專利名稱：帶雙重識別基團(tuán)聚合物鏈的蛋白質(zhì)印跡樹脂制備方法及應(yīng)用的制作方法
帶鵬識別基團(tuán)聚合物鏈的蛋白質(zhì)印跡樹月識恪^&SJ^ffl
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)印跡聚合物的合成及其自技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及帶有雙重識 另瞎團(tuán)的蛋白質(zhì)印跡樹脂的合戯其應(yīng)用，以克隆蛋白質(zhì)為tlfeffl輔助識別的限長聚^tl鏈合成 蛋白質(zhì)印跡聚合物，具體J&^^然M蛋白質(zhì)的分離、富集。
背景駄肝印跡技術(shù)是聚合物艦H己憶"印跡肝的立體空間而具有的肝水平上的 專一性識別能力。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的驗(yàn)'隨生物活性的要求，近年來印跡蛋白質(zhì)成為針印跡領(lǐng) 域研究的熱點(diǎn)。利用非共價(jià)作用是印跡蛋白質(zhì)最簡單方法。常用的弱肝間作用力有氫鍵、靜電 力、電荷轉(zhuǎn)移、€*作用以及范德華力等。
印跡蛋白質(zhì)的方法主魏包埋法、表面印跡法、抗原決定基的方法。目前，印跡蛋白質(zhì)的方法 單一，單條合^fe在有機(jī)輸仲，用以印跡的蛋白鵬類少且均為常見的、在生物體內(nèi)含量很大 或很容易得到的蛋白質(zhì)，這限制了蛋白質(zhì)印跡聚』的細(xì)的實(shí)際意義。因此開發(fā)印跡蛋白質(zhì)的新 方法，尤其是用以吸附、富集天然微量蛋白質(zhì)的肝印跡聚，^t切需要解決的問題。
就，宓懷卿郭敏綠發(fā)明的舒印跡樹脂和制備方法及其分離麟蛋白質(zhì)的細(xì)(申i轉(zhuǎn) 利號200510013356.X ,公開號CN 1687167A),禾傭限長的聚^1短祉隨機(jī)分布的吡啶基團(tuán)作為識 別位點(diǎn)，有交處也分離純化了目標(biāo)蛋白質(zhì);宓懷卿趙啄等發(fā)明了一種新的表面印跡蛋白質(zhì)的方法(申 i轉(zhuǎn)利號200610013329.7，公聘CN1844174)禾,限制長度的聚激短鏈即輔助識別社隨機(jī)分 布的羧基酸性識別基團(tuán)，并用 桿菌中克隆蛋白質(zhì)作為豐鎌來識別天然微量蛋白質(zhì)，取得了很好 的富集玄娥。由此可見，羧凝響鵬基團(tuán)對蛋白質(zhì)都有i朋啲作用，故本專利中劍門合成了一種輔 助識別聚合物能i:同時(shí)有羧基和吡啶的ra識別基團(tuán)的蛋白質(zhì)印跡聚剖勿，提高了對目標(biāo)蛋白質(zhì)識 別的專一性。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的戰(zhàn)不足，鵬一種帶雙重識別基團(tuán)聚，鏈的 蛋白質(zhì)印跡樹月飾j備方法。
本發(fā)明為了提高識別目標(biāo)蛋白質(zhì)的專一性，劍門引入了限制長度的帶有隨IW重識別基團(tuán)的 輔助識別鏈。湖丙烯腈和4—乙働比啶鵬的無規(guī)共聚物作為輔助識別鏈的骨架，識別基團(tuán)為羧 基和吡啶基團(tuán)，并細(xì)進(jìn)行3dm鍵修飾的80—100目的聚乙烯SIM脂微球作為輔助識別鏈的載體。 根據(jù)蛋白質(zhì)的識別的需要，將i賜瞎團(tuán)在短^hff占的比例定為各10X。本實(shí)驗(yàn)我們f頓克隆的 ^素18 (pCyP18)蛋白質(zhì)為豐嫩。
本發(fā)明提供的帶ma識別基團(tuán)聚^i鏈的蛋白質(zhì)印跡樹脂的制備方法，包括
第一、輔助i湖U鏈的制備在8(TC下，以偶M^異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，丙烯腈和4—乙
