專(zhuān)利名稱(chēng)：：甲基丙烯酸酯嵌段聚合物及其復(fù)合物及它們的制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種甲基丙烯酸酯嵌段聚合物，該聚合物的納米復(fù)合物及此復(fù)合物與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物，本發(fā)明還涉及他們的制備方法及其在作為基因的載體中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：對(duì)金納米顆粒的研究已經(jīng)有150年歷史。金納米顆粒具有抗氧化性強(qiáng)、生物相容性好、密度高和光電特性好的優(yōu)點(diǎn)，基于金納米顆粒的生物分析方法已經(jīng)取得了很多成果。表面包被有單分子層的金納米團(tuán)簇(Au2MPCs)同核酸、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜等生物物質(zhì)發(fā)生作用，能應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域。文獻(xiàn)[l]報(bào)道了陽(yáng)離子脂質(zhì)雙層包裹的金納米粒子調(diào)節(jié)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的影響。二甲基二十八烷基溴化銨(DODAB)，陽(yáng)離子脂質(zhì)體雙層膜包裹的Au納米顆粒(AuNPs)在血清中能夠有效的傳遞兩種質(zhì)粒DNA到人胚胎腎肝細(xì)胞(HEK293)中，AuNPs的轉(zhuǎn)染效率約是DODAB的5倍。AuNPs與DNA的相互作用由染料插入試驗(yàn)和凝膠電泳表征。文獻(xiàn)提出了理解和控制陽(yáng)離子脂質(zhì)體和DNA相互作用的新觀點(diǎn)，為構(gòu)建金納米粒子基因傳遞載體提供了新方法。平均分子量為2kDa(PEI2)的支化聚乙烯亞胺(PEI)與金納米顆粒(GNPs)共價(jià)鍵連接[2]構(gòu)成PEI2-GNPs融合物，PEI2-GNPs與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染猴腎細(xì)胞(COS-7)的效率是PEI2的12倍。而PEI2-GNPs和iV-十二烷基-PEI2與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物對(duì)上述細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)一步提高。具體轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)是單獨(dú)的PEI2轉(zhuǎn)染效率為4%，PEI2—GNPs轉(zhuǎn)染效率為25%，而PEI2-GNPs和7V-十二烷基-PEI2混合物與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率為50%。文獻(xiàn)[3]報(bào)道了通過(guò)可逆加成-斷裂連遷移聚合(RAFT)合成精細(xì)共聚物穩(wěn)定的金屬納米顆粒的制備。反應(yīng)通過(guò)室溫條件自發(fā)還原硫代酯末端基團(tuán)成巰基，在金屬?gòu)?fù)合物或金屬溶膠的水溶液中生成共聚物穩(wěn)定的金屬納米顆粒。共聚物穩(wěn)定的納米顆粒包括Au(HAuCU),Ag(AgN03),Pt(Na2PtCl6.6H20),和Rh(Na3RhCl6)，使用0.01wt%的鹽溶液和1.0MNaBH4作為還原試劑，NaBH4:末端硫代酯聚合物的摩爾比率是25:1，通過(guò)13000rpm離心1小時(shí)，得到共價(jià)鍵連接的聚合物膠體溶液。文獻(xiàn)[4]報(bào)道了脂肪鏈季銨鹽修飾的混合單層保護(hù)的金顆粒(MMPCs)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，通過(guò)P牛乳糖轉(zhuǎn)移和活化證實(shí)這種轉(zhuǎn)染試劑與孵育期間DNA與納米顆粒的比率，單層核中電荷的數(shù)量，季銨鹽周?chē)目s水填充等因素有關(guān)。MMPCs和質(zhì)粒DNA復(fù)合物的重量比(w/w)為30:1，在10%和100pM氯喹溶液中轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞效率是60kDa聚乙烯亞胺的8倍。文獻(xiàn)[5]報(bào)道了寡聚核酸修飾的金納米顆粒用于控制細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)，這種修飾的金納米顆粒是一種細(xì)胞內(nèi)在化基因調(diào)控試劑，它與互補(bǔ)核酸結(jié)合率高于單一寡聚核酸修飾，沒(méi)有細(xì)胞毒性，能高效濃縮核酸，也很難被活性核酸酶降解，細(xì)胞攝取率達(dá)99%。本發(fā)明的目的在于，提供一種細(xì)胞轉(zhuǎn)染率高、且細(xì)胞毒性低的端巰基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物(MPDMAEMAIM)，此聚合物與金納米粒子自組裝構(gòu)建的金納米復(fù)合物(PDMAEMAIMGNPs)及該復(fù)合物與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供所述聚合物、復(fù)合物的制備方法。本發(fā)明最后提供所述聚合物、復(fù)合物在作為基因的載體中的應(yīng)用。一種端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物，其結(jié)構(gòu)式如下/<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中m二16-36，n=22-48，所述的聚合物用凝膠色譜表征，N,N-二甲基甲酰胺為流動(dòng)相，流動(dòng)速率為1.0mL/min，溫度35°C，其數(shù)均摩爾質(zhì)量為5000-11000Da，重均摩爾質(zhì)量/數(shù)均摩爾質(zhì)量在1.20-1.5;對(duì)[lT]緩沖容量在
