專利名稱：除去n－末端蛋氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種方法，這種方法在乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉的存在下，能夠有效地從具有可被氧化的N-末端蛋氨酸殘基或該蛋氨酸殘基的二酮的肽(包括蛋白質(zhì))或其鹽中除去所述N-末端蛋氨酸殘基或該蛋氨酸殘基的二酮的方法；另外，本發(fā)明還涉及一種N-末端不含可被氧化的蛋氨酸殘基或該蛋氨酸殘基的二酮的肽或其鹽的制造法。
背景技術(shù)：
我們知道，當?shù)鞍踪|(zhì)在細胞內(nèi)進行生物合成時，其N-末端是從蛋氨酸開始的，這個蛋氨酸與mRNA的起始密碼子AUG相對應(yīng)。但是通常這個蛋氨酸通過在隨后過程中被除去，它不存在于成熟蛋白質(zhì)分子中。
隨著重組DNA技術(shù)的進步，可以通過微生物和/或動物細胞，比如大腸桿菌合成有用的蛋白質(zhì)，然而通過這類方法合成的蛋白質(zhì)中仍發(fā)現(xiàn)保留所述蛋氨酸的例子。比如表達在大腸桿菌里的人類生長激素中帶有蛋氨酸的比率幾乎達到了100％[自然(Nature)，293，408(1981)]，α-干擾素中達到了50％[干擾素研究雜志(J.Interferon Res.)，1，381(1981)]，在非糖基化人白細胞介素-2(IL-2)中，除了已知rIL-2與天然人白細胞介素-2一樣是自丙氨酸起始以外，已有人注意到存在氨基酸末端具有蛋氨酸(N-末端有蛋氨酸殘基)的人白細胞介素2分子(Met-rIL-2)。
關(guān)于用化學方法除去N-末端氨基酸，Dixon早在1964年已報導，使DL-丙胺酰甘氨酸與乙醛酸、吡啶、乙酸酮發(fā)生轉(zhuǎn)氨反應(yīng)可導致生成丙酮酰甘氨酸[生物化學雜志(Biochem.J.)，92，661(1964)]，他還報道，氨基硫脲與化合物反應(yīng)可引起胺鍵裂解，生成甘氨酸[生物化學雜志，90，2C(1964)]。他隨后將該反應(yīng)應(yīng)用于假單胞菌細胞色素c-551(Pseudomonas cytochrom c-551)，報道了N-末端谷氨酸被除去[生物化學雜志，94，463(1965)]。
具有或不具有N-末端蛋氨酸的各種蛋白質(zhì)分子可在高級結(jié)構(gòu)、生物活性、和/或穩(wěn)定性方面各不相同，而且在其N-末端添加蛋氨酸有可能增加抗原性。因此從工業(yè)實用性考慮，建立一種除去對應(yīng)于起始密碼子的N-末端蛋氨酸的方法有重大意義。
為解決這個問題，曾有人提出了用溴化氰(BrCN)分解來除去蛋氨酸[科學(Science)，198，1056(1977)]。但是，該方法除了要求成熟蛋白質(zhì)中不含有蛋氨酸殘基外，還使蛋白質(zhì)經(jīng)受具有不良影響的化學反應(yīng)，得不到滿意的結(jié)果。
除了平成10年72489號(EP-A-812856)所述方法，從具有N-末端蛋氨酸殘基的肽或蛋白質(zhì)中，以選擇性并且有效的方式，除去該N-末端蛋氨酸殘基，而不論肽或蛋白質(zhì)的種類如何的方法目前未知。這主要是由于難以鑒定在溫和調(diào)節(jié)下，在不改變終產(chǎn)物、即肽或蛋白質(zhì)的前提下，能除去N-末端蛋氨酸殘基的化學反應(yīng)。特別是，除去相對大分子的基因工程蛋白質(zhì)(尤其作為治療劑使用的那些)中多余之N-末端蛋氨酸時，要求該蛋白質(zhì)在除去蛋氨酸后活性不受影響，因此通常需要在不加熱的情況下從弱酸性溶液到弱堿性溶性持續(xù)反應(yīng)。這是及其苛刻的化學反應(yīng)條件，現(xiàn)有狀況是，尚未鑒定出一組有利的反應(yīng)。
發(fā)明公開本發(fā)明者進行了反復(fù)試驗，旨在通過只切除遺傳工程所合成肽(包括蛋白質(zhì))的N-末端蛋氨酸殘基而提供一種可模擬天然氨基酸序列之肽的生產(chǎn)方法。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有可能從具有該蛋氨酸二酮的肽上除去該蛋氨酸二酮，其方法是使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽(如方案1式(I)所示)與乙醛酸(一種α-二酮)、或硫酸銅(能提供過度金屬離子)、或吡啶(一種堿基如胺)進行轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，而產(chǎn)生具有該蛋氨酸二酮的肽。然后在乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉等存在下，使該肽與3，4-二氨基苯甲酸(一種堿基如二胺)反應(yīng)。