采用真菌過氧化酶的脂族烴的區(qū)域選擇性氧化的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及在取代或未取代的、直鏈或支鏈的脂族烴的兩端的2或3位進(jìn)行羥基化的酶法。
【專利說明】采用真菌過氧化酶的脂族烴的區(qū)域選擇性氧化
[0001]序列表的參省
[0002]本申請包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表。該計(jì)算機(jī)可讀形式并入本文以供參考。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及具有過氧化酶(peroxygenase)活性的多肽在脂族烴的位點(diǎn)特異性氧化中的用途。
【背景技術(shù)】
[0004]發(fā)現(xiàn)來自傘菌類擔(dān)子菌菌株茶樹燕(Agrocybe aegerita)(菌株TM-A1)的表示為AaP的過氧化酶使芳基醇和醛氧化。通過數(shù)個(gè)步驟的離子色譜和SDS-PAGE從茶樹菇TM A1中純化AaP過氧化酶，在2D電泳之后確定分子量和N端14氨基酸序列，但未分離編碼基因(Ullrich 等人，2004，Appl.Env.Microbiol.70 (8):4575-4581)。
[0005]W02006/034702公開使用茶樹菇TM A1的AaP過氧化酶對未活化的烴諸如萘、甲苯和環(huán)己烷進(jìn)行酶羥化的方法。這也描述于U1 lrich和Hofrichter，2005, FEBSLetters579:6247-6250。
[0006]W02008/119780公開來自茶樹燕、灰蓋鬼傘(Coprinopsis cinerea)、雙色臘蘑(Laccaria bicolor)和輔毛鬼傘(Coprinus radians)的八種不同的過氧化酶；在本申請中還示為 SEQ ID N0s:l-8。
[0007]DE10332065A1公開通過使用茶樹菇TM A1的AaP過氧化酶由醇通過中間形成醛而酶法制備酸的方法。`
[0008]報(bào)道了迅速且選擇性分光光度法直接檢測經(jīng)AaP過氧化酶的芳族羥化的方法(Kluge 等人，2007, Appl Microbiol Biotechnol75:1473-1478)。
[0009]眾所周知將氧官能團(tuán)直接區(qū)域選擇性引入有機(jī)分子(氧合)在化學(xué)合成中構(gòu)成問題。特別難以催化脂族烴的選擇性羥化。產(chǎn)物可在各種不同合成中用作重要的中間體。
[0010]具體而言，烷烴的化學(xué)羥化相對較復(fù)雜，需要強(qiáng)力的/毒性的化學(xué)品/催化劑，并導(dǎo)致一系列不期望的副產(chǎn)物。
[0011]已知一種胞內(nèi)酶甲烷單加氧酶(ΜΜ0，EC14.13.25)，使一些烴的末端碳氧合/羥化。ΜΜ0酶由數(shù)個(gè)蛋白質(zhì)組分組成，并由甲基營養(yǎng)菌(例如莢膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus))形成；其需要復(fù)合電子供體諸如NADH或NADPH、輔助蛋白(黃素還原酶、調(diào)節(jié)蛋白)和分子氧(02)。ΜΜ0的天然底物是甲烷，其被氧化為甲醇。作為特別非特異性的生物催化劑，除甲烷之外，ΜΜ0還氧合/羥化一系列進(jìn)一步的底物諸如正烷烴及其衍生物、環(huán)烷烴、芳族化合物、一氧化碳和雜環(huán)化合物。該酶在生物技術(shù)中的應(yīng)用目前尚不可能，因?yàn)槠湎翊蟛糠职麅?nèi)酶一樣難以分離，其具有低穩(wěn)定性，且所需的共底物相對昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]在第一方面，本發(fā)明的發(fā)明人提供在取代或未取代的、直鏈或支鏈的脂族烴的至少兩端的第二或第三碳處引入羥基或橋氧(0X0)基的酶法，該脂族烴具有至少5個(gè)碳并具有連接于所述第二或第三碳的氫，該方法包括使脂族烴與過氧化氫和具有過氧化酶活性的多肽接觸，其中多肽包括:
[0013]a)與 SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28
或29具有至少30%同一性的氨基酸序列；以及
[0014]b)由一種或多種以下基序所表示的氨基酸序列:
[0015]基序I: [FL] XX [YF] S [AN] X [FHY] G [GN] GX [YF] N (SEQ ID NO: 9 );
[0016]基序II:G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R (SEQ ID NO: 10);
[0017]基序II1:RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；
[0018]基序IV:S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL] (SEQ ID NO: 12)；
[0019]基序V:P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；
[0020]基序V1:[TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)；
[0021]基序VI1:E[HG]DXSX[ST]RXD(SEQ ID NO: 15)。
[0022]在其它方面，本發(fā)明提供具有過氧化酶活性的多肽用于從衣物中去除含脂質(zhì)的污跡的用途；以及用于從衣物中減少不愉快氣味的用途。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1示出用灰蓋鬼傘過氧化酶(0.5mM H2O2)孵育的十四烷的色譜圖；來自實(shí)施例3。
[0024]圖2示出用茶樹菇過氧化酶(2.5mM H2O2)孵育的十四烷的色譜圖；來自實(shí)施例3。
[0025]圖3示出用灰蓋鬼傘過氧化酶(0.5mM H2O2)孵育的十四醇的色譜圖；來自實(shí)施例4。
[0026]圖4示出用茶樹菇過氧化酶(2.5mM H2O2)孵育的十四醇的色譜圖；來自實(shí)施例4。
【具體實(shí)施方式】
[0027]