烯勘比啶為S^單體(丙烯腈和4—乙烯基吡啶投料M0爾比為1: 99)， ^TK乙醇為^!J，自由 錢合反應(yīng)8h，制得聚合度為35—40的無規(guī)共聚物。在85% (W/W)的濃硫酸中，100。C水解 4h，沉淀，洗滌，分離，室溫下真空千燥24hr。軸30。C下，在1"^N-二異丙基碳二3EJ3安(DIC) 和1-羥基苯并三氮唑(HOBT)的作用下，將烯丙醇緩漫滴加至水解后的無規(guī)共聚物的二甲基 亞砜(DMSO)溶液中，反應(yīng)48hr，用乙,淀，反復(fù)洗滌數(shù)次，得到輔助識別鏈。其中DIC、 HOBT和烯丙醇的摩爾比為1:1:1。烯丙醇和水解后的無規(guī)共聚物的摩爾比為32:1，即合成的丙烯 腈和4一乙烯勘比啶的^M共聚物^有90%的羧基發(fā)生酯化反應(yīng)，鵬七后的側(cè)基上由于帶有雙 鍵，可以被引發(fā)聚合從而錨定到也帶有懸艦鍵的大孔微職面，故稱為錨定基團(tuán)，艦激口成
—紫夕h^光M法測定雙鍵的，，結(jié)果證明有約10%的羧基未，制七反應(yīng)，這些未m的羧
翻賠可以和蛋白質(zhì)表面帶正電荷的酸性氨基酸基團(tuán)作用；艦紫外她鵬法測定吡啶環(huán)的含
量，輔助識別^t有約10^的吡p定基團(tuán)，這幽比啶基團(tuán)可以和蛋白質(zhì)表面n—n共軛的錢酸基
團(tuán)作用，所以羧翻吡P定基團(tuán)被稱為識別基團(tuán)；
第二繊體進(jìn)行《,取80—100目在二甲基亞砜中溶脹后的聚乙烯醇微球10g,力口入10ml 吡啶及10ml丙烯酰氯，3(TC下反應(yīng)4h，使^t球上的羥基接肚丙烯麟，之后用乙^fe滌并過 渡到7jC相中，即得雙鍵修飾后的聚乙烯醇微球載體。
第三、蛋白質(zhì)印跡樹脂的制備將摩爾比300: 1的第一頻恪的輔助i賜避和克隆的鶴環(huán) 素18蛋白質(zhì)(制備見 例3)，在10mMTriS"HCl pH=8.0的緩沖液中于4'C進(jìn)行自組裝8小時(shí)， 加入質(zhì)量為克^^環(huán)素18蛋白質(zhì)1000 / 3的第二步淛備的濕的^3i^謝針布的聚乙烯醇微球載 體吸附16小時(shí)，S&i^體系中加入30X的丙烯鵬及N,N-亞甲基雙丙烯mi安混合溶液(29%的 丙烯醐安和lX的N，N-亞甲基雙丙烯翻安)、過二硫,溶液，使得交皿為1%，室^1氮, 2h，然后加入N，N，N^-四甲基二乙胺，交聯(lián)聚合反應(yīng)2小時(shí)，用2mol丄"KCl溶液洗滌樹脂球至電 泳檢測無pCyP18絲，得到蛋白質(zhì)印跡樹脂。
按本發(fā)明方法制備的蛋白質(zhì)印跡樹脂在蛋白質(zhì)分離中的卿，^ffl方 跑括下述步驟 第一、4'C下，將i憎的J^制備的蛋白質(zhì)印跡樹脂直接^A豬肝提取液中，吸附15h; 第二、上步吸附蛋白后的蛋白質(zhì)印跡樹脂依次用10mM Tri^HCl pH 8.0的緩沖液洗5次， 每次2mL,再用2mL含10mM Tri^HCl pH 8.0和100mM氯化鉀的緩沖溶液洗滌兩次，含10mM Tris~HCl pH 8.0和300mM氯化鉀的緩沖溶液洗滌三次，含10mM Tri^HCl pH 8.0和500mM氯 化鉀的緩沖溶液洗滌柳輛次，得到洗滌液；
第三、鵬Bradford法檢測上步得至啲氯化鉀緩沖溶液的洗滌液，得出總蛋白賴；再取800 ^L洗滌液，用三氯乙醵脫割旦酸納TCA/DOC方法沉淀蛋白，蛋白液制樣后恒流走十二縫磺酸 銀聚丙烯醐努鵬電泳，用線環(huán)素18的抗體對其做免疫印跡檢測，吸附蛋白中親環(huán)素18的含 量，從而得出在卵及附蛋白質(zhì)中親環(huán)素18與總蛋白質(zhì)含量的比值。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極鄉(xiāng)