然后水解。就有可能從具有該蛋氨酸二酮的肽中極有效地除去該二酮蛋氨酸殘基。因此，本發(fā)明者鑒定了一種方法，其從具有蛋氨酸殘基的肽中以高產(chǎn)率除去可被氧化的N-末端蛋氨酸殘基，從而產(chǎn)生不具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基且活性并未降低的肽，本發(fā)明人還進行了進一步研究，以期完成本發(fā)明。(方案1) [式(I)中，m表示0或2的整數(shù)，X代表具有一個氨基酸殘基或至少2個以上氨基酸的任意肽鏈，但從實用性上來看，實例可以是對應(yīng)于遺傳工程所合成蛋白質(zhì)之X的一條肽鏈。另外，在本專利說明書中，術(shù)語“蛋白質(zhì)”或“肽”可指含有多個氨基酸的肽，如果是或蛋白質(zhì)，可指非糖基化或糖基化的肽或蛋白質(zhì)。]在本專利說明書上述方案1中，通式(I)所代表的化合物可稱之為“具有可被氧化的N-末端蛋氨酸殘基的肽”或“具有蛋氨酸殘基的肽”；在通式(I)中表示為 [該式中m意義同前述]的部分結(jié)構(gòu)可指“可被氧化的蛋氨酸殘基”或“蛋氨酸殘基”或“蛋氨酸”；
通式(II)中所代表的化合物可指“具有N-末端可被氧化的蛋氨酸二酮殘基的肽”或“具有蛋氨酸二酮殘基的肽”；在通式(II)中表示為 [式中m意義同前述]的部分結(jié)構(gòu)可指“可被氧化的蛋氨酸二酮殘基”或“蛋氨酸二酮殘基”；以及通式(III)所代表的化合物可指“不含有可被氧化的N-末端蛋氨酸殘基的肽”或“不含有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽”。
因此，本發(fā)明涉及(1)一種除去該蛋氨酸二酮的方法，其特征為，在乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉存在下，使具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮的肽或其鹽與3，4-二氨基苯甲酸或其鹽進行反應(yīng)；(2)方法(1)，其中具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽是通過使具有可被氧化的N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽與α-二酮反應(yīng)而獲得的；(3)方法(2)，其中具有可被氧化的N-末端蛋氨酸殘基的肽是通過遺傳工程合成的肽；(4)方法(1)，其中肽是(i)生長激素，(ii)β-動物纖維素，(iii)白細胞介素-2(IL-2)，(iv)促神經(jīng)激素(neutrophin)-3，或(v)apelin；(5)方法(1)，其中所述肽是生長激素；(6)方法(1)，其特征是，乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉作為約0.1或8mol/L的pH約2至9的緩沖液使用；(7)一種除去所述蛋氨酸二酮殘基的方法，其特征為，在乙酸及甲酸鈉的存在下，使具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽與3，4-二氨基苯甲酸或其鹽進行反應(yīng)；
(8)一種生產(chǎn)不含有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽的方法，其特征為，在乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉，或甲酸及乙酸鈉存在下，使具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮的肽或其鹽與3，4-二氨基苯甲酸或其鹽進行反應(yīng)；(9)生產(chǎn)方法(8)，其中具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮的肽或其鹽是通過通過使具有可被氧化的N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽與α-二酮反應(yīng)而獲得的；(10)生產(chǎn)方法(8)，其特征為，乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉，或甲酸及乙酸鈉作為約0.1-8mol/L的pH約2-9的緩沖液使用；(11)一種生產(chǎn)不含有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽的方法，其特征為，在乙酸及甲酸鈉存在下，使具