個(gè)蛇形微通道部輸送來(lái)的PCR溶液已通過(guò)檢測(cè)點(diǎn)時(shí)，停止液體輸送微型鼓風(fēng)機(jī)，從而使PCR溶液可以保留在其它微通道中一定時(shí)間段。

將分別用于淋病奈瑟菌、沙眼衣原體和β肌動(dòng)蛋白基因的目的DNA的長(zhǎng)度、以及各引物和熒光探針的Tm值進(jìn)行統(tǒng)一，從而避免造成擴(kuò)增效率的差異。

對(duì)于淋病奈瑟菌、沙眼衣原體和β肌動(dòng)蛋白基因所用的熒光探針，使用Texas red標(biāo)記、Cy5標(biāo)記和FAM標(biāo)記的探針，PCR溶液中各探針的最終濃度調(diào)整為200nM。

PCR溶液中用于淋病奈瑟菌、沙眼衣原體和β肌動(dòng)蛋白基因的三種正向引物和反向引物各自的最終濃度分別調(diào)整為300nM。另一種試劑使用由Takara Bio公司生產(chǎn)的HS DNA聚合酶，其最終濃度為0.2U/μL，包含在聚合酶試劑盒中的FAST Buffer I和dNTP Mixture根據(jù)說(shuō)明書(shū)中指定的濃度進(jìn)行混合以形成PCR用預(yù)混合物。

制備分別含有各目的DNA序列的合成質(zhì)粒(synthetic plasmids)，作為淋病奈瑟菌、沙眼衣原體和β肌動(dòng)蛋白的模板DNA。陽(yáng)性對(duì)照中各質(zhì)粒的濃度為4ng/μL。而NTC中使用無(wú)菌水作為替代進(jìn)行混合。如此，進(jìn)行高速實(shí)時(shí)PCR。熱循環(huán)條件為：在96℃下加熱20秒進(jìn)行熱啟動(dòng)之后，再在96℃下加熱3秒，然后在60℃加熱8秒，如此重復(fù)循環(huán)該過(guò)程45次。在此條件下，45次循環(huán)所用的時(shí)間為9分鐘40秒。

圖6示出了針對(duì)淋病奈瑟菌、沙眼衣原體和β肌動(dòng)蛋白基因使用高速實(shí)時(shí)PCR的多重PCR結(jié)果。由于多色熒光檢測(cè)器對(duì)于三種熒光染料的靈敏度不同，所顯示的為通過(guò)動(dòng)態(tài)范圍校正得到的結(jié)果。在圖6中，三條粗線示出了當(dāng)包括所有模板DNA時(shí)三種熒光的熒光強(qiáng)度的變化。相比于NTC中的熒光信號(hào)(由細(xì)線表示)，得到了清晰的增強(qiáng)并且實(shí)現(xiàn)了從同一樣品中進(jìn)行的多項(xiàng)目同時(shí)測(cè)量。

在本實(shí)例中，同時(shí)測(cè)量三種熒光強(qiáng)度，用以檢測(cè)對(duì)應(yīng)于各個(gè)熒光波長(zhǎng)的目的基因的擴(kuò)增。當(dāng)通過(guò)施加壓力從一個(gè)蛇形微通道輸送來(lái)的PCR溶液已經(jīng)通過(guò)檢測(cè)點(diǎn)后，立即停止液體輸送微型鼓風(fēng)機(jī)并進(jìn)行溶液通過(guò)的檢測(cè)，不需要使用所有的熒光檢測(cè)器，甚至使用一種波長(zhǎng)的光來(lái)檢測(cè)信號(hào)，該檢測(cè)也是可行的。

實(shí)例4：一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR

在稱之為一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR方法的技術(shù)中，使用單一反應(yīng)溶液方便地進(jìn)行從RNA進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實(shí)時(shí)PCR方法，該單一反應(yīng)溶液是通過(guò)將逆轉(zhuǎn)錄酶和PCR溶液進(jìn)行預(yù)先混合制備得到的。該方法已用于檢測(cè)RNA病毒，如流感病毒和諾如病毒。在一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR方法中，將一般RT-PCR方法中的兩階段步驟組合成一個(gè)步驟，從而大大簡(jiǎn)化了操作。然而，這種方法問(wèn)題在于，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄酶和實(shí)時(shí)PCR方法的DNA聚合酶相互干擾，從而導(dǎo)致PCR效率較差。然而，通過(guò)高速溫度控制將溫度快速轉(zhuǎn)移至逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的活性所需的最佳溫度，可以使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實(shí)時(shí)PCR方法有效地進(jìn)行，從而完成高效的一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR方法。利用本發(fā)明的高速實(shí)時(shí)PCR用PCR芯片和裝置，對(duì)采用一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR方法進(jìn)行的諾如病毒G1基因和G2基因的定量進(jìn)行了確查。