[0028]過氧化酶活性:術(shù)語“過氧化酶活性”根據(jù)ECl.11.2.1在本文中定義為“非特異性過氧化酶”。這是血紅素硫醇鹽蛋白質(zhì)(heme-thiolate protein)。該類型的酶包括由傘菌類擔(dān)子菌分泌的糖蛋白。它們催化氧原子從H2O2插入廣泛種類的底物，諸如萘、4-硝基苯并二氧雜環(huán)戍烯(4-nitrobenzodioxole);和燒烴諸如丙烷、己燒和環(huán)己燒。它們對于氯幾乎無或無活性。
[0029]為了本發(fā)明的目的，根據(jù)Kluge等人(2007，Appl MicrobiolBiotechnol75:1473-1478)描述的分光光度步驟確定過氧化酶活性。
[0030]分離的多肽:本文使用的術(shù)語“分離的多肽”是指從來源分離的多肽。在優(yōu)選的方面，通過SDS-PAGE確定，多肽為至少1%純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純。
[0031]基本上純的多肽:術(shù)語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制品，其含有按重量計(jì)至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組相關(guān)的(associated)其它多肽材料。因此，優(yōu)選基本上純的多肽是按存在于制品中的全部多肽材料的重量計(jì)至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即，該多肽制品基本上不含與其天然或重組相關(guān)的其它多肽材料。例如，這能夠通過眾所周知的重組方法或通過經(jīng)典的純化方法制備多肽來實(shí)現(xiàn)。
[0032]成熟多肽:術(shù)語“成熟多肽”在本文中定義為具有過氧化酶活性的多肽，該多肽處于其在翻譯和任何諸如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等的翻譯后修飾之后的最終形式。在優(yōu)選方面，成熟多肽具有基于N端肽測序數(shù)據(jù)(U1 Irich等人，2004, Appl.Env.Microbiol.70(8):: 4575-4581)(其闡明AaP過氧化酶的成熟蛋白質(zhì)的開始)的SEQ ID NO:1的位置I至330中所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選方面，成熟多肽具有SEQ ID NO:2中位置I至328中所示的氨基酸序列。
[0033]同一性:兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)“同一性”描述。
[0034]為了本發(fā)明的目的，使用如 EMBOSS 軟件包(EMB0SS:The European MolecularBiology Open Software Suite, Rice 等人，2000，Trendsin Genetics 16:276-277 ；http://emboss, org)(優(yōu)選3.0.0版或更新版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970, J Mol.Biol.48:443-453)來確定兩個(gè)氛基酸序列之間的同一'I"生程度。使用的任選參數(shù)為缺口開放罰分(gap open penalty) 10、缺口延伸罰分(gapextension penalty)0.5、和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的 EMBOSS 版)取代矩陣。標(biāo)記為“最長同一'丨生(longest identity)”的Needle的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)被用作百分比同一性，并如下計(jì)算:
[0035](相同的殘基X100) / (比對長度-比對中缺口的總數(shù))。
[0036]為了本發(fā)明的目的，使用如 EMBOSS 程序包(EMB0SS:The European MolecularBiology Open Software Suite, Rice等人，2000,見上文；http://emboss.0rg)(優(yōu)選3.0.0或更新版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970,見上文)來確定兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度。使用的任選參數(shù)是缺口產(chǎn)生罰分10、缺口延伸罰分0.5、和EDNAFULL (NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。標(biāo)記為“最長同一'丨生”的Needle的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)被用作百分比同一'丨生,并如下計(jì)算:
[0037](相同的脫氧核糖核苷酸X100) / (比對長度-比對中缺口的總數(shù))。
[0038]修飾:術(shù)語“修飾”在本文中意指由SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29或其同源序列的成熟多肽組成的多肽的任何化學(xué)修飾，以及編碼此種多肽的DNA的遺傳操作。修飾可為取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))氨基酸，以及替換一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))氨基酸側(cè)鏈。
[0039]具有過氧化酶活性的多肽(過氧化酶)
[0040]本發(fā)明涉及具有過氧化酶活性的分離多肽的用途，該多肽優(yōu)選為重組產(chǎn)生的，其包括與 SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28 或 29 的多肽，優(yōu)選與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的多肽，具有至少30%同一性，優(yōu)選至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、或 98% 同一性的氨基酸序列。