發(fā)明內(nèi)容2.0-4.0pmol/mg。一種端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的納米金復(fù)合物，其結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中111=16-36，n=22-48，對(duì)[lf]緩沖容量在2.0-4.0jnmol/mg。所述的納米金復(fù)合物為端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物自組裝3-7個(gè)金原子構(gòu)成的納米顆粒。所述的納米金復(fù)合物的緩沖溶液為磷酸鈉緩沖溶液，納米金復(fù)合物在磷酸鈉緩沖溶液中的質(zhì)量濃度為30昭/mL。一種端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的納米金復(fù)合物與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物，所述的質(zhì)粒DNA選自p53DNA，綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA(GFPDNA)以及人未甲基化寡聚脫氧核苷酸質(zhì)粒DNA(CpGODN)。所述的納米金復(fù)合物與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物中，組裝在金表面的端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物與質(zhì)粒DNA正負(fù)電荷比的范圍為6-12。所述的納米金復(fù)合物與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比為5:1，10:1，15:1或20:1。所述的納米金復(fù)合物與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物的緩沖溶液為磷酸鈉緩沖溶液，納米金復(fù)合物在磷酸鈉緩沖溶液中的質(zhì)量濃度為30)Lig/mL。一種端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的制備方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)a.通過(guò)乙基黃原酸鉀和溴乙烷反應(yīng)得到乙基黃原酸乙酯；b.乙基黃原酸乙酯和乙烯基咪唑在偶氮二異丁腈催化下進(jìn)行可逆加成-斷裂連遷移聚合反應(yīng)，得到黃原酸乙酯基聚乙烯基咪唑；c.黃原酸乙酯基聚乙烯基咪唑和2-二甲氨基乙基-甲基丙烯酸酯在偶氮二異丁腈催化下進(jìn)行可逆加成-斷裂連遷移聚合反應(yīng)，得到黃原酸乙酯基聚2-二甲氨基乙基-甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑；d.將c中的產(chǎn)物黃原酸乙酯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑的四氫呋喃溶液中加入正丁胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下氨解，得到端巰基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑。一種端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的納米金復(fù)合物的制備方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)將氯金酸與端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物混合，添加去離子水，攪拌，用硼氫化鈉還原，過(guò)夜，磷酸鹽緩沖溶液透析、定容。一種端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物在作為基因的載體中的應(yīng)用。一種端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的納米金復(fù)合物在作為基因的載體中的應(yīng)用。本發(fā)明中的聚合物及復(fù)合物的作用是結(jié)合基因，使基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，從而使轉(zhuǎn)染效率提高，與通常意義上的"基因的載體"的作用相同。本發(fā)明具有如下技術(shù)效果本發(fā)明中，端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物(MPDMAEMAIM)、端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物與納米金的復(fù)合物(PDMAEMAIMGNPs)作為質(zhì)粒DNA的載體，與質(zhì)粒DNA結(jié)合，進(jìn)而轉(zhuǎn)染細(xì)胞，因此該聚合物可用作腫瘤抑制藥物的載體。