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮的肽或其鹽與3，4-二氨基苯甲酸或其鹽進行反應(yīng)；(12)一種生產(chǎn)方法，其用于生產(chǎn)不含有可被氧化的N-末端蛋氨酸殘基的人生長激素或其鹽，其特征為，將經(jīng)遺傳工程產(chǎn)生的、具有可被氧化的N-末端蛋氨酸殘基的人生長激素或其鹽與乙醛酸或其鹽在硫酸銅和吡啶存在下反應(yīng)，然后與3，4-二氨基苯甲酸或其鹽在乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉存在下反應(yīng)；(13)一種應(yīng)用，其利用(i)乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其鹽，以除去具有可被氧化的N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽中的N-蛋氨酸殘基；(14)一種應(yīng)用，其利用(i)乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其鹽，以除去具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽中的蛋氨酸二酮殘基；(15)一種應(yīng)用，其利用(i)乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其鹽，從具有可被氧化的N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽生產(chǎn)不含有可被氧化的N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽；(16)一種應(yīng)用，其利用(i)乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其鹽，從具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽生產(chǎn)不含有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽。
附圖簡述

圖1表示實施例4a)的電泳結(jié)果。泳道1表示分子量標志物，泳道2表示純化的hGH。
圖2表示實施例16a)的電泳結(jié)果。泳道1表示分子量標志物，泳道2表示從實施例15得到的BTC。
圖3表示實施例18a)的電泳結(jié)果。泳道1表示分子量標志物，泳道2表示從實施例17得到的IL-2。
圖4表示實施例26所用的DNA片段。
圖5表示實施例26的人apelin-36雙鏈的合成模式圖。
圖6表示實施例27得到的質(zhì)粒pTB960-13的結(jié)構(gòu)圖。
本發(fā)明的最佳實施方案在本說明書中，可被氧化的蛋氨酸殘基指下述蛋氨酸殘基或其亞砜，其中所述蛋氨酸亞砜殘基可包括蛋氨酸亞砜或蛋氨酸砜。
盡管具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽是用CH3-S(O)m-(CH2)2-CH(NH2)-CO-X[其中，m表示0或2的整數(shù)，X表示氨基酸殘基或肽鏈]表示的肽，但也可以是所述肽的鹽形式，只要其不抑制本發(fā)明的反應(yīng)，優(yōu)選藥學上允許的鹽類，例如含有鹽酸、氫溴酸、硝酸、硫酸、或磷酸等的無機酸鹽，含有乙酸、苯二甲酸、延胡索酸、酒石酸、馬來酸、枸櫞酸、琥珀酸、甲磺酸、或鄰甲苯磺酸等的有機酸鹽、堿金屬鹽如鈉鹽、或鉀鹽等，堿土類金屬鹽如鈣鹽或銨鹽等。
具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽優(yōu)選是通過遺傳工程合成的、具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽。
上述式中，m優(yōu)選為0，X優(yōu)選含有至少2個氨基酸的肽。
本發(fā)明的肽可以是具有不到50個氨基酸的“肽”，或具有至少50個氨基酸的“蛋白質(zhì)”。
因此，本說明書中術(shù)語“肽”不僅包括具有不到50個氨基酸的分子，還包括具有至少50個氨基酸的分子，優(yōu)選使用具有至少50個氨基酸的分子(“蛋白質(zhì)”)。