[0041]在優(yōu)選實(shí)施方式中，多肽包括由一種或多種下述基序表示的氨基酸序列，優(yōu)選包括兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或六種下述基序:
[0042]基序I: [FL] XX [YF] S [AN] X [FHY] G [GN] GX [YF] N (SEQ ID NO: 9 );
[0043]基序I1:G [GN] GX [YF] NXX [VA] AX [EH] [LF] R (SEQ ID NO: 10)；
[0044]基序II1:RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；
[0045]基序IV:S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL] (SEQ ID NO: 12)；
[0046]基序V:P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；
[0047]基序V1:[TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)；
[0048]基序VI1:E[HG]DXSX[ST]RXD(SEQ ID NO: 15)。
[0049]在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，過氧化酶包括由基序E[HG]DXSX[ST]RXD表示的氨基酸序列。
[0050]在另一個(gè)實(shí)施方式中，多肽包括如下氨基酸序列，該氨基酸序列具有SEQ IDN0:l、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29，優(yōu)選SEQ ID NO:2或SEQ ID N0:4的成熟多肽的一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入。
[0051]在又一個(gè)實(shí)施方式中，第一方面的多肽包括以下或由以下組成:SEQ ID N0:l、2、
3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28 或 29 的氨基酸序列，優(yōu)選 SEQID N0:2或SEQ ID N0:4的氨基酸序列，或其具有過氧化酶活性的片段；優(yōu)選地，多肽包括以下或由以下組成:SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的成熟多肽，優(yōu)選SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽。
[0052]優(yōu)選地，氨基酸變化為性質(zhì)小的變化，即不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守性氨基酸取代或插入；小缺失，通常為1到約30個(gè)氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，諸如氨基末端甲硫氨酸殘基；多達(dá)約20-25個(gè)殘基的小連接肽；或者通過改變凈電荷或其它功能而促進(jìn)純化的小延伸，諸如多組氨酸束(polyhistidine tract)、抗原表位、或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0053]保守性取代的實(shí)例是堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、和甲硫氨酸)各組內(nèi)的取代。通常不改變比活的氨基酸取代在本領(lǐng)域是已知的，并且例如由 H.Neurath 和 R.L.Hill, 1979，于 The Proteins, Academic Press, New York 中描述。最常出現(xiàn)的交換是 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。
[0054]除了 20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(諸如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸、和α -甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸、和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后經(jīng)過修飾，且/或在其側(cè)鏈具有不同于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是市售的，且包括哌唳酸(pipecolic acid)、噻唑燒羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脫氫脯氨酸、3_和4_甲基脯氨酸、和3，3_ 二
甲基脯氨酸。[0055]或者，氨基酸改變有如下性質(zhì)，即多肽的理化性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可以提高多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，和改變最適PH等。