端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的納米金復(fù)合物(PDMAEMAIMGNPs)及其與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物(PDMAEMAIMGNPs/質(zhì)粒DNA)在磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.2)中穩(wěn)定。Zeta電位研究表明納米基因復(fù)合物帶正電，用掃描電鏡觀察PDMAEMAIMGNPs/GFPDNA復(fù)合物的粒徑在80-160nm，該粒徑范圍的納米復(fù)合物有利于對(duì)細(xì)胞有效轉(zhuǎn)染，并具有綠色熒光蛋白表達(dá)效果；PDMAEMAIMGNPs/CpGODN復(fù)合物對(duì)小鼠具有體外免疫療效；PDMAEMAIMGNPs/p53DNA復(fù)合物對(duì)鼠腫瘤具有體內(nèi)外治療效果，具體效果如下1.PDMAEMAIMGNPs和PDMAEMAIMGNPs/GFPDNA復(fù)合物在磷酸鹽緩沖溶液(pH:7.2)中穩(wěn)定。PDMAEMAGNPs/GFPDNA復(fù)合物緩沖溶液中呈現(xiàn)紅色膠體、結(jié)合基因能力強(qiáng)。2.PDMAEMAIMGNPs/GFPDNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后有利于質(zhì)粒DNA釋放，轉(zhuǎn)染效率為55%。3.PDMAEMAIMGNPs和PDMAEMAIMGNPs/GFPDNA復(fù)合物在濃度30嗎/ml時(shí)，細(xì)胞存活率大于90%。4.PDMAEMAIMGNPs/CpGODN復(fù)合物對(duì)小鼠的脾細(xì)胞和胰腺細(xì)胞的體外免疫活性顯示免疫效果大于50%。5.PDMAEMAIMGNPs/p53DNA復(fù)合物對(duì)鼠骨肉瘤細(xì)胞的基因治療效果顯示有明顯的腫瘤受抑制。6.MPDMAEMAIM/GFPDNA復(fù)合物對(duì)293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率小于10%，但細(xì)胞毒性與PDMAEMAIMGNPs基本相同。具體實(shí)施例方式實(shí)例l:乙基黃原酸乙酯的合成在500mL圓底燒瓶中加入lOOmL四氯化碳，O.lmol溴乙烷，0.12mol乙基黃原酸鈉，室溫下攪拌72h，減壓過(guò)濾，分別用三氯甲垸和飽和碳酸氫鈉洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥，蒸餾除去溶劑，得到黃色油狀液體，硅膠柱色譜分離，洗脫劑為己烷和乙酸乙酯混合溶齊l」(體積比90:10)，得到乙基黃原酸乙酯。實(shí)例2:黃原酸乙醋基聚乙烯基咪唑(OPEIM)的合成在5mL圓底燒瓶中加入乙烯基咪唑(EIM)lg,偶氮二異丁腈(AIBN)4mg，乙基黃原酸乙酯80mg和2mL四氫呋喃，[乙基黃原酸乙酯]:[偶氮二異丁腈]=20。液氮冷凍去除氧氣，再減壓去氧后密封，70°C水浴中反應(yīng)48h。冷卻至室溫后加入過(guò)量己烷沉淀、分離產(chǎn)物OPEIM。聚合物用&NMR表征，D4-甲醇和D-氯仿為溶劑。實(shí)例3:OPEIM引發(fā)2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯的RAFT聚合制備黃原酸乙酯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯基咪唑在園底燒瓶中加入四氫呋喃，加入由實(shí)例2得到的OPEIM、(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈(AIBN)引發(fā)劑，[OPEIM]:[AIBN]=20。液氮冷凍去除氧氣，再減壓去氧后密封，70°C水浴中反應(yīng)48h，冷卻至室溫后加入過(guò)量己垸沉淀、分離，得到黃原酸乙酯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯基咪唑(OPDMAEMAIM)。實(shí)例4:端巰基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酷嵌段-聚乙烯基咪唑(MPDMAEMAIM)的合成將OPDMAEMAIM溶解在四氫呋喃溶液中，滴加數(shù)滴過(guò)硫酸銨溶液，充氮?dú)?0min后，加入正丁胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌5h。反應(yīng)混合物加入10倍過(guò)量的正己烷沉淀、過(guò)濾，得到端巰基聚聚甲基丙烯酸酯嵌段聚乙烯咪唑(MPDMAEMAIM)。實(shí)例5:MPDMAEMAIM在納米金表面的自組裝產(chǎn)物(PDMAEMAIMGNPs)在100mL的園底燒瓶中加入4mL氯金酸溶液(質(zhì)量比1000:1)，3mLMDPDMAEMAIM(IOmg/mL)，3mL去離子水，劇烈攪拌15min。然后加入10vL(100mM)硼氫化鈉，繼續(xù)攪拌60min。靜置過(guò)夜，然后在磷酸鹽緩沖溶液中透析24h，定容至lmg/mL，得到PDMAEMAIMGNPs復(fù)合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*最終形成的復(fù)合物記為a**最終形成的復(fù)合物記為b***最終形成的復(fù)合物記為c實(shí)例6:PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA納米復(fù)合物PDMAEMAIMGNPs(b)磷酸鈉緩沖溶液與質(zhì)粒GFPDNA混合(質(zhì)量比為5:1，10:1，15:1,20:1)，在37QC下震搖30min，用去離子水透析4h，滴加到潔凈的硅片上，用掃描電鏡觀察形貌。