作為含有目的G1基因或G2基因序列的RNA，使用包括在市售TaKaRa qPCR諾如病毒(GI/GII)分型試劑盒(Typing Kit)中的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品、或合成DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA。RNA的稀釋液系列使用RNase-free無(wú)菌水制備進(jìn)行制備。

使用在日本國(guó)家傳染病研究所傳染病監(jiān)空中心提供的諾如病毒的檢測(cè)方法中公開(kāi)的序列作為引物和探針序列。對(duì)于諾如病毒G1基因，其正向引物序列為COG-1F的5’-CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA-3’(序列號(hào)：10)；探針序列為RING1-TP(a)的5’-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-3’(序列號(hào)：11)和RING1-TP(b)的5’-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-3’(序列號(hào)：12)；以及反向引物序列為5’-CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C-3’(序列號(hào)：13)。對(duì)于諾如病毒G2基因，其正向引物序列為COG-2F的5’-CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG-3’(序列號(hào)：14)；探針序列為RING2AL_TP的5’-TGG GAG GGS GAT CGC RAT CT-3’(序列號(hào)：15)；以及反向引物序列為COG-2R的5’-TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA-3’(序列號(hào):16)。

G1基因和G2基因的熒光探針使用FAM標(biāo)記的探針。PCR溶液中各探針的最終濃度調(diào)整為200nM。

PCR溶液中G1基因或G2基因的正向引物和反向引物的最終濃度分別調(diào)整為300nM。對(duì)于其它試劑，使用Takara Bio公司的逆轉(zhuǎn)錄酶或Life Technologies公司的逆轉(zhuǎn)錄酶，其最終濃度為5U/μL；使用的RNase抑制劑的最終濃度為1U/μL；使用的HS DNA聚合酶的最終濃度為0.2U/μL。包含在產(chǎn)品包中的FAST Buffer I和dNTP Mixture以說(shuō)明書(shū)中指定的濃度進(jìn)行混合，并用作一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR的預(yù)混合物。

熱循環(huán)條件設(shè)置如下。當(dāng)使用Takara Bio公司的逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)42℃下進(jìn)行10秒。當(dāng)使用Life Technologies公司的逆轉(zhuǎn)錄酶時(shí)，熱循環(huán)條件為在55℃下進(jìn)行10秒。這些逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在位于高速實(shí)時(shí)PCR用PCR芯片的溫度較低的加熱器上的蛇形微通道中進(jìn)行。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后，將該溫度較低的加熱器的溫度升至56℃并進(jìn)行液體的連續(xù)輸送，在此條件下的工藝步驟包括：在96℃下加熱10秒用以進(jìn)行熱啟動(dòng)，然后再在96℃下加熱3秒，之后在56℃下加熱8秒，如此重復(fù)循環(huán)45次。在此條件下，一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR的45次循環(huán)所需的時(shí)間為10分鐘20秒以下。

高速一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR中的每次循環(huán)的熒光強(qiáng)度如圖7所示。當(dāng)諾如病毒G1基因和G2基因的初始濃度相同時(shí)，得到不依賴于逆轉(zhuǎn)錄酶的類型的類似S形曲線，對(duì)于諾如病毒G1基因和G2基因，熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)和上升時(shí)的循環(huán)次數(shù)是一樣的。

其次，高速一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR是通過(guò)改變諾如病毒G1基因和G2基因的RNA的初始濃度而進(jìn)行的。如圖8所示，熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)和上升時(shí)的循環(huán)次數(shù)依賴于諾如病毒G1基因的初始濃度而不同。對(duì)熒光強(qiáng)度的迅速增強(qiáng)和上升時(shí)的循環(huán)次數(shù)的觀察是以RNA的初始濃度從最高到最低的順序進(jìn)行的。因此，RNA的初始濃度一般可通過(guò)Ct值來(lái)定量，其中Ct值為熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)和上升時(shí)的循環(huán)次數(shù)。