優(yōu)選肽包含2-1000個氨基酸，更優(yōu)選包含15-500個氨基酸，具體實例如以下蛋白質(zhì)生長激素(GH)[例如，人生長激素(hGH)(如20K-Hgh和22K-hGH)]、β-動物纖維素(BTC)、甲狀旁腺激素(PTH)、胰島素、神經(jīng)生長因子、腦部衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀體神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子、促神經(jīng)激素-3，4或6、中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)細胞生長因子、肺衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、血小板生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α或β、血管內(nèi)皮細胞生長因子、組織纖溶酶原激活劑、尿激酶、蛋白C、血栓調(diào)節(jié)素、骨生長因子、降鈣素、胰島素樣生長因子、干擾素α，β或γ、白細胞介素-1(α，β)至白細胞介素-12、粒細胞集落刺激因子、粒細胞/巨噬細胞-集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、血栓形成素、促紅細胞生成素、PACAP、心房利鈉肽、內(nèi)皮素、巨噬細胞生長發(fā)育因子、造血干細胞生長因子、肝細胞生長因子、胃動素、免疫毒素、腫瘤壞死因子、水蛭素、促腎上腺皮質(zhì)激素、血管緊張素、血管緊張素2及其肽拮抗劑、血管緊張素3、舒緩激肽、血管舒緩激肽加強因子、α，β或γ內(nèi)啡肽、腦啡肽、嗜中性粒細胞趨化因子、促胃液素、胰高血糖素、生長激素釋放因子、京都啡肽、胰激肽、促性腺激素釋放激素、肥大細胞脫顆粒肽、黑色素細胞刺激激素、神經(jīng)緊張素、胰蛋白酶抑制劑、催產(chǎn)素、前胰島素C-肽、分泌素、生長激素抑制因子、促甲狀腺素釋放激素、泛激素、尿抑胃素、加壓素、激肽、吞噬刺激素、促生長因子、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、胰島素樣生長因子、降鈣素基因相關(guān)肽、PTHrP、VIP、DHI、胰島素調(diào)理素、GRP、CCK-PZ、促生長激素神經(jīng)肽(galanin)、竇肽(antrum peptide)、PPY、胰多肽(pancreaticpolypeptide)、PSP、胰抑素、hCG、hCS、松弛素、血清胸腺因子、促胸腺生成激素、胸腺素、XIII因子、VIII因子、尿激酶原、SOD、VIIa因子、抗凝血酶、或apelin、或它們的突變蛋白(其在野生型蛋白質(zhì)中有至少一個氨基酸置換、缺失或添加，從而顯示相同于野生型蛋白質(zhì)或更高的生物學或免疫學活性)、或通過化學合成等方法產(chǎn)生的已知肽或新型肽，其中所用肽特別優(yōu)選經(jīng)遺傳工程產(chǎn)生的肽(包括蛋白質(zhì))，尤其是遺傳工程產(chǎn)生的生長激素[例如，人生長激素(hGH)(如20K-hGH和22K-hGH)]、促神經(jīng)激素-3、BTC、甲狀旁腺激素、IL-2、apelin、或它們的突變蛋白，特別是生長激素類[如人生長激素(hGH)(有20K-Hgh、22K-hGH)]及它們的突變蛋白，尤其優(yōu)選的是生長激素類[如人生長激素(hGH)(如20K-Hgh和22K-hGH)]。所述apelin可以是例如Biochem.Biophys.Res.Commun.，251，471-476(1998)中描述的人apelin-36、人apelin-13、或已將apelin-13的N-末端氨基酸(Gln)轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸的肽；任何類型的肽只要具有針對APJ的配體活性則都可以接受(Odowd.B.F.等，基因，436，355-359(1993))，實例如專利申請平成10年271654號“對氨基酸序列等同或部分等同于3號序列的受體蛋白具有結(jié)合能力的多肽”中所述。
盡管上述肽(其也可是野生型蛋白質(zhì))可來自于任何一種動物，從實用性來講，最好選用人的肽(其也可是包括蛋白質(zhì))。
所述肽在除去可被氧化的N-末端蛋氨酸(Met)殘基或該蛋氨酸的二酮殘基之前或之后可進行再折疊(活化或再生)。
在本說明書中，具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽指用式CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-X[式中，m表示0-2的整數(shù)，X表示氨基酸殘基或肽鏈]所表示的化合物或其鹽。具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽可以通過化學反應(yīng)或酶反應(yīng)等各種反應(yīng)來獲得。例如，化學方法可以是，使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽與α-二酮反應(yīng)，從而通過轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)獲得具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽(平成10年專利申請72489號(EP-A-812856))。