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)例7:PDMAEMAIMGNPs/GFPDNA納米復(fù)合物在十二烷基硫酸鈉和氯化鈉溶液中的穩(wěn)定性用凝膠電泳驗(yàn)證PDMAEMAIMGNPs/GFPDNA納米復(fù)合物的穩(wěn)定性。十二垸基硫酸鈉(SDS)濃度為1%和10%;氯化鈉溶液濃度為0.5M，1M和1.5M。結(jié)果表明PDMAEMAIMGNPs/GFPDNA納米復(fù)合物在大于1M氯化鈉溶液或1%十二烷基硫酸鈉溶液中穩(wěn)定性差。實(shí)例8.PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA納米復(fù)合物加入到平面培養(yǎng)的細(xì)胞中，24孔板中每孔種植5萬(wàn)個(gè)HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)間為6h。更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36h，用流式細(xì)胞儀研究PDMAEMAIMGNPs(b)與GFPDNA在各種質(zhì)量比例條件下的綠色熒光蛋白表達(dá)效率。PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA(質(zhì)量比)5:110:115:120:1綠色熒光蛋白表達(dá)效率％58535654實(shí)例9.PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA納米復(fù)合物加入到平面培養(yǎng)的細(xì)胞中，24孔板中每孔種植5萬(wàn)個(gè)HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)間為6h。更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36h，用流式細(xì)胞儀研究PDMAEMAIMGNPs(b)與GFPDNA細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)效率。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)例10.PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染293細(xì)胞PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA納米復(fù)合物加入到平面培養(yǎng)的細(xì)胞中，24孔板中每孔種植5萬(wàn)個(gè)HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)間為6h。更換新鮮培養(yǎng)基后，繼續(xù)培養(yǎng)36h，用流式細(xì)胞儀研究PDMAEMAIMGNPs(b)與GFPDNA在各種質(zhì)量比例條件下細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)效率。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)例11.MPDMAEMAIM/GFPDNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞MPDMAEMAIM/GFPDNA納米復(fù)合物加入到平面培養(yǎng)的細(xì)胞中，24孔板中每孔種植5萬(wàn)個(gè)HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)間為6h。更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36h，用流式細(xì)胞儀研究MPDMAEMAIM與GFPDNA在各種質(zhì)量比例條件下細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)效率。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)例12.MPDMAEMAIM/GFPDNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞MPDMAEMAIM/GFPDNA納米復(fù)合物加入到平面培養(yǎng)的細(xì)胞中，24孔板中每孔種植5萬(wàn)個(gè)HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)間為6h。更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36h，用流式細(xì)胞儀研究MPDMAEMAIM與GFPDNA在各種質(zhì)量比例條件下細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)效率。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)例13.MPDMAEMAIM/GFPDNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染293細(xì)胞MPDMAEMAIM/GFPDNA納米復(fù)合物加入到平面培養(yǎng)的細(xì)胞中，24孔板中每孔種植5萬(wàn)個(gè)HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)間為6h。