[0056]可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的步驟，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells, 1989，Science244:1081-1085)來識(shí)別親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，在分子中的每個(gè)殘基處引入單一丙氨酸突變，且測試所得突變分子的生物活性(即，過氧化酶活性)以識(shí)別對于該分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性位點(diǎn)或其他生物相互作用同樣可以通過結(jié)構(gòu)的物理分析確定，如通過例如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo)記等技術(shù)，結(jié)合推定的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來確定。例如，參見de Vos等人，1992，Science255:306-312 ;Smith等人，1992, J.Mol.Biol.224:899-904 ;Wlodaver 等人，1992, FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的同一性還能夠從與多肽的同一性分析來推斷，該多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。
[0057]可使用已知的誘變、重組、和/或改組(shuffling)方法，后接相關(guān)的篩選步驟，諸如 Reidhaar-Olson 和 Sauer, 1988，Science241:53-57 ；Bowie 和 Sauer, 1989，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2152-2156 ；W095/17413 ;或 W095/22625 所公開的那些，來制作和測試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入?？梢允褂玫钠渌椒òㄒ子诔鲥e(cuò)的 PCR、噬菌體展示(例如，Lowman 等人，1991, Biochem.30:10832-10837 ；U.S.專利第5，223，409 號(hào)；W092/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire 等人，1986，Gene46:145 ；Ner等人，1988，DNA7:127)。
[0058]誘變/改組方法可以與高通量、自動(dòng)篩選方法結(jié)合，以檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等人，1999, Nature Biotechnologyl7:893-896)。編碼活性多肽的誘變的DNA分子能夠從宿主細(xì)胞回收，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測序。這些方法允許快速確定感興趣的多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。
[0059]SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29，
優(yōu)選SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選I。
[0060]另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式涉及本發(fā)明第一方面的具有過氧化酶活性的多肽，其中成熟多肽是SEQ ID NO:1的氨基酸I至330。
[0061]又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式涉及本發(fā)明第一方面的具有過氧化酶活性的多肽，其中成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸I至328。
[0062]又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式涉及本發(fā)明第一方面的具有過氧化酶活性的多肽，其中成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸I至344。
[0063]又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式涉及本發(fā)明第一方面的具有過氧化酶活性的多肽，其中成熟多肽是SEQ ID NO:23的氨基酸I至261。
[0064]過氧化氫
[0065]過氧化酶所需的過氧化氫可提供為過氧化氫的水溶液，或用于原位產(chǎn)生過氧化氫的過氧化氫前體。任何在溶解時(shí)釋放可由過氧化酶使用的過氧化物的固體實(shí)體均可用作過氧化氫的來源。當(dāng)溶解于水或合適的水類介質(zhì)時(shí)產(chǎn)生過氧化氫的化合物包括但不限于金屬過氧化物、過碳酸鹽、過硫酸鹽、過磷酸鹽、過氧酸、烷基過氧化物、?；^氧化物、過氧酯(peroxyesters )、尿素過氧化物、過硼酸鹽和過氧羧酸或它們的鹽。
[0066]過氧化氫的另一種來源是生成過氧化氫的酶體系，諸如氧化酶和氧化酶的底物。氧化酶和底物的組合的實(shí)例包括但不限于:氨基酸氧化酶(參見例如US6，248，575)和合適的氨基酸，葡糖氧化酶(參見例如W095/29996)和葡萄糖，乳酸氧化酶和乳酸鹽，半乳糖氧化酶(參見例如W000/50606)和半乳糖，以及醛糖氧化酶(參見例如W099/31990)和合適的醛糖。
[0067]通過研究EC1.1.3._、EC1.2.3._、EC1.4.3._、和 EC1.5.3._ 或類似的類型(根據(jù)國際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì))，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地識(shí)別此類氧化酶和底物的組合的其他實(shí)例。
[0068]可在本發(fā)明的方法開始時(shí)或過程中添加過氧化氫或過氧化氫源，例如作為過氧化氫的一次或多次單獨(dú)添加，或連續(xù)地作為補(bǔ)料分批添加。過氧化氫的典型量相應(yīng)于0.001mM至25mM的水平，優(yōu)選0.005mM至5mM的水平，且特別是0.01至ImM的水平的過氧化氫。過氧化氫還可以以相應(yīng)于0.1mM至25mM的水平，優(yōu)選0.5mM至15mM的水平，更優(yōu)選ImM至10mM的水平,且最優(yōu)選2mM至8mM的水平的過氧化氫量使用。
[0069]表面活性劑
