專利名稱：：包含3-羥基鏈烷酸酯單元和乳酸酯單元的共聚物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種包含3-羥基鏈烷酸酯單體單元和乳酸酯單體單元的共聚物，以及制備這種聚合物的方法。
背景技術(shù)：
：聚乳酸酯(PLA)是一種典型的由乳酸酯生成的生物可降解的聚合物，作為常規(guī)或醫(yī)用聚合物，其具有多種用途。目前，PLA是通過聚合由發(fā)酵微生物而制備的乳酸酯制備的，但是，通過直接聚合乳酸酯只能制備低分子量(1000-5000道爾頓)的PLA。為了合成高分子量(>100,000道爾頓)的PLA，可以使用通過鏈偶聯(lián)劑聚合由乳酸酯的直接聚合得到的低分子量PLA的方法。然而，其具有如下缺點如由于加入溶劑或者鏈偶聯(lián)劑而使高分子量PLA的制備方法復(fù)雜，且還不容易除去該溶劑或者鏈偶聯(lián)劑。目前，在制備高分子量的市售可得的PLA的方法中，正使用一種其中將乳酸酯轉(zhuǎn)化成交酯以通過交酯環(huán)的環(huán)化脫水作用合成PLA的方法。同時，聚羥基鏈垸酸酯(PHA)是一種在例如磷、氮、鎂、氧的其它營養(yǎng)元素缺乏而碳源過量時在微生物中積累作為碳和能量儲存化合物的聚酯。PHA由于與源于石油的合成聚合物具有相似的性質(zhì)，并且同時呈現(xiàn)出優(yōu)異的生物降解性質(zhì)，所以其被認為是合成塑料的替代性材料?，F(xiàn)有的PHA分為具有短碳鏈的SCL-PHA(短鏈長度PHA)和具有長碳鏈的MCL-PHA(中鏈長度PHA)。合成PHA的基因是從富養(yǎng)羅爾斯通氏菌CRa/Wo"/aewfra//za.)、假單胞菌CP化Mfifomw7os^.)微生物中克隆的，并且通過重組微生物合成了由多種單體組成的PHA(Qi等人，F(xiàn)五MS1MfcraWo/.丄e".，157:155，1997;Qi等人，F(xiàn)五MSM/cra&o/.167:89,1998;Langenbach等人,F五MSAfora&o/.150:303,1997;WO01/55436;US6,143,952;WO98/54329;以及WO99/61624)。為了在微生物中產(chǎn)生PHA，需要將微生物的代謝物轉(zhuǎn)化成PHA單體的酶以及使用PHA單體合成PHA聚合物的PHA合酶。PHA合酶使用羥酰輔酶A作為底物合成PHA，并且已知以下各種酶為能夠產(chǎn)生作為PHA底物的羥酰輔酶A的酶克隆自富養(yǎng)羅爾斯通氏菌等的a-酮硫解酶(PhaA)、乙酰乙酰輔酶A還原酶(PhaB);克隆自假單胞菌的3-羥基癸酰ACP:輔酶A轉(zhuǎn)移酶(PhaG);源自豚鼠氣單胞菌(^eramo"oscaWae)和銅綠假單胞菌CP化i^/omowasaen^/wwa)的(R)特異性烯酰輔酶A水合酶(PhaJ)(Fukui等人，J.Bacteriol.，180:667，1998;Tsage等人，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.,184:193,2000);源自大腸桿菌、銅綠假單胞菌等的3-酮脂酰基-ACP還原酶(FabG)(Taguchi等人，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett,176:183,1999;Ren等人，J.Bacteriol.，182:2978,2000;Park等人，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.，214:217,2002);源自丙酮丁醇梭菌(C7oWnWwwacdo^0^cwm)的磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶(Ptb)和丁酸激酶(BuK)(LiuandSteinbuchel，ApplEnvironMicrobiol,66:739，2000);源自科氏梭菌(C7osW(i/wmA:/w少veW)的Cat2(Hein等人.F_EMSM/craWo/.15:411，1997)等。使用在碳鏈的多種位置(主要在3、4、5和6位)羥基化的羥基鏈烷酸酯通過這些酶已經(jīng)合成了多種PHA。然而，已經(jīng)報道對于在2位羥基化的羥基鏈烷酸酯具有很少的PHA合酶活性(Zhang等人，j/p/.Mi'cra6/。/.萬/ofec/z朋/"56:131，2001;ValentinandSteinbuchel,Appl.Microbiol.Biotechnol.，40:699,1994)。迄今，已經(jīng)有報道在體外檢測到對乳酰輔酶A的PHA合酶活性，但是對乳酰輔酶A的PHA合酶活性十分弱(Zhang等人，ip//.M/cra6/o/.B/o/ec/mo/.,56:131，2001;ValentinandSteinbuchel,M/cra6/o/.所ofec/2"0/.，40:699，1994)。換句話說，因為羥基鏈烷酸酯，如在2位羥基化的乳酸酯，不是PHA合酶的合適底物，所以不存在天然產(chǎn)生或者通過重組細胞產(chǎn)生PHA和其共聚物的實例。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題因此，本發(fā)明的目的是提供一種包含3-羥基鏈烷酸酯單體單元和乳酸酯單體單元的共聚物。本發(fā)明的另一目的是提供一種有效制備包含3-羥基鏈垸酸酯單體單元和乳酸酯單體單元的共聚物的方法。技術(shù)方案為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了一種包含乳酸酯單體單元和3-羥基鏈垸酸酯單體單元的共聚物，并且優(yōu)選地，所述3-羥基鏈烷酸酯為選自由3-羥基丁酸酯、3-羥基戊酸酯、3-羥基丙酸酯和中鏈長度(MCL)的3-羥基鏈烷酸酯組成的組中的至少一種。這里采用的術(shù)語"共聚物"包括由兩種不同的單體組成的二元共聚物、由三種不同的單體組成的三元共聚物或由四種不同的單體組成的四元共聚物。另外，中鏈長度(MCL)的3-羥基鏈烷酸酯可為選自由3-羥基己酸酯(3HHx)、3-羥基庚酸酯(3HHp)、3-羥基辛酸酯(3HO)、3-羥基壬酸酯(3HN)、3-羥基癸酸酯(3HD)、3-羥基H^—垸酸酯(3HUD)和3-羥基十二垸酸酯(3HDD)組成的組中的至少一種，但是本發(fā)明并不限定于此。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了MCL3-羥基鏈垸酸酯-乳酸酯共聚物(聚(MCL3-羥基鏈烷酸酯-共-乳酸酯))、3-羥基丁酸酯-中鏈長度(MCL)3-羥基鏈垸酸酯-乳酸酯三元共聚物(聚(3-羥基丁酸酯-共-]^0^-羥基鏈烷酸酯-共-乳酸酯))、3-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯-乳酸酯三元共聚物(聚(3-羥基丁酸酯-共-3-羥基戊酸酯-共-乳酸酯))、3-羥基丙酸酯-乳酸酯共聚物(聚(3-羥基丙酸酯-共-乳酸酯))和3-羥基丁酸酯-3-羥基丙酸酉旨-乳酸酯三元共聚物(聚(3-羥基丁酸酯-共-羥基丙酸酯-共-乳酸酯))作為共聚物。本發(fā)明還提供了一種制備包含乳酸酯單體單元和3-羥基鏈烷酸酯單體單元的共聚物的方法，其中，該方法包括培養(yǎng)同時包含將乳酸酯轉(zhuǎn)化為乳酰輔酶A并將3-羥基鏈垸酸酯轉(zhuǎn)化為3-羥基垸酰輔酶A的酶的基因和聚羥基鏈烷酸酯(PHA)合酶基因的細胞或者植物的步驟。在本發(fā)明中，可以通過用將乳酸酯和3-羥基鏈垸酸酯分別轉(zhuǎn)化為乳酰輔酶A和3-羥基烷酰輔酶A的酶的基因，和/或使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因轉(zhuǎn)化不含有該兩種酶中的任何一種或兩種的細胞或植物而得到所述細胞或者植物。更優(yōu)選地，在本發(fā)明中，將乳酸酯和3-羥基鏈垸酸酯分別轉(zhuǎn)化為乳酰輔酶A和3-羥基垸酰輔酶A的酶的基因為丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(p")。在本發(fā)明中，所述細胞或者植物可以另外包含將3-羥基鏈烷酸酯轉(zhuǎn)化為3-羥基垸酰輔酶A的酶的基因，并且所述將3-羥基鏈垸酸酯轉(zhuǎn)化為3-羥基垸酰輔酶A的酶為a-酮硫解酶(PhaA)和/或乙酰乙酰輔酶A還原酶(PhaB)。