本發(fā)明弓l入了具有羧凝鵬喊兩種不同i明瞎團(tuán)多識別位點(diǎn)的輔助識別鏈，倉辦對蛋白質(zhì)多方 位多角度的識別，增加了識別位點(diǎn)，提高識別的專一性，更好的對目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行大量的高濃度富 集的特異性的識別。本發(fā)明4頓克隆的蛋白質(zhì)作為豐鎌，剠盯印跡天然微量蛋白質(zhì)附嫩無法得 到的JIS頁，而這一點(diǎn)正是蛋白質(zhì)印跡技術(shù)無法取得更多的自價(jià)值的主要困K位一。
本發(fā)明得至啲蛋白質(zhì)印跡樹脂在天然的細(xì)鵬取物中，倉辦更大量的和更高濃度的富集微量目
標(biāo)蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)印跡樹脂對目標(biāo)蛋白的吸附量為600ng/g,目標(biāo)蛋白質(zhì)在總蛋白質(zhì)中^S提高了 200倍以上。
本發(fā)明本發(fā)明可f賊i^劑盒，即包括輔助識別聚^tl鏈、丙烯翻安單體及引發(fā)體系和鄉(xiāng)S1^ 衝,的大孔微球。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中艦富集的天然線環(huán)素18的ttM氨酰頃反異構(gòu)酶(PPIase)活'腿行了測定， 結(jié)果表明天然 環(huán)素18的酶活性比克^ 環(huán)素18的活性高。


圖1是蛋白質(zhì)印跡樹脂的掃描電鏡照片(SEM)。
圖2是蛋白質(zhì)印跡樹脂對目標(biāo)蛋白質(zhì)的吸附效果的測定，A部分是銀染法電泳圖，B部分是 用,環(huán)素18的抗體對其j故免疫印跡圖。
圖3是天然M環(huán)素18和克^ 環(huán)素18的ltM氨駒頃反異構(gòu)酶(PPIase)活性的測^t比圖。
具條lt^:
實(shí)施例1.
第一、輔助識^鏈的制備取2.38偶氮二異丁腈(AIBN)作為引發(fā)劑，0.5ml4—乙烯勘t鵬 和30ml丙烯腈(AN)作為反應(yīng)單體，200ml無水乙醇作為溶劑，依^dra入到m千燥的三頸圓底
M中，丙烯腈和4—乙烯勘比淀的投料 爾比為l: 99。反應(yīng)單體丙烯腈和引發(fā)劑偶mz:異丁
腈的質(zhì)量比為10.6:1。通氮?dú)馕?，?#， 80。C水浴加熱，回流冷凝，反應(yīng)8hr。趁熱將， 倒入無水乙醇中沉淀，反復(fù)洗滌，5(TC下真空千燥24hr，得到無規(guī)共聚物PANVP 。取，ij后的丙 烯腈和4一乙烯基吡啶的無規(guī)共聚物(PANVP) 2g，力口入到15ml 85X(w/w)的濃硫酸中，100。C水 解4h， mt基完全水解賺基，溶液完全澄清后，降鼓溫，用^7jC乙醇和水混^tr沉淀后4000rpm 離心分離，多次反復(fù)洗滌后，真空烘箱中烘24h。取2g7K解后^，力口入1.76ml的DIC， 2.27g的 HOBT和U4ml的烯丙醇，再加A3Si的DMSO做^fiJ使^aS物恰能溶解，3(TC水^&搖床中反應(yīng) 48hr。 DIC、 HOBT和烯丙醇的摩爾比為1:1:1，烯丙醇和水解后的無規(guī)共聚物的摩爾比為32:1，產(chǎn)
物fflii、激n成一紫外，光度法測定雙鍵的含量，結(jié)果證實(shí)，聚合度為40的丙烯腈和4一乙烯基
批啶的無規(guī)共聚物^i:有90%的羧基勝1^反應(yīng)帶±^鍵，其余10%的羧基未勝反應(yīng)不棘 雙鍵。皿完了，用乙,淀，反復(fù)洗滌數(shù)次，真空千燥24hr，得到輔助識別鏈。
第二自體進(jìn)行,取合,的PVA，10g,加A3S量DMSO做凝U，加入10ml吡啶 (PY)，將7jC浴鵬降至2(TC，滴加丙烯酰氯編，滴完后緩漫將水浴鵬升至30。C反應(yīng)4h。反 應(yīng)完了，用乙0^fe滌，乙i^tm5i夜，乙,滌三次，乙醚洗滌兩次，真空千燥24h，得到接fe^ 的聚乙烯醇小,