在本說明書中，α-二酮可以是任何二酮，只要其使上述肽或其鹽的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)能夠進行，實例如用式R1-CO-CO-R2所表示的化合物或其鹽[式中，R1表示可以被氫或羧基(優(yōu)選氫或甲基、更優(yōu)選氫)所取代的低級烷基或苯基，R2表示可以被羥基、低級烷氧基或低級烷基(優(yōu)選羥基)所取代的氨基]。
上式中R1所表示的低級烷基有含1-6個碳原子的烷基如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、或叔丁基等，R2所表示的低級烷氧基有含1-6個碳原子的烷基如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、或叔丁氧基等。R2所表示的可含有低級烷基取代的氨基有包含上述R1所表示的1或2個低級烷基的氨基等。鹽的實例如類似于上述含可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽鹽一樣的鹽類。
α-二酮的具體例子有乙醛酸、丙酸、草乙酸、苯乙醛酸、2-氧代戊二酸等，其中優(yōu)選乙醛酸。
α-二酮也可以為鹽形式，如鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽，鹽酸鹽等無機鹽。
具有可被氧化的N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽與α-二酮之間的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)通常優(yōu)選使1摩爾肽或其鹽與約1-10,000摩爾(優(yōu)選2000-4000摩爾)α-二酮，在大約0-70℃(優(yōu)選約20-40℃)的條件下進行約10分鐘-5個小時(優(yōu)選約20分鐘-2個小時)的反應(yīng)。只要是不影響所述轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的任何緩沖液都可以使用(例如磷酸緩沖液、乙酸緩沖液、枸櫞酸緩沖液等)，其中最優(yōu)選乙酸緩沖液。反應(yīng)中pH優(yōu)選調(diào)整至約2-9，尤其約4-7，最好約pH5-6。
為了促進這種轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的進程，最好是在過渡態(tài)金屬離子的存在下使α-二酮反應(yīng)，通常優(yōu)選用約0.001-0.1摩爾(優(yōu)選0.01-0.05摩爾)的過渡態(tài)金屬離子與1摩爾的α-二酮反應(yīng)?？墒褂玫倪^渡態(tài)金屬離子有銅離子(Cu+，Cu2+)、鈷離子(Co2+，Co3+)、鎳離子(Ni2+，Ni3+)、鐵離子(Fe2+，F(xiàn)e3+)、鋅離子(Zn2+)、鋁離子(Al3+)、錳離子(Mn2+等)、鎵離子(Ga3+)、銦離子(In3+)、鎂離子(Mg2+)和鈣離子(Ca2+)，其中優(yōu)選銅離子或鈷離子，尤其優(yōu)選銅離子(Cu2+)。這些過渡態(tài)金屬離子通?？梢耘c無機酸如硫酸、硝酸、鹽酸或高氯酸，或與有機酸如乙酸、草酸、枸櫞酸或碳酸等形成鹽形式而添加到反應(yīng)溶液里，其中優(yōu)選硫酸銅、乙酸銅，尤其優(yōu)選硫酸銅。
又，最好在堿基的存在下使α-二酮反應(yīng)，通常1摩爾的α-二酮使用0.1-20摩爾(優(yōu)選0.5-10摩爾)的堿基。堿基可以使用烷基胺類如三乙胺、三丁胺等，芳香族胺類如N，N-二甲基苯胺、吡啶、二甲基吡啶、三甲基吡啶、4-(二甲基氨基)吡啶、或咪唑等，其中最好選用吡啶。
又，在具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽進行轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)期間，或在具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽經(jīng)轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)產(chǎn)生具有蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽時，為了防止沉淀，優(yōu)選根據(jù)上述肽、具有蛋氨酸二酮殘基的肽、或其鹽的種類，向轉(zhuǎn)氨基緩沖液中添加尿素。如使用hGH時，在緩沖液中添加的尿素濃度優(yōu)選為約1-8M，更優(yōu)選為約3-6M。