更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)30h，用流式細(xì)胞儀研究MPDMAEMAIM與GFPDNA在各種質(zhì)量比例條件下細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)效率。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)例14:PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA納米復(fù)合物對(duì)小鼠肺和脊髓內(nèi)鞘的體內(nèi)轉(zhuǎn)染分別用PDMAEMAIMGNPs(b)與GFPDNA的質(zhì)量比分別為5:1，10:1,15:1，20:1對(duì)小鼠尾靜脈注射，48h后處死小鼠，取小鼠肺和脊髓進(jìn)行切片，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA轉(zhuǎn)染小鼠肺和脊髓內(nèi)鞘的效率。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)例15.PDMAEMAIMGNPs(b)對(duì)HEK293T細(xì)胞的毒性?xún)扇f(wàn)個(gè)HEK293T細(xì)胞種植在96孔板中，孵育24h，在100pLDMEM培養(yǎng)基/10%胎牛血清溶液中PDMAEMAIMGNPs(b)濃度為10-60ng/mL，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100)aL新鮮DMEM培養(yǎng)基代替，每孔分別加入20pLMTT。在37。C，C02培養(yǎng)箱中細(xì)胞孵育4h,加入100pL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過(guò)570nm每孔吸光率測(cè)定細(xì)胞的存活率。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)例16.PDMAEMAIMGNPs(b)對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性?xún)扇f(wàn)個(gè)HeLa細(xì)胞種植在96孔板中，孵育24h,在100pLDMEM培養(yǎng)基/10%胎牛血清溶液中PDMAEMAIMGNPs(b)濃度為10-60pg/mL，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100pL新鮮DMEM培養(yǎng)基代替，每孔分別加入20pLMTT。在37。C，C02培養(yǎng)箱中細(xì)胞孵育4h，加入100pL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過(guò)570nm每孔吸光率測(cè)定細(xì)胞的存活率。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)例17.PDMAEMAIMGNPs(b)對(duì)293細(xì)胞的毒性?xún)扇f(wàn)個(gè)293細(xì)胞種植在96孔板中，孵育24h，在100DMEM/10。/o胎牛血清溶液中PDMAEMAIMGNPs(b)濃度為10-60|ng/mL，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100新鮮DMEM代替，每孔分別加入20pLMTT。在37°C，C02培養(yǎng)箱中細(xì)胞孵育4h，加入100pL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過(guò)570nm每孔吸光率測(cè)定細(xì)胞的存活率。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)例18.MPDMAEMAIM對(duì)HEK293T細(xì)胞的毒性?xún)扇f(wàn)個(gè)HEK293T細(xì)胞種植在96孔板中，孵育24h，在100DMEM/10。/。胎牛血清溶液中MPDMAEMAIM濃度為10-60|ug/mL，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100pL新鮮DMEM代替，每孔分別加入20MTT。在37。C，c02培養(yǎng)箱中細(xì)胞孵育4h，加入100二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過(guò)570nm每孔吸光率測(cè)定細(xì)胞的存活率。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)例19.MPDMAEMAIM對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性?xún)扇f(wàn)個(gè)HeLa細(xì)胞種植在96孔板中，孵育24h，在100|iiLDMEM/10%胎牛血清溶液中MPDMAEMAIM濃度為10-60嗎/mL，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100|oL新鮮DMEM代替，每孔分別加入20MTT。在37°C，C02培養(yǎng)箱中細(xì)胞孵育4h，加入100)iL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過(guò)570nm每孔吸光率測(cè)定細(xì)胞的存活率。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)例20.MPDMAEMAIM對(duì)293細(xì)胞的毒性?xún)扇f(wàn)個(gè)293細(xì)胞種植在96孔板中，孵育24h，在100(iLDMEM/10%胎牛血清溶液中MPDMAEMAIM濃度為10-60pg/mL，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100)iL新鮮DMEM代替，每孔分別加入20pLMTT。