第三、蛋白質(zhì)印跡樹脂的制備取前述}賜1份子0.248，溶于5ml的Tri^HCl (pH 8.0)的印跡 緩沖鵬，力口入4ml共含有4mg克H^環(huán)素18 (pCyP18)的蛋白鵬液，于4。C旋轉(zhuǎn)結(jié)合8hr。 向溶液中加入2g接枝后的聚乙烯麟(濕球)旋轉(zhuǎn)吸附12hr。力口入300nl的30X(W/V)丙烯鵬 和NW-亞甲基雙丙烯翻安和混合液(29%的丙烯^1安和r^的N并亞甲基雙丙烯翻安)旋轉(zhuǎn)結(jié)合 2hr，再加入90nllOX(W/V)的過二硫,溶液，常溫下通氮?dú)怆S2hr。加入3.6pl N，N^，N-四甲 基二乙胺溶液，交麟合鵬2hr, 4。C過夜保溫。用含10mMTri^HCl(pH8.0)的2mol.L'1氯化鉀 溶液洗滌樹脂球至SDS-PAGE電泳(硝酸銀^fe)檢測無條帶，得到分子印跡樹脂。
實(shí)施例2、蛋白質(zhì)印跡樹脂在蛋白質(zhì)分離中的自
4。C下，將J^分子印跡樹脂與2mL豬肝細(xì)胞提取物(cytosol)混合，旋轉(zhuǎn)吸附15hr吸附蛋 白后的樹脂依次用10mM Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液洗5次，每次2mL，再用2mL含lOmM Tris-HCl (pH 8.0)和lOOmM氯化鉀的緩沖溶液洗滌兩次，含lOmM Tris~HCl (pH 8.0)和300mM 氯化鉀的緩沖溶液洗滌三次，含10mM TriS"HCl (pH 8.0)和500mM氯化鉀的緩沖溶液洗滌樹脂 兩次，得到洗滌液。應(yīng)用Bradford法檢測氯化鉀溶液的洗滌液以及豬肝細(xì)胞提取物溶液，得出總 蛋白含量；再取800 ^L洗滌液，用三氯乙膨脫ftl旦酸納(TCA/DOC)方法沉淀蛋白，蛋白液制 樣后恒》琉十二驢磺,-聚丙烯鵬;繊電泳，用線環(huán)素18的抗體對其做免疫印跡檢測吸附 蛋白中親環(huán)素18的含量，從而得出在卵及附蛋白質(zhì)中親環(huán)素18與總蛋白質(zhì)含量的比值，同樣的方 法亦可測得豬白細(xì)胞提取物溶液中親環(huán)素18的^ 。結(jié)果如圖l， 2ff^:
圖l: W印跡樹脂的掃描電鏡照片(SEM)。
圖2: A部分是銀染法電泳圖，B部分是用線環(huán)素18的抗體對其做免疫印跡圖。A和B圖 的泳道^i:下對應(yīng)的。泳道l， 2分別是100mM的KCl、皿緩沖液的第一次，第二次 ; 5媳 3， 4， 5分別是300mM的KC1 M緩沖液的第一次，第二次,第三次洗脫;泳道6， 7分別是500mM 的KC1皿緩沖液的第一次，第二次冼脫。由圖可以看出，在目標(biāo)蛋白 環(huán)素18出現(xiàn)峰值的地 方，即在500mM繊緩沖麟一次tt的&媳6，豬肝細(xì)胞提取物中總蛋白量并不是最多的，經(jīng) 檢測IOOmL的、tt液中總共含有蛋白質(zhì)728ng，其中有120ng的線環(huán)素18，所以在lml豬肝細(xì)
胞提取物中新素18在總蛋白質(zhì)中所占比例為64.7ng/肌85iog(即0.08%)，而在lml M液中新 素18在總蛋白質(zhì)中所占比例為1.2n&7.28ng^P 16.5%)，目標(biāo)蛋白質(zhì)在總蛋白質(zhì)中的^*提高了200 倍以上。
本實(shí)^3S做了重復(fù)分子印跡樹脂再生性的測定，使用過的分子印跡樹脂用2mol丄-i氯化鉀 溶液洗滌樹脂球至電泳檢測無條帶。加入豬肝細(xì)胞提取物，用同樣的方法吸附、洗脫和檢測， 結(jié)果和第一次吸附效果基本一致。
激喊—紫夕KHfefeS法測魏鍵賴
1.配制溶液
取86mL48X的氫溴酸(密度1.49)、 32mL 7_KS] 882mL冰乙酸，充分混鋪ij成'對照溶液，。取 500mL對照溶液，力口入3.251^溴，配得"三、離液，。