[0070]本發(fā)明的方法可包括施用表面活性劑(例如，作為洗滌劑配制物的一部分或作為濕潤劑)。適合于施用的表面活性劑可以是非離子的(包括半極性的)、陰離子的、陽離子和/或兩性離子的；優(yōu)選表面活性劑是陰離子的(諸如直鏈烷基苯磺酸酯、α-烯烴磺酸酯、烷基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯 )、醇乙氧基硫酸酯、仲烷磺酸酯、α -磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂)或非離子的(諸如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺(“葡糖酰胺”)的Ν-酰基Ν-烷基衍生物)，或其混合物。
[0071]當(dāng)包括在本發(fā)明方法中時(shí)，表面活性劑的濃度通常為按重量計(jì)約0.01%至約10%，優(yōu)選約0.05%至約5%，且更優(yōu)選約0.1%至約1%。
[0072]脂族烴
[0073]在本發(fā)明方法中氧化的烴是具有至少5個(gè)碳的鏈的脂族烴。優(yōu)選地，脂族烴是烷或烯；更優(yōu)選地，脂族烴是烷，諸如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷或十六烷、或其異構(gòu)體。甚至更優(yōu)選地，脂族烴是十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷或十六烷、或其異構(gòu)體。
[0074]在實(shí)施方式中，脂族烴不是正己烷或正癸烷。
[0075]脂族烴是直鏈或支鏈的，但非環(huán)化的，因?yàn)槲稽c(diǎn)特異性氧化對環(huán)烴是不可能的。支鏈烴相應(yīng)于直鏈烴的異構(gòu)體。
[0076]脂族烴是取代或未取代的。優(yōu)選地，脂族烴是未取代的，諸如非活化的烴。
[0077]當(dāng)脂族烴是取代的時(shí)(連接有官能團(tuán))，優(yōu)選的取代基為鹵素、羥基、羧基、氨基、硝基、氰基、巰基、磺酰基、甲?；?、乙酰基、甲氧基、乙氧基、苯基、芐基、二甲苯基、氨基甲?；桶被酋；桓鼉?yōu)選的取代基為氯、羥基、羧基和磺?；?；且最優(yōu)選的取代基為氯和羧基。
[0078]脂族烴可被多至10個(gè)取代基，多至8個(gè)取代基，多至6個(gè)取代基，多至4個(gè)取代基，多至2個(gè)取代或多至一個(gè)取代基取代。
[0079]方法和用途
[0080]本發(fā)明提供使用過氧化酶和過氧化氫在脂族烴至少兩端的第二或第三碳進(jìn)行羥基和/或橋氧(酮(keto))基的位點(diǎn)特異性引入的方法。
[0081]脂族烴必須包括至少5個(gè)碳的鏈。第二和第三碳通過從脂族烴的任一端對碳原子計(jì)數(shù)而確定。
[0082]脂族烴必須具有至少一個(gè)連接于碳的氫，其通過連接羥基被羥化；且當(dāng)引入橋氧基時(shí)，具有至少兩個(gè)連接于碳的氫。在優(yōu)選實(shí)施方式中，第二或第三碳在與過氧化酶接觸前是未取代的。 [0083]根據(jù)本發(fā)明的方法，在脂族烴的(至少)兩端彼此獨(dú)立地引入羥基和/或橋氧基。因此，可以在一端引入羥基，同時(shí)在另一端(兩者中的另一個(gè)端)引入橋氧基，且反之亦然。不可以在脂族烴的同一端引入兩個(gè)羥基，或兩個(gè)橋氧基，或一個(gè)羥基和一個(gè)橋氧基。在實(shí)施例1中示出一些組合的實(shí)例。
[0084]在本發(fā)明上下文中，“氧化”意指羥基和/或橋氧基的引入。
[0085]相應(yīng)地，在第一方面，本發(fā)明提供在取代或未取代的、直鏈或支鏈脂族烴的(至少)兩端的第二或第三碳處引入羥基和/或橋氧(酮)基的方法，該脂族烴具有至少5個(gè)碳并具有至少一個(gè)連接于所述第二或第三碳的氫，該方法包括使脂族烴與過氧化氫和具有過氧化酶活性的多肽接觸，其中多肽包括:
[0086]a)與 SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29，優(yōu)選SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4具有至少30%同一性的氨基酸序列；以及
[0087]b)由一種或多種以下基序所表示的氨基酸序列:
[0088]基序I: [FL] XX [YF] S [AN] X [FHY] G [GN] GX [YF] N (SEQ ID NO: 9 );
[0089]基序I1:G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R (SEQ ID NO: 10)；
[0090]基序II1:RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；
[0091]基序IV:S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL] (SEQ ID NO: 12)；
[0092]基序V:P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；
[0093]基序V1:[TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)；
[0094]基序VI1:E[HG]DXSX[ST]RXD(SEQ ID NO: 15)；
[0095]優(yōu)選地，基序VI1:E[HG]DXSX[ST]RXD。
[0096]在實(shí)施方式中，脂族烴不是正己烷或正癸烷。
[0097]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，脂族烴通過引入兩個(gè)羥基氧化為(轉(zhuǎn)化為)二醇。更優(yōu)選地，該兩個(gè)羥基位于直鏈脂族烴的各端。
[0098]本發(fā)明的方法可用于多種目的，如大量化學(xué)合成(生物催化)，增加脂族烴的水溶性，生物處理(bioremediation),和食品特征的改性。
[0099]本發(fā)明的方法還可用于多種工業(yè)工藝，其中所述氧化反應(yīng)是有益的。此種用途的實(shí)例是紙漿和紙產(chǎn)品的制造，其中存在于木質(zhì)(樹脂)中的烷和其他相關(guān)的脂族烴可導(dǎo)致紙漿和紙制造工藝中的沉積問題。這些疏水化合物是紙漿和紙制造工藝內(nèi)所謂樹脂沉積物(pitch d印osit)的前體。樹脂沉積導(dǎo)致低品質(zhì)紙漿，并可導(dǎo)致紙漿廠運(yùn)轉(zhuǎn)的停工。與具有高提取物含量的紙漿相關(guān)的特定問題包括流動(dòng)性問題、紙中的污點(diǎn)(spot)和孔洞、以及紙張破裂(sheet break)。經(jīng)過氧化酶處理可增加所述化合物的溶解性，從而減輕問題。