在37。C，C02培養(yǎng)箱中細(xì)胞孵育4h，加入100mL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過(guò)570nm每孔吸光率測(cè)定細(xì)胞的存活率。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)例21.PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA復(fù)合物對(duì)HEK293T細(xì)胞的毒性?xún)扇f(wàn)個(gè)HEK293T細(xì)胞種植在96孔板中，孵育24h，在100pLDMEM/10。/。胎牛血清溶液中PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA納米復(fù)合物濃度為10-60呢/mL，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100新鮮DMEM代替，每孔分別加入20(LiLMTT。在37。C，C02培養(yǎng)箱中細(xì)胞孵育4h，加入100二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過(guò)570nm每孔吸光率測(cè)定細(xì)胞的存活率。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>67實(shí)例22.PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA復(fù)合物對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性?xún)扇f(wàn)個(gè)HeLa細(xì)胞種植在96孔板中，孵育24h，在100jiLDMEM/10%胎牛血清溶液中PDMAEMAIMGNPs/GFPDNA納米復(fù)合物濃度為10-60/mL，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100pL新鮮DMEM代替，每孔分別加入20iiLMTT。在37。C，C02培養(yǎng)箱中細(xì)胞孵育4h，加入100pL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過(guò)570nm每孔吸光率測(cè)定細(xì)胞的存活率。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)例23.PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA復(fù)合物對(duì)293細(xì)胞的毒性?xún)扇f(wàn)個(gè)293細(xì)胞種植在96孔板中，孵育24h，在100DMEM/10y。胎牛血清溶液中PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA納米復(fù)合物濃度為10-60|ug/mL，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100piL新鮮DMEM代替，每孔分別加入20pLMTT。在37。C，0)2培養(yǎng)箱中細(xì)胞孵育4h，加入100(xL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過(guò)570nm每孔吸光率測(cè)定細(xì)胞的存活率。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>24.PDMAEMAIMGNPs(b)/CpGODN復(fù)合物對(duì)小鼠脾細(xì)胞和胰腺細(xì)胞的體外免疫活性固定PDMAEMAIMGNPs(b)的濃度為30fxg/mL，改變CpGODN的濃度，對(duì)小鼠脾細(xì)胞和胰腺細(xì)胞分別用上述不同比例的PDMAEMAIMGNPs(b)/CpGODN納米復(fù)合物孵育3天，測(cè)試脾細(xì)胞免疫和胰腺細(xì)胞存活率。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)例25.PDMAEMAIMGNPs(b)/p53DNA復(fù)合物對(duì)鼠骨肉瘤細(xì)胞的體外基因治療固定PDMAEMAIMGNPs(b)的濃度為30嗎/mL，改變p53DNA的濃度，使其質(zhì)量比分別為5:1，10:1，15:1和20:1鼠骨肉瘤細(xì)胞的體外基因治療。鼠骨肉瘤細(xì)胞用PDMAEMAIMGNPs(b)/p53DNA納米復(fù)合物孵育3天，測(cè)試體外基因治療顯示腫瘤增長(zhǎng)受抑制率。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)例26.PDMAEMAIMGNPs(b)/p53DNA復(fù)合物對(duì)鼠骨肉瘤細(xì)胞的體內(nèi)基因治療固定PDMAEMAIMGNPs(b)的濃度為30嗎/mL,改變p53DNA的濃度，使其質(zhì)量比分別為5:1，10:1，15:1和20:1對(duì)鼠骨肉瘤進(jìn)行體內(nèi)基因治療。PDMAEMAIMGNPs(b)/p53DNA納米復(fù)合物對(duì)鼠骨肉瘤孵育3天，測(cè)試體內(nèi)基因治療顯示腫瘤增長(zhǎng)受抑制率。