而且，在上述轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)中，優(yōu)選在過渡態(tài)金屬離子及堿基的存在下使α-二酮反應(yīng)，實踐時，把含有過渡態(tài)金屬離子、堿基以及α-二酮3個成分的混合液(如硫酸銅、吡啶以及乙醛酸等)添加到具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽的水溶液中，使轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)得以進行。
通過該轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)獲得的、用式CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-X[式中的m表示0或2的整數(shù)，X表示氨基酸殘基或肽鏈]所表示的化合物或其鹽可從反應(yīng)溶液中分離，并通過公知純化肽或蛋白質(zhì)的方法如提取、鹽析、分配、重結(jié)晶、或色譜法等純化，也可以使所述化合物或其鹽進行下面的水解反應(yīng)。
用轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)所得到的具有蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽通?？梢赞D(zhuǎn)換為不具有可被氧化之N-末端氨酸殘基或該蛋氨酸殘基之二酮的氨基酸、肽或其鹽。
水解反應(yīng)中使用的堿基可以是如半胱胺、三乙胺、或三丁胺等烷基胺或其鹽，N，N-二甲基苯胺、吡啶、二甲基吡啶、三甲基吡啶、4-(二甲基氨基)吡啶、或咪唑等芳香族胺或其鹽，鄰苯二胺、亞芐基-3，4-二胺、3，4-二氨基苯甲酸或它的正烷基取代物(如正甲基-1，2-苯二胺、正乙基-1，2-苯二胺、或正異丙基-1，2-苯二胺等)、2，3-二氨基苯酚、或4-氯-鄰苯二胺等二胺或其鹽，優(yōu)選芳香族二胺，尤其3，4-二氨基苯甲酸或其正烷基取代物(如正甲基-1，2-苯二胺、正乙基-1，2-苯二胺、正異丙基-1，2-苯二胺等)，氨基硫脲、丙酮氨基硫脲、或苯氨基硫脲等氨基硫脲，氨基硒脲、丙酮氨基硒脲等氨基硒脲或其鹽，優(yōu)選胺，尤其二胺或氨基硫脲或其鹽，特別優(yōu)選3，4-二氨基苯甲酸或其鹽。
在水解反應(yīng)中可使用的堿基實例如一種類似于具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽鹽的堿基。
相對于1摩爾的具有蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽，堿基需要約1-10000摩爾，優(yōu)選約200-3000摩爾，更優(yōu)選約500-3000摩爾。水解反應(yīng)通常在0-70℃(優(yōu)選20-40℃)進行約1小時-7天(優(yōu)選約10小時-5天)。反應(yīng)時最好以緩沖液為溶劑，這類緩沖液實例如甲酸系列緩沖液(如乙酸-甲酸鈉、甲酸-甲酸鈉、或甲酸-乙酸鈉等)。盡管只要不抑制上述水解反應(yīng)，任何緩沖液都可使用，但優(yōu)選乙酸-甲酸鈉、甲酸-甲酸鈉、或甲酸-乙酸鈉緩沖液。反應(yīng)中pH最好調(diào)節(jié)到約2-9，尤其約3-7，最優(yōu)選為4-6。緩沖液的用量優(yōu)選約0.1-8mol/L，更優(yōu)選約0.5-6mol/L。
為防止不具有可被氧化之N-末端蛋氨酸的氨基酸、肽或其鹽(由具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮的肽或其鹽經(jīng)水解產(chǎn)生)沉淀，優(yōu)選根據(jù)所述具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮的肽的種類，以及所述不具有蛋氨酸殘基之氨基酸、肽、或其鹽的種類，向水解反應(yīng)緩沖液中添加尿素。例如，使用hGH時，優(yōu)選向緩沖液里加約1-6M的尿素，更優(yōu)選約2-5M。