[0100]本發(fā)明的方法的又一用途是，例如，用于煉油廠或煉煤廠，其中過氧化酶催化的氧化可用于改變烴的溶解性、粘性和/或燃燒特征。具體而言，該處理可導(dǎo)致進(jìn)行該處理的烴的煙點(diǎn)、著火點(diǎn)(kindling point)、燃點(diǎn)(fire point)和沸點(diǎn)的變化。
[0101]在大量化學(xué)品、農(nóng)業(yè)化學(xué)品(包括殺蟲劑)、特種化學(xué)品和藥物的合成中，本發(fā)明的方法在將羥基選擇性引入底物，從而影響改性的化合物的溶解性方面顯然是重要的。此外，選擇性氧化為通過有機(jī)化學(xué)合成和化學(xué)酶合成領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行進(jìn)一步改性提供了位點(diǎn)。
[0102]將天然氣徹底加工以去除高級(jí)烷烴。此類高級(jí)烷烴的氧化可用于改善水溶性，并因此促進(jìn)通過洗滌天然氣流來去除高級(jí)烷烴?？稍诰谢蛟诰珶掃^程中進(jìn)行去除。
[0103]根據(jù)本發(fā)明，油廢料的氧化會(huì)顯著改善生物可降解性，并可應(yīng)用于涉及來自精煉廠的廢水處理和污染地面或污染水的生物處理方面。
[0104]可用具有過氧化酶活性的固定化的多肽(過氧化酶)進(jìn)行本發(fā)明的方法。
[0105]本發(fā)明的方法可在水性溶劑(反應(yīng)介質(zhì))、多種醇、醚、其他極性或非極性溶劑、或其混合物中進(jìn)行。通過研究用于本發(fā)明的方法的脂族烴的特征，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地識(shí)別溶劑的合適實(shí)例。通過提高或降低進(jìn)行氧化的壓力，可在反應(yīng)溫度將溶劑(反應(yīng)介質(zhì))和脂族烴保持在液相中。
[0106]根據(jù)本發(fā)明的方法可在0~90攝氏度，優(yōu)選5~80攝氏度,更優(yōu)選10~70攝氏度，甚至更優(yōu)選15~60攝氏度，最優(yōu)選20~50攝氏度，且特別是20~40攝氏度的溫度進(jìn)行。
[0107]本發(fā)明的方法可采用10秒至(至少)24小時(shí)，優(yōu)選1分鐘至(至少)12小時(shí)，更優(yōu)選5分鐘至(至少)6小時(shí)，最優(yōu)選5分鐘至(至少)3小時(shí)，且特別是5分鐘至(至少)1小時(shí)的處理時(shí)間。
[0108]通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的二醇(二羥基脂族烴)可用于制備聚氨酯。聚氨酯是由通過氨基甲酸酯(carbamate或urethane)鍵連接的有機(jī)單元的鏈組成的聚合物。通過在催化劑存在下使單體(具有至少兩個(gè)異氰酸酯官能官)與另一單體(具有至少兩個(gè)羥基)反應(yīng)，經(jīng)逐步生長聚合來形成聚氨酯聚合物。
[0109]在另一方面，本發(fā)明提供在取代或未取代的、直鏈或支鏈的脂族烴的第二或第三碳處引入橋氧(酮)基的方法，該脂族烴具有至少5個(gè)碳并具有至少兩個(gè)連接于所述第二或第三碳的氫，該方法包括使脂族烴與過氧化氫和具有過氧化酶活性的多肽接觸；其中多肽包括:
[0110]a)與 SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29，優(yōu)選SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4具有至少30%同一性的氨基酸序列；以及
[0111]b)由一種或多種以下基序所表示的氨基酸序列:
[0112]基序I: [FL] XX [YF] S [AN] X [FHY] G [GN] GX [YF] N (SEQ ID NO: 9 );
[0113]基序II:G [GN] GX [YF] NXX [VA] AX [EH] [LF] R (SEQ ID NO: 10)；
[0114]基序II1:RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；
[0115]基序IV:S[M]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL] (SEQ ID NO: 12)；
[0116]基序V:P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；[0117]基序V1:[TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)；
[0118]基序VI1:E[HG]DXSX[ST]RXD(SEQ ID NO: 15)；
[0119]優(yōu)選地，基序VI1:E[HG]DXSX[ST]RXD。
[0120]在實(shí)施方式中，脂族烴不是正己烷或正癸烷。
[0121]在又一方面，本發(fā)明還提供在直鏈或支鏈的脂族烴的末端碳處引入羥基或橋氧基的方法，該脂族烴具有至少5個(gè)碳，并且其被羧基取代，該方法包括使脂族烴與過氧化氫和具有過氧化酶活性的多肽接觸；其中多肽包括:
[0122]a)與 SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29，優(yōu)選SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4具有至少30%同一性的氨基酸序列；以及
[0123]b)由一種或多種以下基序所表示的氨基酸序列:
[0124]基序I: [FL] XX [YF] S [AN] X [FHY] G [GN] GX [YF] N (SEQ ID NO: 9 );
[0125]基序I1:G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)；