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的制備方法中，所述細胞優(yōu)選為微生物。更優(yōu)選地，該微生物優(yōu)選為大腸桿菌。在本發(fā)明中，在包含3-羥基鏈垸酸酯的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述3-羥基鏈垸酸酯可為選自由3-羥基丁酸酯、3-羥基戊酸酯、3-羥基丙酸酯和中鏈長度(MCL)的3-羥基鏈垸酸酯組成的組中的至少一種。另外，戊酸、丙酸等可用作3-羥基戊酸酯、3-羥基丙酸酯等的來源。能夠合成包含3-羥基鏈垸酸酯單體單元和乳酸酯單體單元的共聚物的細胞或者植物可以通過如下方法得到(i)用將乳酸酯和3-羥基鏈烷酸酯分別轉(zhuǎn)化成乳酰輔酶A和3-羥基烷酰輔酶A的酶的基因以及使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因轉(zhuǎn)化不含有這兩種酶的細胞或者植物；(ii)用將乳酸酯和3-羥基鏈垸酸酯分別轉(zhuǎn)化成乳酰輔酶A和3-羥基烷酰輔酶A的酶的基因轉(zhuǎn)化含有使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因的細胞或者植物；或者(iii)用使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因轉(zhuǎn)化含有將乳酸酯和3-羥基鏈垸酸酯分別轉(zhuǎn)化成乳酰輔酶A和3-羥基烷酰輔酶A的酶的基因的細胞或者植物。但是，本發(fā)明的范圍并不限定于上述具體實例。同時含有將乳酸酯和3-羥基鏈烷酸酯分別轉(zhuǎn)化成乳酰輔酶A和3-羥基烷酰輔酶A的酶的基因、PHA合酶基因和將3-羥基鏈垸酸酯轉(zhuǎn)化成3-羥基烷酰輔酶A的酶的基因的細胞或者植物可以通過如下方法得到(i)用使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因和將3-羥基鏈垸酸酯轉(zhuǎn)化成3-羥基垸酰輔酶A的酶的基因轉(zhuǎn)化含有將乳酸酯和3-羥基鏈烷酸酯分別轉(zhuǎn)化成乳酰輔酶A和3-羥基垸酰輔酶A的酶的基因的細胞或者植物；(ii)用將乳酸酯和3-羥基鏈烷酸酯分別轉(zhuǎn)化成乳酰輔酶A和3-羥基垸酰輔酶A的酶的基因以及將3-羥基鏈烷酸酯轉(zhuǎn)化成3-羥基烷酰輔酶A的基因轉(zhuǎn)化含有使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因的細胞或者植物；(iii)用將乳酸酯和3-羥基鏈垸酸酯分別轉(zhuǎn)化成乳酰輔酶A和3-羥基垸酰輔酶A的酶的基因以及使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因轉(zhuǎn)化含有將3-羥基鏈垸酸酯轉(zhuǎn)化成3-羥基烷酰輔酶A的酶的基因的細胞或者植物；(iv)用將3-羥基鏈烷酸酯轉(zhuǎn)化成3-羥基烷酰輔酶A的酶的基因轉(zhuǎn)化含有將乳酸酯和3-羥基鏈烷酸酯分別轉(zhuǎn)化成乳酰輔酶A和3-羥基烷酰輔酶A的酶的基因以及使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因的細胞或者植物；(v)用將乳酸酯和3-羥基鏈烷酸酯分別轉(zhuǎn)化成乳酰輔酶A和3-羥基垸酰輔酶A的酶的基因轉(zhuǎn)化含有將3-羥基鏈烷酸酯轉(zhuǎn)化成3-羥基垸酰輔酶A的酶的基因以及使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因的細胞或者植物；或者(vi)用使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因轉(zhuǎn)化含有將3-羥基鏈烷酸酯轉(zhuǎn)化成3-羥基垸酰輔酶A的酶的基因以及將乳酸酯和3-羥基鏈垸酸酯分別轉(zhuǎn)化成乳酰輔酶A和3-羥基烷酰輔酶A的酶的基因的細胞或者植物。然而，本發(fā)明的范圍并不限于上述具體實例。在本發(fā)明中，3-羥基鏈垸酸酯優(yōu)選為選自由3-羥基丁酸酯、3-羥基戊酸酯、3-羥基丙酸酯和MCL3-羥基鏈垸酸酯組成的組中的至少一種，并且，MCL3-羥基鏈烷酸酯優(yōu)選為具有612個碳原子的羥基鏈烷酸酯。更具體地，MCL3-羥基鏈垸酸酯優(yōu)選為3-羥基己酸酯(3HHx)、3-羥基庚酸酯(3HHp)、3-羥基辛酸酯(3HO)、3-羥基壬酸酯(3HN)、3-羥基癸酸酯(3HD)、3-羥基十一垸酸酯(3HUD)、3-羥基十二烷酸酯(3HDD)及其混合物。而且，可用包含p"基因的重組載體轉(zhuǎn)化細胞或者植物。同時，可用包含/7/z"C的載體轉(zhuǎn)化細胞或者植物，或者phaC被插入染色體中。另外，在編碼其底物為乳酰輔酶A的PHA合酶的基因為p/zaC的情況下，可用包含p"基因的重組載體轉(zhuǎn)化細胞或者植物。同時，用包含p/2"C的載體轉(zhuǎn)化細胞或者植物，或者phaC被插入染色體中。如本領(lǐng)域中所公知的，多種微生物具有編碼PHA合酶的基因(第10-250830號韓國專利)。以下是這種微生物的實例包括無色桿菌(Jc/wwwo&acter木糖氧化無色桿菌04c/zrawokcferxy/oson'(i(ms)等的無色桿菌屬04c/zramok^w)微生物；不動桿菌屬(ic&etoZ^cfer)微生物，所述不動桿菌屬包括德氏食酸菌(v4c油voraxcfe/q/e她〕、敏捷食酸菌04"Vforax聲"7/s)、不動桿菌(Jc/"eto6ac&r>sp.」、乙酸!丐不動桿菌(^4"'"eto6"Cerca/coacericws)、魯氏不動桿菌(」c/7^tokcfer/wo力/)等；氣單胞菌屬G4eramo"os)微生物，所述氣單胞菌屬包括放線菌(j"/MO附戸S5p.)、豚鼠氣單胞菌(v4，腳""5C謂'—、嗜7乂氣單胞菌04^xw7。"os/z_y<iro//2//a)、希魚圭氣單胞菌(^4ero附o"asS(3/mo"/c/(ia)等；產(chǎn)堿菌屬(^/(^//^^力微生物，所述產(chǎn)堿菌屬包括海水產(chǎn)堿菌04/^//^""aeWMS)、反石肖/[七產(chǎn)堿菌(^4/03//《6"&cfe""r折cara1)、富養(yǎng)產(chǎn)堿菌(/4/ca/ge"asewfra//zw力(其被命名為富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(io^tom'aewrop/w)之后，又被命名為,她ra/agw的//za、類產(chǎn)減菌(」/ca/扭"as々ec(afe)、廣泛產(chǎn)減菌(y4/ca/扭"a、太平洋鹽單胞菌(v4/ca/扭"a/ac折c—、爭論貪噬菌(J/caZ/ge""/"ra(iams1)、美剛鹽單胞菌G4/ca/扭wasvewas加)等；可變桿菌屬(Jmoe6o6ac欣)微生物，所述可變桿菌屬包括麥?zhǔn)辖惶鎲伟?J/feramo"osmac/eo&0、玫瑰色可變桿菌04腳e6o6a"erras—，懸掛可變桿菌(y4腳e6o6a"erpe"(iera)等；固氮螺菌屬G4zas//n7/Mm)微生物，所述固氮螺菌屬包括^7/w"oca;a平)、jp/z""c^/zecg自養(yǎng)7jC蟲累菌(^4《was//r/〃w附awfo/rc;p/^cM附)、蓬瘤固氣豐艮瘤菌(^zor/z/zo6/w附cflw/ZwodaTW)、固氣蟲累菌(y4zos//r/〃ww5^.)、巴西固氣蟲累菌(y4zos7zW〃wm6raw7erae)、生月旨固氮螺菌(^4zoy/zW〃ww/j^o/^raw)等；固氮菌屬04zoto6acteO微生物，所述固氮菌屬包括固氮菌(Jzoto^"ww.)、敏捷固氮菌(^zotoZ)ac^喂7/力、褐球固氮菌(Aoto6ac^c/zraococc薩)、巨胞氮單胞菌(Jzoto6acter附acraqytoge"&s)、瓦恩蘭德固氮菌(y4zoto6acferWwe/朋t/")等；芽孢桿菌屬^""7/w)微生物，所述芽孢桿菌屬包括炭疽芽孢桿菌(B"C///2^a"f/zrac&)、蠟樣芽f包桿菌(5ac/〃w、巨獸芽f包木干菌(5"c〃/附附egafen'w附)、禾古草芽孢桿菌(5ac/〃wssw6"〃w力、蘇云金芽孢桿菌(5ac/〃"sAwn》g/era/力等；包括貝日阿托氏菌(5e級/ato"平)、白色貝日阿托氏菌(5egg/atoa"/6力等的貝日阿托氏菌屬(5"*^0力微生物；包括印度拜葉林克氏菌CSez)'en'"cA:/a/w//cus)、運動拜口十林克氏菌(Sez).gW"cAifl附。