2. 以對照溶液為參比，在410nm處測量三^g液的B及^g值，穩(wěn)定后加入lOO^L識別^^溶 液，穩(wěn)定1併中后測量其吸爐值。
3. 根據(jù)吸皿變化，換算可知溴的M^、量，從而得到識別M溶液中雙鍵的^i。
實(shí)施例3、克隆蛋白質(zhì),環(huán)素18的制備方法
1.目的基因的克隆
本實(shí)^^用豬肝臟mRNA為牛IteiS行反f^ PCR (RT-PCR)，并將PCR ;^與質(zhì)粒載體 pGEX-5Xl進(jìn)行限制性內(nèi)切Slf,， ^^接后樹認(rèn)^^桿菌DH5a中并進(jìn)行質(zhì)粒鑒定。
(1) 在200mL的薄壁PCR管中，按下列0mi0効n入所需各組艦行PCR反應(yīng)RNA , 齊UliaL，豬肝細(xì)胞RNA100ng，反應(yīng)緩沖液25nL，正向引物10pmo1。反向引物10pmo1， Taq混合 酶l^iL，雙蒸水21^L。
(2) 稱取0.75g瓊月識，力口入50mLlxTAE，混勻后加熱至沸騰，取出后待稍冷時(shí)加入2^L溴化 乙錠(EB)溶液(10mg/mL)，將膠液倒入電泳槽的膠臺上，瓶入梳子；從lOO^L的反應(yīng)體系 中，取出16iiL樣品，加4^iL5x加樣緩沖液；將20nL樣品鄉(xiāng)加入電泳膠的齒孔中，倒入lxTAE 趕'Sii^面，在80V下進(jìn)行電泳，結(jié)束后預(yù)外燈下觀察結(jié)果。
(3) 在PCR，中力口入1/10 #|只的NaAc溶液(3 M， pH 5.2)，混勻后加入2.5倍^f只的^7jC 乙醇，-20°。沉淀20!11111;于4。C、 12,000 rpm離心15 min;棄去上清，用lmL 70%乙,滌；再 次于4。C、 12,000rpm離心15min;棄去上清，真空千B^淀30min， DNA量多時(shí)在管ILLS無色 透明的TO物；加lf^L滅菌水，使之溶解，然后按照下歹艦比向管中依 効n入兩種限制性內(nèi)切酶, 粒酶切體系；取2&濃度為450 ng/mL的pGEX-5Xl質(zhì)粒，也加入同樣的兩種限制性內(nèi)切酶， 粒酶切體系。
(4) 在20^酶切產(chǎn)物中加5L5x加樣緩沖液，混勻、離心。灌制濃度為1.5%的瓊脂撒繊，上
樣，80V下進(jìn)行電泳。等染料前^M^的一半時(shí)，在紫外燈下觀察，ffl5I將目的絲切下；, 膠^A充滿lxTAE電泳緩沖液的透豐碟內(nèi)—?jiǎng)t，駄電泳槽使繊Hi誕負(fù)極，80V電泳， 使DNA在電場的作用下從M^a移到緩沖液中。電泳lh后，加反向電壓100V，反洗脫60sec; 將透析袋中的液體吸入一滅菌的1.5mL離心管中(約500^L)，加等體積的三t酚，劇烈振蕩10 sec，室溫離心15 sec，將上層含DNA的7細(xì)轉(zhuǎn)入另一新管中；加入辦積的氯仿，劇烈振蕩10 sec， 離心15 sec，將J^I含DNA的水相轉(zhuǎn)入另一,體中；力口入1/10 ^KR的NaAC (3 M， pH 5.2)溶液， 稍振蕩后加入2,5倍^f只的^7K乙醇，-20匯沉淀20111111;于4。C、 12,000 tpm離心l5 min;棄去上 清，力口入lmL70o/o^7jC乙醇，洗滌沉淀；再次于4。C、 12,000 rpm離心15 min;棄去上清，真空干 燥DNA沉淀30min;將千燥的沉淀溶于實(shí)麵需量的水中；pGEX-5Xl質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物也做相同 處理；取待插入的DNA和質(zhì)粒DNA， ^3i接體系o