[0126]基序II1:RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；
[0127]基序IV:S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)；
[0128]基序V:P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；
[0129]基序V1:[TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)；
[0130]基序VI1:E[HG]DXSX[ST]RXD(SEQ ID NO: 15)；
[0131]優(yōu)選地，基序VI1:E[HG]DXSX[ST]RXD。
[0132]在實(shí)施方式中，被羧基取代的脂族烴是脂肪酸；優(yōu)選丁酸(酪酸)、戊酸(纈草酸)、己酸(羊油酸)、庚酸(葡萄花酸)、辛酸(羊脂酸)、壬酸(天竺葵酸)、癸酸(羊蠟酸)、十二酸(月桂酸)、十四酸(肉豆蘧酸)、十六酸(棕櫚酸)、十八酸(硬脂酸)、二十酸(花生酸)、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
[0133]在實(shí)施方式中，被羧基取代的脂族烴不是月桂酸或棕櫚酸。
[0134]在又一方面，本發(fā)明還提供將具有至少5個(gè)碳的直鏈或支鏈的脂族烴的伯醇改變(氧化)為相應(yīng)酸的方法，該方法包括使脂族烴的醇與過氧化氫和具有過氧化酶活性的多肽接觸；其中多肽包括:
[0135]a)與 SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29，優(yōu)選SEQ ID NO:2或SEQ IDN0:4具有至少30%同一性的氨基酸序列；和
[0136]b)由一種或多種以下基序所表示的氨基酸序列:
[0137]基序I: [FL] XX [YF] S [AN] X [FHY] G [GN] GX [YF] N (SEQ ID NO: 9 );
[0138]基序II:G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R (SEQ ID NO: 10)；
[0139]基序II1:RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；
[0140]基序IV:S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL] (SEQ ID NO: 12)；
[0141]基序V:P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；
[0142]基序V1:[TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)；
[0143]基序VI1:E[HG]DXSX[ST]RXD(SEQ ID NO: 15)；
[0144]優(yōu)選地，基序VI1:E[HG]DXSX[ST]RXD。
[0145]例如，戊醇可改變(氧化)為戊酸(纈草酸)，己醇可改變?yōu)榧核?羊油酸)，庚醇可改變?yōu)楦?葡萄花酸)，辛醇可改變?yōu)樾了?羊脂酸)，壬醇可改變?yōu)槿伤?天竺葵酸)，癸醇可改變?yōu)楣锼?羊蠟酸)，十二醇可改變?yōu)槭?月桂酸)，十四醇可改變?yōu)槭乃?肉豆蘧酸)，十六醇可改變?yōu)槭?棕櫚酸)，十八醇可改變?yōu)槭怂?硬脂酸)，且二十醇可改變?yōu)槎?花生酸)。
[0146]通過以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。
[0147]實(shí)施例
[0148]來自茶樹菇的過氧化酶氨基酸序列示為SEQ ID NO: 2 ;且來自灰蓋鬼傘的過氧化酶氨基酸序列示為SEQ ID N0:4。
[0149]實(shí)施例1
[0150]十二烷、十四烷和十六烷的酶促氧化
[0151]使用茶樹 菇的細(xì)胞外過氧化酶(異構(gòu)體(isoform) II，44kDa，SEQ ID NO:2)。酶制品通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳而均質(zhì)，且呈現(xiàn)1.75的A418/A28(i比。其比活是117單位.mg'其中1單位表示1 μ mol藜蘆基醇在2.5mM H202的存在下在23°C和pH7在1分鐘內(nèi)氧化為藜蘆醒(ε 3109300Μ_1.cnT1)。
[0152]三種烷:十二烷(C12)、十四烷(C14)和十六烷(C16)得自Sigma-Aldrich。以上模型底物(ImM)與茶樹菇過氧化酶(1U)的5mL反應(yīng)在2.5mM H202的存在下在25°C于50mM磷酸鈉緩沖液(PH7)中進(jìn)行2小時(shí)。底物預(yù)先溶于丙酮且加入到緩沖液中(反應(yīng)中的丙酮濃度為15%)。在對照實(shí)驗(yàn)中，底物在相同條件下處理而沒有酶。在酶促反應(yīng)之后，立即在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中去除水，且用氯仿回收產(chǎn)物，在氮下干燥，且再溶解于氯仿用于GC-MS分析。使用吡啶存在下的雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(Supelco)來制備三甲基硅烷基衍生物。
[0153]用Varian3800色譜儀進(jìn)行GC-MS分析，該Varian3800色譜儀與離子講檢測器(Varian4000)連接且使用來自J&W Scientific的中等長度熔融石英DB-5HT毛細(xì)管柱(12mX0.25mm內(nèi)徑，0.1 μ m膜厚)，使得能夠同時(shí)洗脫不同化合物類型。柱溫箱(oven)從120°C (1分鐘)以10°C每分鐘加熱至380°C，且保持5分鐘。需要時(shí)，使用從50°C至110°C(以30°C每分鐘)然后至320°C (以6°C每分鐘)的其他溫度程序。在所有GC-MS分析中，傳輸管線保持在300°C，注射器從120°C (0.1分鐘)以200°C每分鐘程控至380°C且保持直到分析結(jié)束，且使用氦以2ml每分鐘的速率作為載氣。
