專利名稱：從含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液中提取透明質(zhì)酸鈉的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物化工領域，具體地說，涉及一種從含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液中提 取透明質(zhì)酸鈉的方法。
背景技術：
透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,簡稱HA)是一類酸性黏多糖類物質(zhì)，由葡糖醛
酸-N-乙酰氨基葡糖為雙糖單位組成的直鏈高分子多糖，雙糖單位數(shù)為300-1100對，分 子量范圍105-107Da。HA溶于水，不溶于醇、酮、乙醚等有機溶劑。由于其溶液具有超強的持水性、 粘彈性和生物易吸收性，被廣泛用于眼科手術、腹腔手術中預防粘連、關節(jié)炎以及化妝 品等領域。透明質(zhì)酸通常以其鈉鹽形式存在。國內(nèi)外對HA的性質(zhì)、生物活性、生產(chǎn)工 藝、臨床應用等方面都進行了廣泛深入的研究，目前主要應用于醫(yī)藥和化妝品方面，是 當今文獻中公認的最佳保濕產(chǎn)品。

目前大都采用發(fā)酵法來生產(chǎn)HA，早在1983年日本資生堂采用鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn) 透明質(zhì)酸。隨后發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的研究越來越廣泛，如日本專利No.58-566922、美 國專利No.60-500997、韓國專利No.10-250573等。由于發(fā)酵液中含有菌體、蛋白質(zhì)以及 核酸等物質(zhì)，從發(fā)酵液中提取HA的方法主要有以下幾種A.大量稀釋膜濾法，由于發(fā) 酵液中菌體等雜質(zhì)較多，極易造成膜孔堵塞，且大量稀釋易形成操作體積過大；B.高速 離心法，除去菌體時對設備的要求很高；C.氯仿法，菌體沉淀中夾帶較多的HA，HA的 回收率低，且氯仿對環(huán)境污染；D.乙醇沉淀法，是一種較為常用的方法，但由于該法操 作時所用設備及車間均必須防爆，這勢必增加了操作的危險性和生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術中存在的制得的透明質(zhì)酸鈉產(chǎn)品形態(tài)較硬，不易溶 解，蛋白含量高且含有其他粗多糖雜質(zhì)，分子量較低等不足，提供一種低成本、快速高 效制備高純度透明質(zhì)酸鈉的方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種從含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液中提取透明質(zhì) 酸鈉的方法，其是將含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液稀釋后脫色除菌體，過濾后，向濾液中加 入CTAB，離心分離后，向沉淀中加入氯化鈉溶液進行解離，解離液過陰離子交換柱 DEAE-52層析柱后，過柱液用乙醇沉淀，離心干燥后得到粉末狀透明質(zhì)酸鈉固體。具體地，本發(fā)明采用以下的技術方案實現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提供的一種從含有透明 質(zhì)酸的發(fā)酵液中提取透明質(zhì)酸鈉的方法，其包括步驟1)將含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液加水稀釋，向稀釋液中加入硅藻土和活性炭，攪拌 后過濾，收集濾液；2)向濾液中加入10%的CTAB，攪拌后離心分離，用水洗滌固體沉淀；3)向步驟2)所得沉淀中加入0.1 3M的氯化鈉溶液，攪拌至固體沉淀完全溶解；4)將步驟3)的溶液以1 3BV/h過層析柱后，收集過柱液，向所得溶液中緩慢 流加1 3倍體積的95%乙醇，離心后干燥得到粉末狀沉淀。