Zn7/力等的拜葉林克氏菌屬CS^eW"cA:/a)微生物；包括需鈉弧菌CSe恥cfea"aWgms)、海利斯頓氏菌(5e"ecfeape/ag/a)等的弧菌屬CSe"ecA:ea)微生物；柄桿菌屬(Caw/o6acte。微生物，所述柄桿菌屬包括百日咳鮑特氏菌(Bonfefe//ape^/M^)、日本慢生根瘤菌(5廠"<^,/^0&/1/7j'qpom.cwm),闊核菌(G3^o//za附o"/a加m)、桿狀柄桿菌(Qzw/o6ac^6ac/era/(i&s)、新月柄桿菌(G3w/o6ac^cmce"加)等；包括橙色綠屈撓菌(C7z/ora/7emsawra"/z'ac—、佛氏綠膠藻(C7z/orag7oea^WtocM)等的綠膠藻屬(Oz/orag/oea)微生物；著色菌屬(C7zrama^m)微生物，所述著色菌屬包括最細著色菌(C7zra附ariw附wz'"wfew'wwm)、奧氏著色菌(C7zra附ariw附ofe"")、微》顯著色菌(C7zro/wariwwfe/z'(iwm)等；包中舌紫色色桿菌(CTzrawc^acfen'wwv/o/acewm)等的色桿菌屬(C72ramo&c^7'wm)微生物；包括肉毒梭菌(C/oWn'<i/wm6oftJ/"wm)、模狀梭菌(C7os^7.(i/Mmsp/zewo/cfes1)等白勺梭菌屬(C7o坩Ww附)微生物；包括食酸叢毛單胞菌(Comamo"^acWovora"力、睪丸酮叢毛單胞菌(Comamomwtestos&ram〕等的叢毛單胞菌屬(Comamo"os)微生物；包括自養(yǎng)棒桿菌(Co^yweZ)(3cfeWMm"Mto加//z/c,)、Co^ywe6aCm'ww/^draca^ox;^ara等的棒桿菌屬(Coo^&acten^m)微生物；包括藍細菌(Cy""okcfer/a)、膠德克其j氏菌(Den:z'ag謂附asa)等的德克其J氏菌屬(Z)erx/a)微生物；包括雜食脫硫球菌(￡>&^//0^0"1mw/"vorara)、居泥脫硫線菌(Z)asM^/b"ewa//附/co/a)、巨大月兌硫線菌(Z)esw^/b"e附(3附agww附)等的月兌硫線菌屬(￡)&^//0"6附")微生物；外硫紅螺菌屬(五"oAz'w^O(iasp/ra)微生物，所述外硫紅螺菌屬包括可變脫硫八疊球菌(￡^1///0^^""vaW"^7&)、食皂脫硫弧菌(Dasw^/bv/Z^/osa/ovora—、鹽綠夕卜硫紅螺菌(五ctof/z/o;^ot/o，'ra/za/oc/z/on》、運動夕卜硫紅螺菌(五"oA/o^c^os;/rawc^'/^)、小空泡夕卜硫紅螺菌(五c欣/zz'w/zoiiasp/ravacwo/ata)等；鹽桿菌屬(ffo/o6"cfen'ww)微生物，所述鹽桿菌包括氧化亞鐵鐵桿菌(i^ra6fl"'〃z^y^rox油ra)、黃桿菌(F/"votecfen'謂》荒感嗜血菌(T/agwcip/n'/ws/"^/7we"zae)、吉氏鹽桿菌(//a/o6acfen'w附g/6Zo服'0、沃氏鹽桿菌(/7a/o6acteW謂vo/caw7)等；氫噬胞菌屬(i/j^ra^wop/zaga)微生物，所述氫噬胞菌屬包括地中海富鹽菌(Z^/o/erax附Wferra"ez')、網(wǎng)姨藻(場t/racto/zra加cto/zra加)、易捷氫單胞菌(/fy<irage"owo"as々"7&)、黃色氫噬胞菌(/^iroge"o//2aga/7ava)、類黃色氫噬胞菌(/^<irage"c!p/2aga戸ew^/7ava)、螺紋噬氫菌(/^/rage"o//zagatoe"/os;z'rafc)等；包括普通生絲微菌(i/j^/zomfcraZ)/wmvw/gwe)等的生絲微菌屬(//;^/20照'craZ^w)微生物；甲基桿菌屬(MW/^/^cfen'ww)微生物，所述甲基桿菌包括德氏泥桿菌(/(v。6afer(ie/a/Ze/(i//)、單~"雙頭菌(丄a6^s附o"ac/zw力、杉g紅色閃囊菌(丄"mpra，tomseo/era/c/w")、透明俊片菌(丄ampra/Wa/z_ya//"e)、軍團菌(丄eg/o"e〃(3sp.)、盤狀纟千發(fā)菌(丄epto^2r/x(i&cop/zorw力、甲基木干菌AMI(jWe^y/Za"eWwmy!MT),扭托甲基桿菌(iW^/^/6acfen'wmexto^wera)等；甲基彎曲菌屬(M^/0^2—微生物，所述甲基彎曲菌屬包括嗜熱甲基球菌(Afe^y/ococcws//^"附0//7^)、小甲基孢囊菌(Afe/Z2/ocjKsfeparvus)、甲烷甲基單胞菌(A/ef/zy/owo"asW7e//zaw/ca)、生f包甲基彎曲菌(Afe^^/os7."t^5pon.wm)、發(fā)孢甲基彎曲菌(Me鄉(xiāng)/os7,wwsWc/zos/o〃'應(yīng))等；包括Me鄉(xiāng)/oW6n'osoe/z"gem7、脫氮微球菌(M/cracoc，(i簡Y,cara)、鹽脫氮微球菌(M/cracoc，/w/o^mYn^cara)等的微球菌屬(Tl^cracocciw)微生物；包括白色分枝桿菌(A^co6acfer/wma/Zw柳)，母牛分豐支桿菌(^fycoZacten'w附vacae)等白勺分豐支木干菌屬(MycoZ)ac^7't/附)微生物；包括活躍硝化桿菌(A^ra6acterag/fc)、維氏硝化桿菌(MYraZ)acfervw力ogra^^y/)等的硝化桿菌屬(A^ra&cter)微生物；諾卡氏菌屬(7Voc"Wa)微生物，所述諾卡氏菌屬包括白色諾卡氏菌(iVocaWa"仿")、星狀諾卡氏菌(7VocaWaasteraz'(is)、7VocaWa/w"Wa、紅色諾卡氏菌(iVocaWarw6ra)等；發(fā)光桿菌屬(P/zoto6^^Wi/m)微生物，所述發(fā)光桿菌屬包括脫氮副球菌(Paracocci^cfew^7ycara)、泥生顫藻((9sc/〃(3toWa//mosa)、圓弧青霉菌(尸ew/c/〃/w附c少c/opz'ww)、尸/zofo6a"en'wmmawcfa/a附e"iS7'^、明亮發(fā)光桿菌(尸/zoto6acfen'謹//205p/2We謂)等；假單胞菌屬(尸"M6fo脂"OS)微生物，所述假單胞菌屬包括多頭絨泡菌CP/z^wwmpfo_yc^/za/Mm)和格氏假單胞菌(尸MMtfo附o"ayg/fl/Zzez')、產(chǎn)青定福牛各斯氏菌(i^gMfifo附o"os/"Ag。y^ra)、(Pwt/(icw7o"as1/e附ow'en')、鼻疽伯克霍爾德氏菌(/^e"(icwzo"as附a〃e/)、海洋鹽單胞菌(尸ww^fo附o"oy附flr/wa)、混合假單胞菌(i^ewi/o附o"os/m'xta)、食油假單胞菌(尸化W(io附owaso/eovora—、i^Wiiomowasoxa/a^cw"類產(chǎn)減假單胞菌(i^ewcfo附0"as1戸e"(ioa/ca/扭"ay)、銅綠假單胞菌(尸5^W(io附o"asaen^"asa)、產(chǎn)堿假單胞菌(尸MW(iowo"as1fl/ca//ge"as)、鐵角蕨假單胞菌(尸化wt/cwo"osayp/e"")、尸"W(io附o"as6wto"owra、洋蔥伯克霍爾德氏菌(i^ewdomo"os1ce;"c/fl)、暈斑假單胞菌(尸化^/o附o"oscora"q/^c/era)、德阿昆哈假單胞菌(/^ewdo膨was(iacww/z(3e),脫氮假單胞菌(尸化i^o,wos1<iem'^7yc<ms)、微小假單胞菌Cf^ewfifo附o"as^附z'"wto)、朿jJ狀假單胞菌(尸化wfifo附o"asec/zf"oz.