(5) 挑取圧0)11.011501原菌的單克隆離于2mLLB培養(yǎng)基中，37。C過夜培泰次日將菌液 1:100離到50mL飾羊的LB培養(yǎng)基中，37'C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌液的OD600戯0.3(約4-6小時(shí))； 將50mL菌液^MM個(gè)滅菌的離心管中，在冰J^C置10min，于《C、 4,000ipm離心10min;棄 上清用10mL冰預(yù)冷的10mMNaCl重懸細(xì)菌沉淀；于4'C、 4,000rpm離心10min;棄上清，用10 mL冰預(yù)冷的50 mM CaC12重懸細(xì)菌并冰J^夂置20 min;于4°C 、 4,000 ipm離心10 min;棄上清， 加1 mL冰預(yù)冷的50 mM CaC12重懸細(xì)胞，即為感受態(tài)細(xì)胞?？蓪⒅频玫母惺軕B(tài)細(xì)胞以200 mL (含 15%甘油)條，-80°。凍存
(6) 取200^L感受態(tài)細(xì)胞，力口5nL連接產(chǎn)物，S5定混勻；同時(shí)另取200pL感受態(tài)細(xì)胞，完全不 加DNA作為負(fù)對照，于冰i^S 1 hr; 42。C水浴加熱90 sec后腿轉(zhuǎn)移至冰水中7糊1~2 min;每 管補(bǔ)加800mL的LB培養(yǎng)基，37。C溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇并^iM粒編碼的贓素^i己基因；取 含目的DNA的菌液200KiL涂于AMP (50|ag/mL)固體^#基平皿上，剩余800pL涂于另一平皿 上，而不力口DNA的菌液取500)oL涂^^平皿上作為對照；將平皿置于無菌潔凈工作臺中至液體完 全被吸收，然后倒置平皿，于恒溫培鎌中37t:培養(yǎng)12 16hr。
(7) 挑取平ISJh^—單克隆，加入液體LB培養(yǎng)基2mL，過夜i錄。將菌鵬一新的平fei:畫線 過夜培養(yǎng)后C存于4°C 。其余菌液取lO^L Glutathione SepharoseTM 4B軒混合后電^d4行小樣蛋 白檢測。
2.目的蛋白的誘導(dǎo)mS撥屯
(1) 挑取單離于20mLLB/AMP (5Png/mL)培養(yǎng)基中，37。C過夜培養(yǎng)。
(2) 次日按1:100稀釋到2L新鮮的LB/AMP (5png/mL)培養(yǎng)基中，37。C繼^i咅養(yǎng)至OD600值 為0.4~0.6 (約7 8h)。
(3) 超鵬定的OD600 {US,將培^aS調(diào)至20。C，繼^^30min。
(4) 加IPTG至終濃度為O.lmM， 20。C誘導(dǎo)1~2h。
(5) 將培糊于4。C、 5,000 rpm離心15 min，棄上清并倒魏^M頓留液^^紘，用少量冰 預(yù)冷的MTPBS洗滌細(xì)胞1~2次，離心去除冼滌液。
(6) 用相當(dāng)于1/50~1/100培養(yǎng)體積的MTPBS重懸細(xì)胞，加PMSF至終濃度為O.lmM并挑加少 量M酶，于液氮及37'C7]C浴中反復(fù)凍融3次以破碎細(xì)胞。
(7) 挑加DNase，反復(fù)顛倒幾次，以解離雙鏈DNA，使細(xì)菌^ 的粘度明顯斷氐。
(8) 按1:100 (v/v)的比例加入TritonX-100， 4。C旋轉(zhuǎn)混合30min，以鵬蛋白溶解性。
(9) 4"C,10,000rpm離心10min (可適當(dāng)加大離心魏和時(shí)間，這有利于細(xì)胞的破碎)。
(10) 收針清，沉淀和上清分別取樣樹故電泳檢測。
(1 l)上清中加入預(yù)溶腿的親和層豐膝Glutathione SepharoseTM 4B 100~20p|oL (珠^fO， 4°C 旋轉(zhuǎn)結(jié)合4"0min。
(12) 自然沉降菊削故離心，去上清，a^用預(yù)冷的MTPBS洗滌34次。