盡管如此獲得的氨基酸、肽、或其鹽可從反應(yīng)液中分離，并經(jīng)已知純化方法如提取、鹽析、分配、重結(jié)晶、或色譜等純化，但優(yōu)選使用SP-Sepharose(Pharmacia Biotech)或DEAE-5PW(Tosoh Corporation)經(jīng)離子交換層析純化。
本發(fā)明合成的肽其N-末端不具有蛋氨酸，并具有與生物學活性靶肽(如生物學活性天然多肽)相同的氨基酸序列，這類肽具有所述靶肽(如天然多肽)的類似活性，毒性低，可作為藥劑或診斷試劑安全使用。
本發(fā)明使得有可能從具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基或該蛋氨酸的二酮的肽中特異地除去該蛋氨酸殘基或該蛋氨酸二酮。
在本發(fā)明的說明書及附圖中使用縮寫符號表示氨基酸，其符合IUPAC-IUB生化命名委員會的縮寫符號或該領(lǐng)域的慣用縮寫符號，見以下實例。當氨基酸顯示光學異構(gòu)現(xiàn)象時，若沒有特別提示均表示L-構(gòu)型。
SDS十二烷硫酸鈉Gly甘氨酸Ala丙氨酸Val纈氨酸Leu亮氨酸Iie異亮氨酸Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Cys半胱氨酸Met蛋氨酸Glu谷氨酸Gln谷氨酰胺Asp天冬氨酸Asn天冬酰胺Lys賴氨酸Arg精氨酸His組氨酸Phe苯丙氨酸Tyr酪氨酸
Trp色氨酸Pro脯氨酸AsxAsp+AsnGlxGlu+Gln以下參考例和實施例僅為具體描述本發(fā)明，并非限制。
參考例1(使用T7啟動子構(gòu)建人生長激素(hGH)表達載體)hGH的結(jié)構(gòu)基因通過PCR擴增從人腦垂體cDNA文庫(Quick-Clone，CLONTECH公司)中回收，所用引物一個含有緊鄰該結(jié)構(gòu)基因起始密碼子上游的NdeI切割位點，另一個含有緊鄰該結(jié)構(gòu)基因終止密碼子下游的BamHI切割位點。由此得到兩端均加有限制性內(nèi)切酶識別位點的hGH酶基因，將其連接至pT7 Blue(DNA連接試劑盒Ver.2寶酒造株式會社)的T克隆位點，產(chǎn)生pT7HGH-Na。將其導入大腸桿菌JM109，以氨芐青霉素抗性和β-半乳糖苷酶活性篩選轉(zhuǎn)化體。
另一方面，如下構(gòu)建表達載體。pBR322用NdeI切割，再用T4 DNA聚合酶(DNA鈍化試劑盒，寶酒造株式會社)使末端鈍化，重新連接，產(chǎn)生pBRdesNde，其NdeI識別位點缺失。pET3c用BgI II-Eco RV切割，回收約0.26kbp的片段，然后用T4 DNA聚合酶使末端鈍化，連接至pBRdesNde的Sca I片段，產(chǎn)生pBR/T7 desNde?；蛘?，經(jīng)定點誘變(Quick-Change，Stratagene)制備pBR322desBam，其為缺失了BamHI位點的pBR322。將pBR322desBam的Sph I-Eco RV片段與pBR/T7 desNde的Sph I-Eco RV片段連接，產(chǎn)生四環(huán)素抗性表達載體pTC。將其中四環(huán)素抗性基因和T7啟動子反向的載體命名為pTC1，將其中所述基因與啟動子同向的載體命名為pTC2。
pT7HGH-Na用Nde I及Bam HI切割，回收hGH結(jié)構(gòu)基因，將其連接至pTC1的Nde I-Bam HI片段，然后導入大腸桿菌JM109，用氨芐青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化體，從中回收質(zhì)粒，命名為表達質(zhì)粒pTCHGH-Na。
大腸桿菌MM294用含有T7 RNA聚合酶基因的重組λ噬菌體(Studier，出處同上)溶源化。然后將hGH表達載體pTCHGH-Na導入該大腸桿菌MM294(DE3)，獲得了大腸桿菌MM294(DE3)/pTCHGH-Na。另外hGH的堿基序列在產(chǎn)生pTCHGH-Na時用ABI Prism 377ADNA測序儀證實。
參考例2(具有蛋氨酸殘基的hGH(Met-hGH)在大腸桿菌的表達)