(ies)、熒光假單胞菌CP化wdcw20"as^/7womscera)、惡臭假單胞菌CPsewdo附o"as/w"(ia)、紅紋假單胞菌CPse"(io附o"ayrwZrz7/weow)、嗜糖假單胞菌(尸sei^owo"osracc/zarap///")、施氏{叚單胞菌(i^ewcfomo"osWwteen〕、丁香假單胞菌sjn'"gae)、嗜熱假單胞菌(i^ew(io附o"asf/7er附op/n7w力、綠黃假單胞菌CP^W6fowowoyvzW^;/7aw0等；羅爾斯通氏菌屬(ia/stomVO微生物；根瘤菌屬(A/z/zo&ww)微生物，所述根瘤菌屬包括i/z/zc^wm/^辦raram、羽扇豆根瘤菌(i/2/zc^t/m/w;/w〕、苜蓿中華根瘤菌(i/^oZ/wwwe///o//)、菜豆根瘤菌(i/zfeo^w附p/zoyeo//)、三葉草根瘤菌(A/zizo^wm^/b/z')等；紅極毛細菌屬(i/z^/o6a"7/w力微生物；包括莢膜紅細菌(i/zc^o^cfercapw/a^s)、類球紅細菌(//20^^a"w^/^era/^y)等的紅細菌屬(i^ocfokc^O微生物；包括紫紅紅球菌(i/20cfococcwr/z^/oc/2raw)等的紅球菌屬(i/206tococc^)微生物；包括膠狀紅環(huán)菌(i/zocfo(^c/wge/a""osw力、纖細紅環(huán)菌(i/zocfoqyc/w^"w/》等的紅環(huán)菌屬(i/zocfocj;c/w力微生物；包括萬尼氏紅微菌(i/2odom/craWwmv朋wWz7)和嗜酸紅假單胞菌(i/2。(io戸M(io腳"as腦WopMa)、莢膜紅假單胞菌(7/zo(io戸gW(io附o"ayca/ww/ato)等的紅假單胞菌屬(i/2cxio^ewcfcwo"as)微生物；包括莫氏紅螺菌(7/zo^w//W〃wwmofec/n'a"wm)、深紅紅螺菌(i/zo^w/^W〃wmn^n/m)等的紅螺菌屬(i/zodoypzW〃iw7)微生物；包括少動鞘氨醇單胞菌(5^/h'"gomowospawc/woZ^//"、S//n.〃ww"ersom//、蛇形蟲累菌(^/nY/ww^^^"力等的螺菌屬(5^>///"附)微生物；包括方胞螺旋藻OS^V"/z'"力e""m')、極大螺旋藻(5^/nz/f""扁x/扁)、鹽澤螺旋藻(加>"http://"<3swfe"A:—等的螺旋藻屬(浙rw/,"a)微生物；包括金黃色葡萄球菌0S鄉(xiāng)/3y/ococ，a騰—、表皮葡萄球菌(5y"http://^/。coccuyepzVier附/cfc)、木糖葡萄球菌(5!to//i[v7ococcw51"/osws)等的葡萄球菌屬CSto//^/ococcw)微生物；包括土壤星狀菌(5^//"/^附0^)、氣泡星狀菌(5^//"vacwo/ato)等的星狀菌屬(<Ste//a)微生物；包括抗生鏈霉菌(iS^re//o附y(tǒng)casa""Z)/o&cus0、天藍色鏈球菌(沒7^/tomycaycoe/ifco/o"等的鏈霉菌屬OS^ptom;^力微生物；硫桿菌屬(77z/o6ac/〃w)微生物，所述硫桿菌屬包括沃氏共養(yǎng)單胞菌(5y"frap/zowo"aywo//d)、嗜熱藍細菌(777em7o//7///cqy"wo6acte"'a),嗜熱棲熱菌(77^wwsAermopM—、硫桿菌A2(77h'oZ^"'〃wv42)、嗜酸硫桿菌(T72/o6""'〃wsac油/M—、善變硫桿菌(777/o6ac/〃wsveraw加)等；包括普氏莢硫菌(77^cfl戸a/^"w^7)等的莢硫菌屬(r/z/oc"/wa)微生物；動膠菌屬(Zoog/oea)微生物，所述動膠菌屬包括紫囊硫菌(J7zz'oq^feWo/ace")、畐'J溶血弓瓜菌(H6n'opara/ae附o(y"cws)、自養(yǎng)黃色木干菌(Xa"Ao6acferawtofrap/z/cus)、嗜麥芽黃單胞菌(Xa"/20脂"as應(yīng)/鄉(xiāng)M/a)、生枝動膠菌優(yōu)選地，本發(fā)明的聚羥基鏈垸酸酯(PHA)合酶基因為源自假單胞菌6-19的phaClps6.19。更優(yōu)選地，PHA合酶基因編碼具有如下突變的SEQIDNO:8的氨基酸序列a)S325T和Q481M;b)E130D和Q481K;c)S325T和Q481K;d)E130D和Q481M;e)E130D和Q481R;f)E130D、S325T和Q481M;g)E130D、S325T和Q481K;h)E130D、S477R和Q481K;i)E130D、S477R和Q481M;j)E130D、S477R和Q481R;k)E130D、S477H和Q481K;1)E130D、S477H和Q481M;m)E130D、S477H和Q481R;n)E130D、S477F和Q481K;0)E130D、S477F和Q481M;p)E130D、S477F和Q481R;q)E130D、S477Y和Q481K;r)E130D、S477Y和Q481M;s)E130D、S477Y和Q481R;t)E130D、S325T、S477R和Q481M;u)E130D、S325T、S477R和Q481K;v)E130D、S325T、S477F和Q481M;w)E130D、S325T、S477G和Q481M;或者x)E130D、S325T、S477F和Q481K。在使用乳酰輔酶A作為底物的情況下，這些PHA合酶突變體是更優(yōu)選的。在本發(fā)明中，同時含有將乳酸酯和3-羥基鏈烷酸酯分別轉(zhuǎn)化成乳酰輔酶A和3-羥基烷酰輔酶A的酶的基因和聚羥基鏈烷酸酯(PHA)合酶基因的細胞或者植物可以在包含3-羥基鏈垸酸酯的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以生成本發(fā)明的共聚物。如果所述細胞或者植物可以從如葡萄糖、檸檬酸等的其它碳源生物合成乳酸酯和3-羥基鏈垸酸酯，則可以不需要向培養(yǎng)基中進一步加入3-羥基鏈烷酸酯、乳酸酯等。用于制備包含轉(zhuǎn)移酶基因和合酶基因的植物的植物轉(zhuǎn)化可以使用農(nóng)桿菌或者病毒載體通過常規(guī)方法完成。例如，通過用包含本發(fā)明的基因的重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并且用轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌感染目標(biāo)植物的組織等而獲得轉(zhuǎn)化的植物。更具體而言，可以通過如下步驟制備轉(zhuǎn)化的植物預(yù)培養(yǎng)所需植物的外植體，然后通過共培養(yǎng)該外植體和轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化外植體；培養(yǎng)所述感染的外植體以誘導(dǎo)愈傷組織；以及激活所得到的愈傷組織，并且將其在生芽培在此使用的術(shù)語"外植體"是指從植物上切割的組織片段，且包括子葉或下胚軸。子葉或下胚軸可用作本發(fā)明的外植體。更優(yōu)選使用通過對植物的種子消毒和清洗，并使其在MS培養(yǎng)基中萌芽而獲得的子葉。用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的植物包括，但不限于，煙草、番茄、紅椒、豆類、水稻和玉米。而且，即使轉(zhuǎn)化的植物是有性繁殖的，這種植物也能夠通過使用植物組織培養(yǎng)等而被無性繁殖，這對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。圖1為同時表達PHA合酶和CP-PCT的組成型表達操縱子系統(tǒng)的簡單圖圖2為根據(jù)本發(fā)明的包含PHA合酶基因和CP-PCT基因的重組質(zhì)粒pPs619C1300-CPPCT的基因圖。圖3為根據(jù)本發(fā)明的包含PHA合酶基因和CP-PCT基因的重組質(zhì)粒pTacCpPctNCvEC的基因圖。圖4為包含富養(yǎng)羅爾斯通氏菌的phaA和phaB基因的重組質(zhì)粒pMCS104ReAB的基因圖。圖5為通過用pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌制備的P(3HB-共-MCLPHA-共-LA)三元共聚物的氣相色譜結(jié)果。圖6為通過用pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌制備的P(3HB-共-3HV-共-LA)三元共聚物的氣相色譜結(jié)果。具體實施例方式在下文中，將非常詳細地描述本發(fā)明。用示例說明的方式提供以下實施例是為了幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解本發(fā)明，但這些實施例并不意欲限制本發(fā)明的范圍。實施例l包含/"基因和PHA合酶基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建構(gòu)建包含p"基因和PHA合酶基因的重組質(zhì)粒，pPs619C1300-CPPCT和pTacCpPctNCvEC，以制備包含3-羥基鏈烷酸酯單元和乳酸酯單元的共聚物。