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>結(jié)論及分析MPDMAEMAIM在金納米顆粒組裝構(gòu)建的PDMAEMAIMGNPs納米材料，在金含量固定的條件下，金納米顆粒的粒徑隨著MPDMAEMAIM含量的增大由約80nm逐漸變小到約5nm,溶液的顏色由紫色逐漸變成亮紅色。MPDMAEMAIM組裝到金表面的含量由10%增加到40%以上。PDMAEMAIMGNPs濃縮GFPDNA的復(fù)合物的形貌特征是GFPDNA被PDMAEMAIM濃縮，形成粒徑大于PDMAEMAIMGNPs的納米顆粒；PDMAEMAIMGNPs/GFPDNA復(fù)合物在1%十二烷基硫酸鈉中不穩(wěn)定，在高濃度氯化鈉溶液中不穩(wěn)定，在去離子水或磷酸鈉緩沖溶液中穩(wěn)定；PDMAEMAIMGNPs/GFPDNA復(fù)合物對(duì)HEK293T細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率大于50%,對(duì)HeLa細(xì)胞和293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率低。對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PDMAEMAIMGNPs/GFPDNA復(fù)合物對(duì)小鼠脊髓內(nèi)鞘的轉(zhuǎn)染效率高50%，而對(duì)小鼠肺轉(zhuǎn)染效率低。PDMAEMAIMGNPs/CpGODN納米復(fù)合物對(duì)小鼠的脾細(xì)胞和胰腺細(xì)胞的體外免疫活性顯示免疫效果約40%。PDMAEMAIMGNPs/p53DNA納米復(fù)合物對(duì)鼠骨肉瘤細(xì)胞的體外和體內(nèi)基因治療效果顯示腫瘤受抑制率約40%。上述PDMAEMAIMGNPs,PDMAEMAIMGNPs/GFPDNA復(fù)合物納米復(fù)合物的細(xì)胞毒性結(jié)果沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。對(duì)癌細(xì)胞的免疫結(jié)果和對(duì)腫瘤的抑制效果顯示陽(yáng)性。1.P.Li，D.Li,L.Zhang,G.Li,E.Wang,Cationiclipidbilayercoatedgoldnanoparticles-mediatedtransfectionofmammaliancells,Biomaterials,29(2008)3617—3624.2.M.Thomas,A.M.Klibanov，Conjugationtogoldnanoparticlesenhancespolyethylenimine，stransferofplasmidDNAintomammaliancells,PNAS，2003，100,9138—9143.3.AndrewB.Lowe,BrentS.Sumerlin，MichaelS.Donovan,CharlesL.Well-Defined(Co)polymersSynthesizedviaAqueousReversibleAddition-FragmentationChainTransferPolymerization,J.Am.Chem.Soc.2002,124,11562-11563.4.K.K.Sandhu，C.M.Mcintosh,J.M.Simard,S.W.Smith,V.M.Rotello，GoldNanoparticle-MediatedTransfectionofMammalianCells,BioconjugateChem.2002，13，3-6.5.N.L.Rosi，D.A.Giljohann,C.S.Thaxton，A.K.R.Lytton-Jean,M.SuHan,C.A.Mirkin，Oligonucleotide-ModifiedGoldNanoparticlesforIntracellularGeneRegulation,Science,2006,312,1027-1030.。權(quán)利要求1、一種端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物，其結(jié)構(gòu)式如下id="icf0001"file="A2009100539080002C1.tif"wi="50"he="36"top="42"left="73"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>其中m＝16-36，n＝22-48，所述的聚合物用凝膠色譜表征，N，N′-二甲基甲酰胺為流動(dòng)相，流動(dòng)速率為1.0mL/min，溫度35℃，其數(shù)均摩爾質(zhì)量為5000-11000Da，重均摩爾質(zhì)量/數(shù)均摩爾質(zhì)量在1.20-1.5，對(duì)[H+]緩沖容量在2.0-4.0μmol/mg。2、一種端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的納米金復(fù)合物，其結(jié)構(gòu)式如下其中m二16-36，n=22-48，對(duì)[tf]緩沖容量在2.0-4.0|umol/mg。3、如權(quán)利要求2的納米金復(fù)合物，其特征在于，所述的納米金復(fù)合物為端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物自組裝3-7個(gè)金原子構(gòu)成的納米顆粒。4、如權(quán)利要求2的納米金復(fù)合物，其特征在于，所述的納米金復(fù)合物的緩沖溶液為磷酸鈉緩沖溶液，納米金復(fù)合物在磷酸鈉緩沖溶液中的質(zhì)量濃度為30嗎/mL。