[0154]化合物通過碎片質(zhì)譜法且通過將它們的質(zhì)譜與Wiley和NIST庫和標(biāo)準(zhǔn)物的那些質(zhì)譜進(jìn)行對比來識(shí)別，且使用相同或相似化合物的響應(yīng)因子從總離子峰面積中得到定量。當(dāng)兩個(gè)峰部分重疊時(shí)，使用(基礎(chǔ)或其他特定離子的)單離子色譜圖來估算化合物豐度。
[0155]MM.[0156]測試三種飽和烷(十二烷、十四烷和十六烷)作為茶樹菇過氧化酶底物。
[0157]表1過氧化酶反應(yīng)的GC-MS峰面積
[0158]
【權(quán)利要求】
1.一種在取代或未取代的、直鏈或支鏈的脂族烴的至少兩端的第二或第三碳處引入羥基或酮基的方法，所述脂族烴具有至少5個(gè)碳并具有至少一個(gè)連接于所述第二或第三碳的氫，所述方法包括使所述脂族烴與過氧化氫和具有過氧化酶活性的多肽接觸，其中所述多肽包括:a)與SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28 或 29具有至少30%同一性的氨基酸序列；以及b)由一種或多種以下基序所表示的氨基酸序列:基序 1:[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N (SEQ ID NO:9);基序 II:G [GN] GX [YF] NXX [VA] AX [EH] [LF] R (SEQ ID NO: 10)；基序 III:RXXRI [QE] [DEQ] S[IM]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序 IV:S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL] (SEQ ID NO: 12)；基序 V:P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序 VI: [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)；基序 VI1:E[HG]DXSX[ST]RXD(SEQ ID N0:15)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二或第三碳在與所述過氧化酶接觸前是未取代的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述多肽包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列組成:與SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的成熟多肽，優(yōu)選SEQ ID NO: 2或4的成熟多肽，具有至少35%同一性，優(yōu)選至少40%同一性，更優(yōu)選至少45%同一性,更優(yōu)選至少50%同一性,更優(yōu)選至少55%同一性,更優(yōu)選至少60%同一性,更優(yōu)選至少65%同一性,更優(yōu)選至少70%同一性,更優(yōu)選至少75%同一性,更優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，且特別至少95%同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽包括以下或由以下組成:SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28 或 29 的氨基酸序列，優(yōu)選SEQ ID N0:2或4的氨基酸序列；或其具有過氧化酶活性的片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脂族烴的取代基選自鹵素、羥基、羧基、氨基、硝基、氰基、巰基、磺?；⒓柞；?、乙酰基、甲氧基、乙氧基、苯基、芐基、二甲苯基、氨基甲酰基和氨磺?；?。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述取代基選自氯、羥基、羧基和磺酰基；特別是氯和羧基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脂族烴是烷烴。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述烷烴是戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷或十六烷、或其異構(gòu)體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述烷是十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷或十六烷、或其異構(gòu)體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脂族烴是未取代的。
11.根據(jù)權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脂族烴是直鏈的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1~11中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過引入兩個(gè)羥基將所述脂族烴轉(zhuǎn)化為二醇。
13.一種制備聚氨酯的酶法，包括根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法將脂族烴轉(zhuǎn)化為二醇，以及使用所述二醇制備聚氨酯。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所制備的二醇用于制備聚氨酯的用途。
15.過氧化酶用 于在脂族烴的兩個(gè)或更多端的第二或第三碳處引入羥基或酮基的用途。
【文檔編號(hào)】C08L75/04GK103703136SQ201280033774
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月7日
【發(fā)明者】H·倫, J·布拉斯克, L·卡盧, A·古鐵雷斯蘇亞雷斯, E·D·巴博特, R·烏爾里希, M·霍弗里希特, A·T·馬丁內(nèi)斯費(fèi)雷爾, J·C·德爾里奧安德拉德 申請人:諾維信公司