(1)pPs619C1300-CPPCT質(zhì)粒的構(gòu)建使用源自丙酸梭菌(C/o*Wwmprap/om'c)的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(CP-PCT)基因作為p"基因，并且使用源自假單胞菌6-19的PHA合酶基因作為PHA合酶基因。如圖1構(gòu)建同時表達PHA合酶和CP-PCT的組成型表達系統(tǒng)的操縱子。CP-PCT對宿主微生物具有毒性是公知的。也就是說，在用IPTG誘導(dǎo)的tac啟動子或T7后動子表達系統(tǒng)中(這個系統(tǒng)廣泛用于重組蛋白質(zhì)的表達)，在加入誘導(dǎo)物之后，所有的微生物不久即死亡。基因此原因，認為使用弱表達的，但是隨著微生物的生長持續(xù)表達的表達系統(tǒng)是適合的。CP-PCT基因是使用丙酸梭菌(DSM1682)的染色體DNA作為模板以及基于/rf基因序列制成的SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的引物通過PCR獲得的(Selmer等人，￡wJ5/oc/zem.，269:372，2002)。SEQIDNO:1:5-ggaattcATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGASEQIDNO:2:5-gctctagattaggacttcatttccttcagacccattaagccttctg為了容易克隆，用SDM方法除去野生的CP-PCT的A^el限制酶切位點。另外，用SEQIDNO:3和4引物進行重疊PCR以便增加幼,A^1識別位點。SEQIDNO:3:5-aggcctgcaggcggataacaatttcacacagg-3SEQIDNO:4:5-gcccatatgtctagattaggacttcatttcc國3為了分離源于假單胞菌6-19的PHA合酶基因(phaClpsW9)(KCTCU027BP)，提取假單胞菌6-19的總DNA，并且基于phaClp^9基因序列制備SEQIDNO:5和6的引物(Ae-jinSong，碩士論文，化學(xué)和生物分子工程系，KAIST，2004)，進行PCR以得到phaClps6.i9基因。phaClpsW9基因的核苷酸序列在SEQIDNO:7中示出，從該序列分析的氨基酸序列在SEQIDNO:8中示出。SEQIDNO:5:5-GAGAGACAATCAAATCATGAGTAACAAGAGTAACG-3SEQIDNO:6:5-CACTCATGCAAGCGTCACCGTTCGTGCACGTAC-3將以上獲得的phaClpsW9基因插入pBluescriptII(Stratagene公司，美國)的BstBI/Sbfl位點，以制得pPs619Cl重組載體。用SDM(定點突變)法除去包含在其中的BstBI位點而沒有氨基酸的突變，以制成僅兩端具有兩個BstBI/Sbfl位點的phaClp^9合酶基因片段，并且用SEQIDNO:9和10，SEQIDNO:11禾卩12以及SEQIDNO:13和14的引物進行重疊PCR，以便增加BstBI/Sbfl識別點。SEQIDNO:9:5-atgcccggagccggttegaa-3SEQIDNO:10:5-CGTTACTCTTGTTACTCATGATTTGATTGTCTCTC-3SEQIDNO:11:5-GAGAGACAATCAAATCATGAGTAACAAGAGTAACG-3SEQIDNO:12:5-CACTCATGCAAGCGTCACCGTTCGTGCACGTACSEQIDNO:13:5-GTACGTGCACGAACGGTGACGCTTGCATGAGTG-3SEQIDNO:14:5-aacgggagggaacctgcagg-3通過氨基酸序列對比分析發(fā)現(xiàn)了影響phaClPs6_19合酶的SCL(短鏈長度PHA)合成活性的氨基酸的三個位置(130，325和481)，并且使用SEQIDNO:15/16,17/18和19/20的引物通過SDM方法構(gòu)建包含編碼在phaClp^9合酶氨基酸序列中具有E130D、S325T和Q481M突變的突變體基因的pPs619C1300(圖1)。所述phaClp^9合酶突變體示于下表1中。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>SEQIDNO:15:5-ateaacetcatgaccgatgcgatggcgccgacc-3■SEQIDNO:16:5-ggteggcgccatcgcateggtcatgaggttgat-3SEQIDNO:17:5-CTGACCTTGCTGGTGACCGTGCTTGATACCACC-SEQIDNO:18:5-GGTGGTATCAAGCACGGTCACCAGCAAGGTCAG-3SEQIDNO:19:5-CGAGCAGCGGGCATATCATGAGCATCCTGAACCCGC-3SEQIDNO:20:5-GCGGGTTCAGGATGCTCATGATATGCCCGCTGCTCG-3用S^/I/AWel酶切獲得的pPs619C1300載體，并將克隆的CP-PCT基因插入幼,A^el識別位點以構(gòu)建pPs619C1300-CPPCT重組載體(圖2)。(2)pMCS104ReAB的構(gòu)建構(gòu)建質(zhì)粒pMCS104ReAB以提供源自富養(yǎng)羅爾斯通氏菌的a-酮硫解酶(PhaA)和乙酰乙酰輔酶A還原酶(PhaB)(Si-JaePark，博士論文，化學(xué)和生物分子工程系，KAIST，2003)。用Pstl切割pSYL105(Lee等人.5z'ofec/z"o/.44:1337,1994)以得到phaAB基因，將phaAB基因插入pl0499A的Pstl切割位點(Park等人，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.,214:217，2002)以構(gòu)建pl0499PhaAB。用Sspl切割pl0499PhaAB質(zhì)粒以得到包含104啟動子和phaAB基因的片段，并將該片段插入pBBRlMCS質(zhì)粒的EcoRV酶切位點以得到pMCS104ReAB質(zhì)粒(圖4)。(3)pTacCpPctNCvEC質(zhì)粒的構(gòu)建用切割pTac99A載體(ParkandLee,Bfl"en'o/.185,5391-5397,2003)以得到包含Tac啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子的基因片段，并且將該片段插入用限制酶％/酶切的pTrc99A(PharmaciaBiotech,瑞典)中以得到pTaclac載體。用酒色著色菌(C/7rama"Mmvf"o^m)(DSMZ180)的染色體DNA作為模板以及SEQIDNO:21和22的引物擴增phaEC基因。SEQIDNO:21:ggaaatccatATGACGATGTTCTCGCTCATGGCGSEQIDNO:22:ggaaatccatatgatecagggccactatetccaactg將擴增的/^a￡C基因插入pTaclac載體的A^el-酶切位點以得到pTaclacNCvEC載體。另夕卜，通過用EcoRI/Xbal切割pPs619C1300-CPPCT而獲得基因，并將p"基因插入pTaclacNCvEC的EcoRI/Xbal切割位點以得到pTacCpPctNCvEC(圖3)。實施例2:MCL3-羥基鏈烷酸酯-乳酸酯共聚物的制備用在實施例1中構(gòu)建的、包含p"基因和PHA合酶基因的重組質(zhì)粒pPs619C1300-CPPCT轉(zhuǎn)化大腸桿菌WB101(Park和Lee,J.Bacteriol.185,5391-5397,2003)，以獲得大腸桿菌WB101/pPs619C1300-CPPCT。據(jù)報道，WB101為在制備MCL-PHA中有效的fadB大腸桿菌突變體(第10-0447531號韓國專利)。通過以下兩個步驟對轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)以得到MCL3-羥基鏈烷酸酯-乳酸酯共聚物首先，在包含100mg/L氨芐青霉素的100mLLB培養(yǎng)基(Bactc)TM胰胨(BD)10g/L、BactoTM酵母提取物(BD)5g/L、NaCl(amresco)10g/L)中，將轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌WB101/pPs619C1300-CPPCT培養(yǎng)24小時，然后在4°C、lOOOg下將培養(yǎng)基離心15分鐘收集細胞。