更具體地，本發(fā)明采用以下的技術方案實現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提供的一種從含有透 明質(zhì)酸的發(fā)酵液中提取透明質(zhì)酸鈉的方法，其包括步驟1)將含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液加水稀釋至發(fā)酵液體積的1 10倍，向稀釋液中加 入發(fā)酵液體積0.5 3%的硅藻土和0.2 2%的活性炭，30 60°C保溫攪拌后過濾，收 集濾液；2)向濾液中加入10%的CTAB，攪拌后離心分離，用水洗滌固體沉淀；其中，10%的CTAB溶液質(zhì)量與透明質(zhì)酸發(fā)酵液的質(zhì)量比為1 3 1 ；3)向步驟2)所得沉淀中加入1 3倍發(fā)酵液體積的0.1 3M氯化鈉溶液，攪 拌至固體沉淀完全溶解；4)將步驟3)的溶液以1 3BV/h過層析柱后，收集過柱液，向所得溶液中緩慢 流加1 3倍體積的95%乙醇，離心后收集沉淀；5)將步驟4)的上清液抽濾，然后流加0.3 2倍體積的無水乙醇，離心后收集 沉淀；6)合并步驟4)和步驟5)所得沉淀，真空干燥5 20h。前述的方法，所述層析柱為陰離子交換柱DEAE-52。本發(fā)明采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)絡合法及過陰離子交換柱DEAE-52 法提取發(fā)酵液中的透明質(zhì)酸鈉，由于HA的聚陰離子與表面活性物質(zhì)十六烷基三甲基溴 化銨(CTAB)形成絡合物，這些絡合物在低離子強度的水溶液中不溶解，高子強度時溶 解，采用過柱法除去蛋白質(zhì)，從而得到一種快速高效的提取透明質(zhì)酸鈉的新方法，符合 大量生產(chǎn)要求，且能低成本制得高純度的透明質(zhì)酸鈉，所得葡糖醛酸純度在44%以上， HA得率在90%以上，分子量損失率低于13%，蛋白含量低于0.05%。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例11)取500ml發(fā)酵液，含HA 2g，分子量為2.38Mda。發(fā)酵液用去離子水稀釋2倍。2)在溶解液中加入3g/L的硅藻土和2g/L的活性炭，攪拌兩小時后，過濾，得 到濾液。3)向濾液中加入10% CTAB，加入量為HA CTAB=I 2.0 (g/g),攪拌絡 合后，過濾得到絡合物。4)加入0.6M的氯化鈉溶液至原發(fā)酵液體積，200rpm下攪拌解離24h。5)將解離液以1.5BV/h過陰離子交換柱DEAE-52層析柱后，收集過柱液。 6)向濾液中流加95%乙醇1000ml，加入量為HA溶液乙醇=1 2 (ν/ν),同 時以150rpm攪拌，流加15 20% (質(zhì)量百分比)氯化鈉溶液，直至有白色小絮狀物出 現(xiàn)，離心干燥后得到粉末狀透明質(zhì)酸鈉固體。
所得HA干粉1.2g，葡糖醛酸純度約45.5%，HA得率為92.5%，分子量為 2.07MDa,分子量損失率為10%，蛋白/HA(g/g)為0.05%。實施例21)取500ml發(fā)酵液，含HA2g，分子量為2.38Mda，發(fā)酵液用去離子水稀釋2.5倍。2)在溶解液中加入3g/L的硅藻土和2g/L的活性炭，攪拌兩小時后，過濾，得 到濾液。3)向濾液中加入10% CTAB，加入量為HA CTAB=I 2.5 (g/g),攪拌絡 合后，過濾得到絡合物。4)加入0.8M的氯化鈉溶液至原發(fā)酵液體積，200rpm下攪拌解離24h。5)將解離液以2.0BV/h過層析柱后，收集過柱液。6)向濾液中流加95%乙醇1500ml，加量為HA溶液乙醇=1 3 (ν/ν),同時 以150rpm攪拌，流加15 20% (質(zhì)量百分比)氯化鈉溶液，直至有白色小絮狀物出現(xiàn)， 離心干燥后得到粉末狀透明質(zhì)酸鈉固體。所得HA干粉l.lg，葡糖醛酸純度約46.7%，HA得率為90.3%，分子量為 2.31MDa,分子量損失率為12%，蛋白/HA(g/g)為0.04%。實施例31)取500ml發(fā)酵液，含HA2g，分子量為2.38Mda，發(fā)酵液用去離子水稀釋3倍。2)在溶解液中加入3g/L的硅藻土和2g/L的活性炭，攪拌兩小時后，過濾，得 到濾液。3)向濾液中加入10% CTAB，加入量為HA CTAB=I 3.0 (g/g)，攪拌絡 合后，過濾得到絡合物。4)加入0.8M的氯化鈉溶液至原發(fā)酵液體積，200rpm下攪拌解離24h。5)將解離液以2.5BV/h過層析柱后，收集過柱液。