5、一種端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的納米金復(fù)合物與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物，其特征在于，所述的質(zhì)粒DNA選自p53DNA，綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA以及人未甲基化寡聚脫氧核苷酸質(zhì)粒DNAo6、如權(quán)利要求5的納米金復(fù)合物與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物，其特征在于，所述端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物嫁接在金表面，該嫁接在金表面的端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物與質(zhì)粒DNA正負(fù)電荷比的范圍為6-12。7、如權(quán)利要求5或6的納米金復(fù)合物與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物，其特征在于，所述的納米金復(fù)合物與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比為5:1，10:1，15:1或20:1。8、如權(quán)利要求5或6的納米金復(fù)合物，其特征在于，所述的納米金復(fù)合物與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物的緩沖溶液為磷酸鈉緩沖溶液，納米金復(fù)合物在磷酸鈉緩沖溶液中的質(zhì)量濃度為30ng/mL。9、一種端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的制備方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)a.通過(guò)乙基黃原酸鉀和溴乙烷反應(yīng)得到乙基黃原酸乙酯；b.乙基黃原酸乙酯和乙烯基咪唑在偶氮二異丁腈催化下進(jìn)行可逆加成-斷裂連遷移聚合反應(yīng)，得到黃原酸乙酯基聚乙烯基咪唑；c.黃原酸乙酯基聚乙烯基咪唑和2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯在偶氮二異丁腈催化下進(jìn)行可逆加成-斷裂連遷移聚合反應(yīng)，得到黃原酸乙酯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑；d.將c中的產(chǎn)物黃原酸乙酯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑的四氫呋喃溶液中加入正丁胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下氨解，得到端巰基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪哇。10、一種端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的納米金復(fù)合物的制備方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)將氯金酸與端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物混合，添加去離子水，攪拌，用硼氫化鈉還原，過(guò)夜，磷酸鹽緩沖溶液透析、定容。11、一種端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物在作為基因的載體中的應(yīng)用。12、一種端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的納米金復(fù)合物在作為基因的載體中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種端巰基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物，該聚合物與納米金的復(fù)合物(PDMAEMAIMGNPs)及此復(fù)合物與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物，本發(fā)明還公開(kāi)了所述聚合物、復(fù)合物的制備方法及其在作為基因的載體中的應(yīng)用。本發(fā)明所涉及的聚合物、復(fù)合物作為質(zhì)粒DNA的載體，可與質(zhì)粒DNA結(jié)合，進(jìn)而轉(zhuǎn)染細(xì)胞，因此可用作腫瘤抑制藥物的載體。本發(fā)明的PDMAEMAIMGNPs與GFPDNA(綠色熒光蛋白表達(dá)基因)復(fù)合物在濃度為30μg/mL時(shí)，對(duì)HEK293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為55％，對(duì)HEK293T細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和293細(xì)胞的存活率大于90％。PDMAEMAIMGNPs/CpGODN(人未甲基化寡聚脫氧核苷酸)納米復(fù)合物對(duì)鼠骨肉瘤的基因治療有明顯效果，PDMAEMAIMGNPs/p53DNA(腫瘤抑制基因)納米復(fù)合物對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。文檔編號(hào)C08F293/00GK101659737SQ200910053908公開(kāi)日2010年3月3日申請(qǐng)日期2009年6月26日優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日發(fā)明者于伯章申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所