在另外包含10g/L葡萄糖、2g/L癸酸鈉和100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(BactoTM胰胨(BD)10g/L、Bacto酵母提取物(BD)5g/L、NaCl(amresco)10g/L)中，將收集的細胞厭氧培養(yǎng)3天。在4"C、1000g下將培養(yǎng)基離心15分鐘收集細胞，用大量的蒸餾水洗滌細胞4次并在8(TC下干燥12小時。將完全干燥的細胞進行定量，并在氯仿溶劑中于硫酸催化劑的條件下在IO(TC下與甲醇反應(yīng)。在室溫下將一半體積的蒸餾水加入到氯仿中并混合。然后將混合物沉淀直至分成兩層。在兩層中，收集溶解有甲基化單體的氯仿層，并用氣相色譜法分析聚合物的成分。苯甲酸酯用作內(nèi)標(biāo)物。分析結(jié)果表明，在大腸桿菌WB101/pPs619C1300-CPPCT轉(zhuǎn)化體中測出甲基-3-羥基癸酸酯(metyl-3-hydrodecanoate)和甲基-乳酸酯，這表明用重組大腸桿菌制備了MCL3-羥基鏈烷酸酯-乳酸酯共聚物[聚(MCL3-羥基鏈垸酸酯-共-乳酸酯)]。實施例3:3-羥基丁酸酯-MCL3-羥基鏈烷酸酯-乳酸酯三元共聚物的制備用在實施例1中構(gòu)建的、包含prf基因和PHA合酶基因的重組質(zhì)粒pPs619C1300-CPPCT轉(zhuǎn)化大腸桿菌WB101[W3110(/^/_S.vXw)Park和Lee,丄Bacteriol.185:5391,2003]，以獲得大腸桿菌WB101/pPs619C1300-CPPCT。據(jù)報道，WB101為在制備MCL-PHA中有效的fadB大腸桿菌突變體(第10-0447531號韓國專利)。通過以下兩個步驟對轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)以得到3-羥基丁酸酯-MCL3-羥基鏈垸酸酯-乳酸酯三元共聚物首先，在包含100mg/L氨芐青霉素的100mLLB培養(yǎng)基(BactoTM胰胨(BD)10g/L、Bacto酵母提取物(BD)5g/L、NaCl(amresco)10g/L)中，將轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌WB101/pPs619C1300-CPPCT培養(yǎng)24小時，然后在4"C、1000g下將培養(yǎng)基離心15分鐘收集細胞。在另外包含1g/L3-羥基丁酸酯、2g/L癸酸鈉和100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(BactoTM胰胨(BD)10g/L、Bacto酵母提取物(BD)5g/L、NaCl(amresco)10g/L)中，將收集的細胞厭氧培養(yǎng)3天。另外，用pPs619C1300-CPPCT和pMCS104ReAB轉(zhuǎn)化大腸桿菌WB101以得到大腸桿菌WB101/pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB。通過以下兩個步驟對大腸桿菌WB101/pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB進行培養(yǎng)以得到3-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯-乳酸酯三元共聚物首先，在包含100mg/L氨芐青霉素和30mg/L氯霉素的100mLLB培養(yǎng)基(BactoTM胰胨(BD)10g/L、BactoTM酵母提取物(BD)5g/L、NaCl(amresco)10g/L)中，將轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌WB101/pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB培養(yǎng)24小時，然后在4°C、1OOOg下將培養(yǎng)基離心15分鐘收集細胞。在另外包含1g/L3-羥基丁酸酯、2g/L癸酸鈉和100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，將收集的細胞厭氧培養(yǎng)3天。在4°C、lOOOg下將大腸桿菌WB101/pPs619C1300-CPPCT和大腸桿菌WB101/pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB的培養(yǎng)基離心15分鐘收集細胞，用大量的蒸餾水洗滌細胞4次并在80。C下干燥12小時。將完全干燥的細胞進行定量，并在氯仿溶劑中于硫酸催化劑的條件下在IO(TC下與甲醇反應(yīng)。在室溫下將一半體積的蒸餾水加入到氯仿中并混合。然后將混合物沉淀直至分成兩層。在兩層中，收集溶解有甲基化單體的氯仿層，并用氣相色譜法分析聚合物的成分。苯甲酸酯用作內(nèi)標(biāo)物。分析結(jié)果表明，在大腸桿菌WB101/pPs619C1300-CPPCT和大腸桿菌WB101/pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB轉(zhuǎn)化體中測出甲基-3-羥基丁酸酯、甲基-3-羥基癸酸酯和甲基-乳酸酯，這表明用這些重組大腸桿菌制備了3-羥基丁酸酯-MCL3-羥基鏈垸酸酯-乳酸酯三元共聚物[聚(3-羥基丁酸酯-共-MCL3-羥基鏈烷酸酉旨-共-乳酸酯)](圖5)。實施例4:3-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯-乳酸酯共聚物的制備用在實施例1中構(gòu)建的、包含p"基因和PHA合酶基因的重組質(zhì)粒pPs619C1300-CPPCT轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO(Invitrogen)，以獲得大腸桿菌Top10/pPs619C1300-CPPCT。通過以下兩個步驟對轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)以得到3-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯-乳酸酯三元共聚物首先，在包含100mg/L氨芐青霉素的100mLLB培養(yǎng)基(BactoTM胰胨(BD)10g/L、Bactc)TM酵母提取物(BD)5g/L、NaCl(amresco)10g/L)中，將轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌ToplO/pPs619C1300-CPPCT培養(yǎng)24小時，然后在4°C、1000g下將培養(yǎng)基離心15分鐘收集細胞。在另外包含1g/L3-羥基戊酸酯(3-HV)、1g/L3-羥基丁酸酯(3-HB)和100mg/L氨芐青霉素的MR培養(yǎng)基(每升葡萄糖10g、KH2P046.67g、(NH4)2HP044g、MgS047H200.8g、檸檬酸0.8g和痕量金屬溶液5mL;痕量金屬溶液組合物每升5MHC15mL、FeS04.7H2010g、CaCl22g、ZnS04'7H202.2g、MnS04-4H200.5g、CuS04.5H201g、(NH4)6Mo702.4H200.1g和Na2B4CVl0H2O0.02g)中，將收集的細胞厭氧培養(yǎng)3天。另外，用pPs619C1300-CPPCT禾npMCS104ReAB兩者轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO(Invitrogen)以得至lj大腸桿菌ToplO/pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB。通過以下兩個步驟對轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)以得到3-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯-乳酸酯三元共聚物首先，在包含100mg/L氨芐青霉素和30mg/L氯霉素的100mLLB培養(yǎng)基(BactoTM胰胨(BD)10g/L、Bactc)TM酵母提取物(BD)5g/L、NaCl(amresco)10g/L)中，將轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌ToplO/pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB培養(yǎng)24小時，然后在4°C、1000g下將培養(yǎng)基離心15分鐘收集細胞。在另外包含2g/L丙酸或2g/L戊酸、以及100mg/L氨芐青霉素和30mg/L氯霉素的MR培養(yǎng)基(每升葡萄糖10g、KH2P046.67g、(NH4)2HP044g、MgS(V7H200.8g、檸檬酸0.8g和痕量金屬溶液5mL;痕量金屬溶液組合物每升5MHC15mL、FeS04.7H2010g、CaCl22g、ZnS04.7H202.2g、MnS04.4H200.5g、CuS04-5H201g、(NH4)6Mo702.4H200.1g和Na2B4O2'10H2O0.02g)中，將收集的細胞厭氧培養(yǎng)3天。在4'C、1000g下將培養(yǎng)基離心15分鐘收集細胞，用大量的蒸餾水洗滌細胞4次并在8(TC下干燥12小時。將完全干燥的細胞進行定量，并在氯仿溶劑中于硫酸催化劑的條件下在IO(TC下與甲醇反應(yīng)。在室溫下將一半體積的蒸餾水加入到氯仿中并混合。然后將混合物沉淀直至分成兩層。在兩層中，收集溶解有甲基化單體的氯仿層，并用氣相色譜法分析聚合物的成分。苯甲酸酯用作內(nèi)標(biāo)物。分析結(jié)果表明，在大腸桿菌ToplO/pPs619C1300-CPPCT和ToplO/pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB中均測出甲基-3-羥基丁酸酯、甲基-3-羥基戊酸酯和甲基-乳酸酯，這表明用重組大腸桿菌制備了3-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯-乳酸酯三元共聚物[聚(3-羥基丁酸酯-共-3-羥基戊酸酯-共-乳酸酯)](圖6)。實施例5:3-羥基丙酸酯-乳酸酯共聚物的制備用在實施例1中構(gòu)建的、包含基因和PHA合酶基因的重組質(zhì)粒pPs619C1300-CPPCT轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO(Invitrogen)，以獲得大腸桿菌Top10/pPs619C13OO-CPPCT。通過以下兩個步驟對轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)以得到3-羥基丙酸酯-乳酸酯共聚物首先，在包含100mg/L氨芐青霉素的100mLLB培養(yǎng)基(BactoTM胰胨(BD)10g/L、Bact()TM酵母提取物(BD)5g/L、NaCl(amresco)10g/L)中，將轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌ToplO/pPs619C1300-CPPCT培養(yǎng)24小時，然后在4"、1000g下將培養(yǎng)基離心15分鐘收集細胞。在另外包含2g/L3-羥基丙酸酯(3-HP)和100mg/L氨芐青霉素的MR培養(yǎng)基(每升葡萄糖10g、KH2P046.67g、，(NH4)2HP044g、MgS047H200.8g、檸檬酸0.8g和痕量金屬溶液5mL;痕量金屬溶液組合物每升5MHC15mL、FeS04'7H2010g、CaCl22g、ZnS047H202.2g、MnS04.4H200.5g、CuS04.5H201g、(NH4)6Mo702'4H200.1g和Na2B4O2.10H2O0.02g)中，將收集的細胞厭氧培養(yǎng)3天。在4'C、1000g下將培養(yǎng)基離心15分鐘收集細胞，用大量的蒸餾水洗滌細胞4次并在8(TC下干燥12小時。將完全干燥的細胞進行定量，并在氯仿溶劑中于硫酸催化劑的條件下在IO(TC下與甲醇反應(yīng)。在室溫下將一半體積的蒸餾水加入到氯仿中并混合。然后將混合物沉淀直至分成兩層。在兩層中，收集溶解有甲基化單體的氯仿層，并用氣相色譜法分析聚合物的成分。苯甲酸酯用作內(nèi)標(biāo)物。分析結(jié)果表明，在大腸桿菌ToplO/pPs619C1300-CPPCT中測出甲基-3-羥基丙酸酯和甲基-乳酸酯，這表明用重組大腸桿菌制備了新的3-羥基丙酸酯-乳酸酯共聚物[聚(3-羥基丙酸酯-共-乳酸酯)]。實施例6:3-羥基丁酸酯-3-羥基丙酸酯-乳酸酯三元共聚物的制備用在實施例1中構(gòu)建的、包含基因和PHA合酶基因的重組質(zhì)粒pPs619C1300-CPPCT轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO(Invitrogen)，以獲得大腸桿菌Top10/pPs619C1300-CPPCT。通過以下兩個步驟對轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)以得到3-羥基丁酸酯-3-羥基丙酸酯-乳酸酯三元共聚物首先，在包含100mg/L氨芐青霉素的100mLLB培養(yǎng)基(BactoTM胰胨(BD)10g/L、BactoTM酵母提取物(BD)5g/L、NaCl(amresco)10g/L)中，將轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌ToplO/pPs619C1300-CPPCT培養(yǎng)24小時，然后在4°C、1000g下將培養(yǎng)基離心15分鐘收集細胞。在另外包含2g/L3-羥基丙酸酯(3-HP)、1g/L3-羥基丁酸酯(3-HB)和100mg/L氨芐青霉素的MR培養(yǎng)基(每升葡萄糖10g、KH2P046.67g、(NH4)2HP044g、MgS(V7H200.8g、檸檬酸0.8g和痕量金屬溶液5mL;痕量金屬溶液組合物每升5MHC15mL、FeS04.7H2010g、CaCl22g、ZnS04'7H202.2g、MnS04-4H200.5g、CuS045H201g、(NH4)6Mo702'4H200.1g和Na2B4O240H2O0.02g:^，將收集的細胞厭氧培養(yǎng)3天。在4"C、1000g下將培養(yǎng)基離心15分鐘收集細胞，用大量的蒸餾水洗滌細胞4次并在8(TC下干燥12小時。將完全干燥的細胞進行定量，并在氯仿溶劑中于硫酸催化劑的條件下在10(TC下與甲醇反應(yīng)。在室溫下將一半體積的蒸餾水加入到氯仿中并混合。然后將混合物沉淀直至分成兩層。在兩層中，收集溶解有甲基化單體的氯仿層，并用氣相色譜法分析聚合物的成分。苯甲酸酯用作內(nèi)標(biāo)物。分析結(jié)果表明，在大腸桿菌ToplO/pPs619C1300-CPPCT中測出甲基-3-羥基丙酸酯、甲基-3-羥基丁酸酯和甲基-乳酸酯，這表明用重組大腸桿菌制備了3-羥基丁酸酯-3-丙酸酯-乳酸酯三元共聚物[聚(3-羥基丁酸酯-共-羥基丙酸酯-共-乳酸酯)]。實施例7:多種突變體的制備如pPs619C1300的構(gòu)建一樣，用以下的引物制備了多種PHA合酶突變體。獲得的突變體在表2、3、4和5中示出。