6)向濾液中流加95%乙醇1500ml，加量為HA溶液乙醇=1 3 (ν/ν),同時 以150rpm攪拌，流加15 20% (質(zhì)量百分比)氯化鈉溶液，直至有白色小絮狀物出現(xiàn)， 離心干燥后得到粉末狀透明質(zhì)酸鈉固體。所得HA干粉1.23g，葡 糖醛酸純度約46.1 %，HA得率為91.8%，分子量為 2.13MDa,分子量損失率為11%，蛋白/HA (g/g)為0.05%。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但 在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見 的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保 護的范圍。
權利要求
1.一種從含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液中提取透明質(zhì)酸鈉的方法，其特征在于，其是將含 有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液稀釋后脫色除菌體，過濾后，向濾液中加入CTAB，離心分離后，向 沉淀中加入氯化鈉溶液進行解離，解離液用乙醇沉淀，離心干燥后得到粉末狀透明質(zhì)酸 鈉固體。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，包括步驟1)將含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液加水稀釋，向稀釋液中加入硅藻土和活性炭，攪拌后過 濾，收集濾液；2)向濾液中加入10%的CTAB，攪拌后離心分離，用水洗滌固體沉淀；3)向步驟2)所得沉淀中加入0.1 3M的氯化鈉溶液，攪拌至固體沉淀完全溶解；4)將步驟3)的溶液以1 3BV/h過層析柱后，收集過柱液，向所得溶液中緩慢流加 1 3倍體積的95%乙醇，離心后干燥得到粉末狀沉淀。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括步驟1)將含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液加水稀釋至發(fā)酵液體積的1 10倍，向稀釋液中加入發(fā) 酵液體積0.5 3%的硅藻土和0.2 2%的活性炭，30 60°C保溫攪拌后過濾，收集濾 液；2)向濾液中加入10%的CTAB，攪拌后離心分離，用水洗滌固體沉淀； 其中，10%的CTAB溶液質(zhì)量與透明質(zhì)酸發(fā)酵液的質(zhì)量比為1 3 1 ；3)向步驟2)所得沉淀中加入1 3倍發(fā)酵液體積的0.1 3M氯化鈉溶液，攪拌至 固體沉淀完全溶解；4)將步驟3)的溶液以1 3BV/h過層析柱后，收集過柱液，向所得溶液中緩慢流加 1 3倍體積的95%乙醇，離心后收集沉淀；5)將步驟4)的上清液抽濾，然后流加0.3 2倍體積的無水乙醇，離心后收集沉淀；6)合并步驟4)和步驟5)所得沉淀，真空干燥5 20h。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述層析柱為陰離子交換柱 DEAE-52。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液中提取透明質(zhì)酸鈉的方法，其是將含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液稀釋后脫色除菌體，過濾后，向濾液中加入CTAB，離心分離后，向沉淀中加入氯化鈉溶液進行解離，解離液過陰離子交換柱DEAE-52層析柱后，過柱液用乙醇沉淀，離心干燥后得到粉末狀透明質(zhì)酸鈉固體。采用該方法提取透明質(zhì)酸鈉的優(yōu)點在于提取收率高，產(chǎn)品純度高，蛋白含量極低，工藝簡單，操作簡便。
文檔編號C08B37/08GK102020724SQ20101061087
公開日2011年4月20日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權日2010年12月23日
發(fā)明者張雪鋒, 魏生 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術工程研究有限公司