然而，如圖8所示的諾如病毒G1基因的擴(kuò)增曲線證實(shí)了：基線為一個(gè)向上傾斜的曲線，使得熒光強(qiáng)度隨著熱循環(huán)而緩慢增強(qiáng)，然后從一定次數(shù)的循環(huán)之后熒光強(qiáng)度迅速增加。因此，難以通過(guò)常用方法(其中將一定水平的熒光強(qiáng)度定義為閾值，熒光強(qiáng)度高于該閾值時(shí)的循環(huán)次數(shù)定義為Ct值)來(lái)準(zhǔn)確估計(jì)Ct值。

因此，為了甚至在基線不是恒定值時(shí)(即基線成比例增加)檢測(cè)一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR過(guò)程中的Ct值，從由各熱循環(huán)次數(shù)確定的熒光強(qiáng)度矩陣(擴(kuò)增曲線的二維數(shù)組)來(lái)推導(dǎo)Ct值。

為了檢測(cè)在擴(kuò)增曲線的二維陣列中相對(duì)于Ct值以下的斜率迅速上升的斜率，可以進(jìn)行以下操作。當(dāng)熒光強(qiáng)度發(fā)生較大變化時(shí)，如有必要，可求得移動(dòng)平均。這樣做時(shí)，是對(duì)每次熱循環(huán)進(jìn)行第一正向微分。在得到的斜率的新的二維陣列中，對(duì)初始階段的斜率(例如，5-15次循環(huán)，或剛好在每次循環(huán)之前的5-15次循環(huán))的根均方(可選擇性地為加權(quán)平均)和初始階段后的斜率進(jìn)行比較。當(dāng)觀察到循環(huán)次數(shù)的顯著增加(例如，5倍以上，也可能選擇性地為2倍以上)時(shí)，由此推斷，在該循環(huán)次數(shù)Ct中，熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)和上升。

圖9示出了由得到的Ct值對(duì)應(yīng)諾如病毒G1基因和G2基因的初始濃度繪制的校準(zhǔn)曲線。相對(duì)于諾如病毒G1基因和G2基因的每個(gè)RNA濃度，獲得了良好的線性度。當(dāng)熒光強(qiáng)度迅速上升時(shí)，甚至在一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR中也能快速確定Ct值?？梢詮腃t值計(jì)算初始RNA濃度。

本發(fā)明的特征為，系統(tǒng)中全部PCR溶液通過(guò)微通道并使得每次熱循環(huán)中溶液通過(guò)熒光檢測(cè)點(diǎn)。因此，即使由于缺乏時(shí)間而不能將熒光染料均勻分散在PCR溶液中(由較多的熱循環(huán)產(chǎn)生)而致使實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)生的熒光染料在PCR溶液分散不均而形成的熒光染料濃度狀態(tài)，通過(guò)一個(gè)熒光檢測(cè)器也可檢測(cè)所有的熒光染料，然后對(duì)此積算可用來(lái)對(duì)每次循環(huán)的熒光量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

因此，如圖9所示，在校準(zhǔn)范圍內(nèi)，RNA濃度的測(cè)量中的各個(gè)Ct值的誤差線是非常小的，并且證實(shí)了具有良好的再現(xiàn)性的精確定量是可行的。

工業(yè)實(shí)用性

根據(jù)本發(fā)明的裝置是便攜式的，并且允許在臨床情景或在傳染病的發(fā)生現(xiàn)場(chǎng)以較低的成本進(jìn)行高速實(shí)時(shí)PCR。更具體地說(shuō)，可以通過(guò)快速確認(rèn)治療效果和盡早地檢出家畜和家禽中的傳染病來(lái)預(yù)防感染的傳播。

SEQUENCE LISTING

<110> 國(guó)立研究開(kāi)發(fā)法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所

<120> 核酸擴(kuò)增裝置、核酸擴(kuò)增方法以及核酸擴(kuò)增用芯片

<130> P15-070

<150> JP 2014-140758

<151> 2014-07-08

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 1

gtgtgatatc tacccgcttc gc 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 2

agaacggttt gtggttaatc agga 24

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 3

tcggcatccg gtcagtggca gt 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 4

gtttgatcct ggctca 16

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 5

cgggtgagta atgtctgg 18

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<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

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ctttggtctt gcgacg 16

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<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 7

gcatggctgc atcag 15

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<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 8

ctgacttaac aaaccgc 17

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 9

taccagggta tctaatcc 18

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<212> DNA

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<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

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agatcgcggt ctcctgtcca 20

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<212> DNA

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<400> 16

tcgacgccat cttcattcac a 21