E130DSEQIDNO:15:5'-atcaacetcatgaccgatgcgatggcgccgacc-3'SEQIDNO:16:5'-ggteggcgccatcgcateggtcatgaggttgat-3'S325TSEQIDNO:17:5'-CTGACCTTGCTGGTGACCGTGCTTGATACCAces'SEQIDNO:18:5'畫GGTGGTATCAAGCACGGTCACCAGCAAGGTCAG-3'S477RSEQIDNO:23:SEQIDNO:24:S477HSEQIDNO:25:SEQIDNO:26:S477FSEQIDNO:27:SEQIDNO:28:S477YSEQIDNO:29:SEQIDNO:30:S477GSEQIDNO:31:SEQIDNO:32:Q481KSEQIDNO:33:SEQIDNO:34:Q481MSEQIDNO:35:SEQIDNO:36:-gaattcgtgctgtegagecgcgggcatatc畫3'-gatatgcccgcggetcgacagcacgaattc-3'畫gaattcgtgctgtegagecatgggcatate-3'-gatatgcccatggetcgacagcacgaattc-3'-gaattcgtgctgtegagetttgggcatate-3'-gatatgcccaaagetcgacagcacgaatte-3'-gaattcgtgctgtegagetatgggcatate-3'-gatatgcccatagetcgacagcacgaattc-3'畫gaattcgtgctgtegageggcgggcatate-3,-gatatgcccgccgetcgacagcacgaattc-3'-gggcatateaaaageatectgaacccgc-3'-gcgggtteaggatgcttttgatatgccc畫3'■gggcatateatgageatectgaacccgc-3'-gcgggtteaggatgcteatgatatgccc-3'<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實施例8:用多種突變體制備P(3HB-共-LA)如在實施例3中描述的方法一樣，構(gòu)建能夠表達源自假單胞菌6-19的PHA合酶突變體和丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌，并且該重組大腸桿菌用于制備P(3HB-共-LA)。結(jié)果在下表6、7和8中示出。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>如在表6、7和8中所示，用乳酰輔酶A作為底物，本發(fā)明的PHA合酶突變體有效地合成了乳酸酯共聚物。工業(yè)實用性如上所述和所證實的，本發(fā)明提供了一種包含3-羥基鏈垸酸酯單體單元和乳酸酯單體單元的共聚物。本發(fā)明還提供了一種制備該共聚物的方法，其中，該方法包括培養(yǎng)同時包含將乳酸酯和3-羥基鏈垸酸酯分別轉(zhuǎn)化為乳酰輔酶A和3-羥基烷酰輔酶A的酶的基因和聚羥基鏈烷酸酯(PHA)合酶基因的細胞或者植物的步驟。本發(fā)明的共聚物是能夠用于代替常規(guī)的合成塑料的生物可降解的聚合物，并且該共聚物還可用于醫(yī)療應(yīng)用。權(quán)利要求1、一種共聚物，其包含乳酸酯單體單元和3-羥基鏈烷酸酯單體單元。2、如權(quán)利要求1所述的共聚物，其中，所述3-羥基鏈烷酸酯為選自由3-羥基丁酸酯、3-羥基戊酸酯、3-羥基丙酸酯和中鏈長度(MCL)的3-羥基鏈垸酸酯組成的組中的至少一種。3、如權(quán)利要求1所述的共聚物，其中，所述中鏈長度(MCL)的3-羥基鏈垸酸酯為選自由3-羥基己酸酯(3HHx)、3-羥基庚酸酯(3HHp)、3-羥基辛酸酯(3HO)、3-羥基壬酸酯(3HN)、3-羥基癸酸酯(3HD)、3-羥基H^—垸酸酯(3HUD)和3-羥基十二烷酸酯(3HDD)組成的組中的至少一種。4、如權(quán)利要求1所述的共聚物，其中，所述共聚物為選自由MCL3-羥基鏈烷酸酯-乳酸酯共聚物(聚(MCL3-羥基鏈垸酸酯-共-乳酸酯))、3-羥基丁酸酯-中鏈長度(MCL)3-羥基鏈垸酸酯-乳酸酯三元共聚物(聚(3-羥基丁酸酯-共-MCL3-羥基鏈烷酸酯-共-乳酸酯))、3-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯-乳酸酯三元共聚物(聚(3-羥基丁酸酯-共-3-羥基戊酸酯-共-乳酸酯))、3-羥基丙酸酯-乳酸酯共聚物(聚(3-羥基丙酸酯-共-乳酸酯))和3-羥基丁酸酯-3-羥基丙酸酯-乳酸酯三元共聚物(聚(3-羥基丁酸酯-共-羥基丙酸酯-共-乳酸酯))組成的組中的至少一種。5、一種制備包含乳酸酯單體單元和3-羥基鏈烷酸酯單體單元的共聚物的方法，其中，該方法包括培養(yǎng)同時包含將乳酸酯和3-羥基鏈烷酸酯轉(zhuǎn)化為乳酰輔酶A和3-羥基烷酰輔酶A的酶的基因和聚羥基鏈垸酸酯(PHA)合酶基因的細胞或者植物的步驟。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述細胞或者植物是通過用將乳酸酯和3-羥基鏈烷酸酯分別轉(zhuǎn)化為乳酰輔酶A和3-羥基垸酰輔酶A的酶的基因，和/或使用乳酰輔酶A作為底物的聚羥基鏈烷酸酯(PHA)合酶的基因轉(zhuǎn)化不含有這兩種基因中的任何一種或兩種的細胞或植物而得到的。7、如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述將乳酸酯和3-羥基鏈烷酸酯分別轉(zhuǎn)化為乳酰輔酶A和3-羥基烷酰輔酶A的酶的基因為丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(pc/)。8、如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述聚羥基鏈垸酸酯(PHA)合酶基因為源自假單胞菌6-19的phaClps6.19。9、如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述PHA合酶基因編碼具有如下突變的SEQIDNO:8的氨基酸序列a)S325T和Q481M;b)E130D和Q481K;c)S325T和Q481K;d)E130D和Q481M;e)E130D和Q481R;f)E130D、S325T和Q481M;g)E130D、S325T和Q481K;h)E130D、S477R和Q481K;i)E130D、S477R和Q481M;j)E130D、S477R和Q481R;k)E130D、S477H和Q481K;1)E130D、S477H和Q481M;m)E130D、S477H和Q481R;n)E130D、S477F和Q481K;。)E130D、S477F和Q481M;p)E130D、S477F和Q481R;q)E130D、S477Y和Q481K;r)E130D、S477Y和Q481M;s)E130D、S477Y和Q481R;t)E130D、S325T、S477R和Q481M;u)E130D、S325T、S477R和Q481K;v)E130D、S325T、S477F和Q481M;w)E130D、S325T、S477G和Q481M;或者x)E130D、S325T、S477F和Q481K。10、如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述細胞或者植物進一步包含將3-羥基鏈垸酸酯轉(zhuǎn)化為3-羥基垸酰輔酶A的酶的基因。11、如權(quán)利要求IO所述的方法，其中，所述將3-羥基鏈垸酸酯轉(zhuǎn)化為3-羥基烷酰輔酶A的酶為a-酮硫解酶(PhaA)和/或乙酰乙酰輔酶A還原酶(PhaB)。12、如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述細胞為微生物。13、如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述微生物為大腸桿菌。14、如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述培養(yǎng)在包含3-羥基鏈烷酸酯(3-HA)的培養(yǎng)基中進行。15、如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述3-羥基鏈烷酸酯為選自由3-羥基丁酸酯、3-羥基戊酸酯、3-羥基丙酸酯和中鏈長度(MCL)3-羥基鏈烷酸酯組成的組中的至少一種。全文摘要本發(fā)明涉及一種包含3-羥基鏈烷酸酯單體單元和乳酸酯單體單元的共聚物或其制備方法。更具體而言，本發(fā)明涉及一種制備包含乳酸酯單體和3-羥基鏈烷酸酯單體的共聚物的方法以及由該方法制備的共聚物，其中，該方法包括培養(yǎng)同時包含將乳酸酯和3-羥基鏈烷酸酯分別轉(zhuǎn)化為乳酰輔酶A和3-羥基烷酰輔酶A的酶的基因和聚羥基鏈烷酸酯合酶基因的細胞或者植物的步驟。本發(fā)明的共聚物是能夠用于代替常規(guī)合成塑料的生物可降解的聚合物，并且該共聚物還可用于醫(yī)療應(yīng)用。文檔編號C08G63/91GK101616954SQ200780043134公開日2009年12月30日申請日期2007年11月21日優(yōu)先權(quán)日2006年11月21日發(fā)明者姜惠玉,樸時載,李恩政,李相燁,李相賢,梁宅鎬,金泰完申請人:Lg化學(xué)株式會社;韓國科學(xué)技術(shù)院