(13) 珠子用預(yù)冷的50mMTris.Cl (pH8.0)平衡1~2次。 (14將珠子小心地轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，定容后取樣作蛋白^M測定。
(15) 珠子用Mlfe因子Xa的緩沖液洗滌34次。
(16) 根據(jù)電泳圖估^ 上融合蛋白的含量，加入5p|oL (0.5u/nL)凝血因子Xa和45p|oL MifiL 因子Xa纟爰沖液，4。C酶切16h。
(17) 將珠子稍離心，上清轉(zhuǎn)移至4凈離心管中；再離心，上清轉(zhuǎn)移至另-^膽中；再一次 離心，上清即為所要的蛋白溶液。這樣反復(fù)離心是為了徹底除去蛋白溶液中殘留的珠子。
(18難軒中加入50p^U艦因子Xa緩沖液，溫和振蕩洗滌軒。如步驟3^Ul清。 (19)洗滌珠子6次，得到六個(gè)蛋白樣品。從^h樣品中各取出1P^L加lp^L2xSDS樣品緩沖液， 電泳檢測切下的目的蛋白含量。
三氯乙敏脫韌旦酸納(TCA/DOC)沉淀蛋白M^法 材料5%脫 溶液 30%三氯乙酸溶液 3. 2M氫氧化鈉溶液
4十二縫磺,(lxSDS辨品緩沖液鄉(xiāng)腿
Tris.Cl (pH6.8) 50 mM
DTT (二硫蘇糖醇) 100 mM
SDS 2%
溴酚藍(lán) 0.1%
甘油 10% 步驟l.向lmL上述各蛋白液中力口入10ML5。/。脫割旦,溶液后混勻，然后
加480mL 30%三氯乙酸，混勻后于4'C放置2 h或冰浴中，30min。 2.4°C、 10，000rpm離心25min，去上清。 3.10,000 ipm離心25 min ，去盡殘留液體。
4.沉積物中力口入50^iL—倍樣品M懸，如果呈黃fe^W沉淀，貝i加l 2^L2M織化 鈉溶液將顏色調(diào)魏色荊吏之完全溶解。 5.99'C煮沸5 min， 3000ipm離心10s后即可直接上樣走電泳。
實(shí)施例4.
雌氨柳頃反異構(gòu)酶(PPIase)活性的領(lǐng)啶用標(biāo)準(zhǔn)的糜蛋白酶法艦紫外領(lǐng)啶克隆以及天 然,環(huán)素18的肽脯氨醜頃反異構(gòu)酶活性。測定溶液為50 mM Hepes， PH 8.0, lOOmM NaCl， 加入克隆以及天然lt^環(huán)素18終濃度為40 nM在比色皿中預(yù)冷到4。C。加入糜蛋白酶終濃度 為30 nM，然后加入多肽(Suc-Val-Pro-Phe-pNA)溶于LiCl/THF溶液中使終濃度為45 弓| 發(fā)反應(yīng)，快速攪拌后測定在390nm處測定對硝基苯胺的產(chǎn)生，直到反應(yīng)完成。
圖3:由圖中可以看出，蠱代表天然 環(huán)素18的肽脯氨酰頓反異構(gòu)酶(PPIase)活性的測 定結(jié)果；國克H^環(huán)素18腳甫氨醜頓反異構(gòu)酶(PPIase)活性的測定結(jié)果；M樣空白對比實(shí)驗(yàn)。
皿計(jì)算得出天然 環(huán)素18的kcat/KM二1.0xl()5M—、—、克隆的豬親環(huán)素18的kcat/KM二
0.85xl05M—、—1 。由此可見，天然豬親環(huán)素18的酶活性比克隆的豬親環(huán)素18的活性高。
權(quán)利要求
1、一種帶雙重識別基團(tuán)聚合物鏈的蛋白質(zhì)印跡樹脂的制備方法，其特征是該方法包括第一、輔助識別鏈的制備在80℃下，以偶氮二異丁腈AIBN為引發(fā)劑，丙烯腈和4-乙烯基吡啶為反應(yīng)單體，其中丙烯腈和4-乙烯基吡啶投料量摩爾比為1∶99，無水乙醇為溶劑，自由基聚合反應(yīng)8h，制得聚合度為35-40的無規(guī)共聚物；在85％的濃硫酸中W/W，100℃水解4h，沉淀，洗滌，分離，室溫下真空干燥24hr；30℃下，在N，N-二異丙基碳二亞胺DIC和1-羥基苯并三氮唑HOBT的作用下，將烯丙醇緩慢滴加至水解后的無規(guī)共聚物的二甲基亞砜DMSO溶液中，反應(yīng)48hr，用乙醇沉淀，反復(fù)洗滌數(shù)次，得到輔助識別鏈；第二、對載體進(jìn)行修飾取80-100目在二甲基亞砜中溶脹后的聚乙烯醇微球10g，加入10ml吡啶及10ml丙烯酰氯，30℃下反應(yīng)4h，使得微球上的羥基接枝上丙烯?；笥靡掖枷礈觳⑦^渡到水相中，即得雙鍵修飾后的聚乙烯醇微球載體；第三、蛋白質(zhì)印跡樹脂的制備將摩爾比300∶1的第一步制備的輔助識別鏈和克隆的豬親環(huán)素18蛋白質(zhì)，在10mM Tris-HCl pH＝8.0的緩沖液中于4℃進(jìn)行自組裝8小時(shí)，加入質(zhì)量為克隆豬親環(huán)素18蛋白質(zhì)1000/3的第二步制備的濕的經(jīng)過雙鍵修飾的聚乙烯醇微球載體吸附16小時(shí)，再在上述體系中加入丙烯酰胺及N，N-亞甲基雙丙烯酰胺混合溶液、過二硫酸銨溶液，室溫通氮除氧2h，然后加入N，N，N′，N′-四甲基二乙胺，交聯(lián)聚合反應(yīng)2小時(shí)，用2mol.L-1KCl溶液洗滌樹脂球至電泳檢測無豬親環(huán)素18蛋白質(zhì)條帶，得到蛋白質(zhì)印跡樹脂。
2、 s^利要求i戶;M對去制備的蛋白質(zhì)印跡樹脂在蛋白質(zhì)分離中的鵬，^tr征在于，第一、4'C下，將i慢的權(quán)利要求1帝恪的蛋白質(zhì)印跡樹脂直接方1A豬肝提取液中，吸附15h;第二、上步吸附蛋白后的蛋白質(zhì)印跡樹脂依7細(xì)i0mM Tri—HC1 pH 8.0的緩沖液洗5次， 每次2mL，再用2mL含10mM Tris-HCl pH 8.0和100mM氯化鉀的緩沖溶液洗滌兩次，含10mM Tris-HCl pH8.0和300mM氯化鉀的緩沖溶液洗滌三次，含10mMTriS"HCl pH8.0和500mM氯 化鉀的緩沖溶液洗滌樹脂兩次，得到洗滌瓶第三、細(xì)Bradford法檢測上步得至啲氯化鉀緩沖溶液的洗滌液，得出總蛋白含量；再取800 ML洗滌液，用三氯乙酶脫M酸納TCA/DOC方法沉淀蛋白，蛋白液制樣后恒^^十二^S磺酸 鈉-聚丙烯^^ 電泳，用,環(huán)素18的抗體對其做免疫印跡檢測，吸附蛋白中親環(huán)素18的含 量，從而得出^m附蛋白質(zhì)中新素18與總蛋白質(zhì)賴的比值。
全文摘要
帶雙重識別基團(tuán)聚合物鏈的蛋白質(zhì)印跡樹脂的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明為了提高識別目標(biāo)蛋白質(zhì)的專一性，引入了限制長度的帶有隨機(jī)雙重識別基團(tuán)的輔助識別鏈。采用丙烯腈和4-乙烯吡啶反應(yīng)的無規(guī)共聚物作為輔助識別鏈的骨架，識別基團(tuán)為羧基和吡啶基團(tuán)，并選用進(jìn)行過雙鍵修飾的80-100目的聚乙烯醇樹脂微球作為輔助識別鏈的載體。根據(jù)蛋白質(zhì)的識別的需要，將識別基團(tuán)在短鏈上所占的比例定為各10％。本發(fā)明使用克隆的豬親環(huán)素18(pCyP18)蛋白質(zhì)為模板。本發(fā)明能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)多方位多角度的識別，增加了識別位點(diǎn)，提高了識別的專一性，更好的對目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行大量的高濃度富集的特異生的識別。對目標(biāo)蛋白的吸附量為600ng/g，在總蛋白質(zhì)中含量提高了200倍以上。
文檔編號C08F261/04GK101173029SQ20071005983
公開日2008年5月7日 申請日期2007年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月12日
發(fā)明者宓懷風(fēng), 邢小翠, 韓瑞芳 申請人:南開大學(xué)