將參考例1得到的轉(zhuǎn)化體放入含有1升LB培養(yǎng)基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉)和5mg/L四環(huán)素的2升燒瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)16小時。將所得培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入含20升LB培養(yǎng)基(其含0.02％Newpol LB-625(消泡劑，三洋化成工業(yè))及5mg/L四環(huán)素)的50升發(fā)酵罐中，37℃通氣培養(yǎng)6小時。再轉(zhuǎn)入含360升發(fā)酵培養(yǎng)基(1.68％磷酸氫二鈉、0.3％磷酸二氫鉀、0.1％氯化銨、0.05％氯化鈉、0.05％硫酸鎂、0.05％Newpol LB-625、0.0005％鹽酸硫胺素、1.5％葡萄糖、3.0％Hy-Case Amino、1.0％酵母提取物)的500升發(fā)酵罐中，開始37℃通氣攪拌培養(yǎng)。當培養(yǎng)液濁度達到約1200Klett單位時，添加17.85mg/L異丙基硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTQ)，繼續(xù)培養(yǎng)時再加入24升的30％葡萄糖，5小時后離心分離培養(yǎng)液，得到約12.3kg濕重的細胞，凍存在-80℃。
上述轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(MM294(DE3)，pTCHGH-Na)于1997年12月10日保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)，保藏號FERM P-16546，后又于1999年9月24日轉(zhuǎn)為國際保藏，保藏號FERMBP-6888。上述轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(MM294(DE3)，pTCHGH-Na)于1997年10月16日保藏于財團法人發(fā)酵研究所(IFO)，保藏號IFO 16124。
實施例1(活化Met-hGH)在參考例2所得2kg細胞中，加入50mM Tris/HCl和8M鹽酸胍(pH8.0)共6升以裂解細胞，然后用超聲細胞破碎機(Sonifier-450、Branson UltrasonicsCorporation)進行超聲破碎，離心(10000rpm、120分鐘)。向所得的6升上清液中加入50mM Tris/HCl、0.28mM GSSG、1.4mM GSH、0.7M精氨酸(pH8.0)共18升，將pH調(diào)整到8.0，4℃活化4天。
實施例2(純化Met-hGH)將實施例1活化后的再生液用Pellicon盒式系統(tǒng)(PTGC膜，Millipore公司)加入20mM Tris/HCl、2.5M尿素(pH8.0)進行脫鹽和濃縮，直至導電性低于10mS，然后對得到的濃縮液5升加入50mM磷酸緩沖液(pH6.0)稀釋至50升，4℃下靜置過夜。再進行連續(xù)離心分離(JCF-Z轉(zhuǎn)頭，Beckman公司)，向上清液50升加入10M氫氧化鈉將pH調(diào)整到7.12，用Pellicon盒式系統(tǒng)(PTGC膜，Millipore公司)濃縮，將緩沖液置換為20mM Tris/HCl(pH8.0)之后，離心(10000rpm、30分鐘)得到了上清液。再將這個上清液吸附于用20mMTris/HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Toyopearl 650M柱(20cmφ×84cm，Tosoh公司)，充分洗凈之后，用20mM Tris/HCl含50mM氯化鈉(pH8.0)洗脫，得到了95升洗脫液作為Met-hGH級分。再進一步將這洗脫液用Pellicon盒式系統(tǒng)(PTGC膜，Millipore公司)進行濃縮和脫鹽，然后將緩沖液置換為20mMTris/HCl、6M尿素(pH8.0)得到了12.21g的Met-hGH。
實施例3(除去N-末端蛋氨酸殘基(N-末端Met)的方法)在實施例2中得到的Met-hGH溶液1800毫升里加入2.5M乙醛酸、40mM硫酸銅、和50％吡啶溶液共450毫升，充分攪拌之后在25℃下反應(yīng)60分鐘。然后再用20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱(11.3cmφ×125cm、PharmaciaBiotech公司)按照3L/h的流速洗脫，使用與平衡時一樣的緩沖液繼續(xù)，獲得具有蛋氨酸二酮的hGH級分4.2升。將其加入1.2M乙酸、2.4M甲酸鈉、3.6M尿素溶液、和48mM 3，4-二氨基苯甲酸溶液20.8升中，充分攪拌，然后在30℃下緩慢攪拌使之反應(yīng)3天。反應(yīng)后用Pellicon盒式系列(PTGC膜，Millipore公司)將此溶液濃縮到14升，分2次各7升用20mM Tris/HCl、4.0M尿素(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱(25.2cmφ×50cm，Pharmacia Biotech公司)按照6L/h的流速洗脫，收集到了20升洗脫物，為hGH級分。再在DEAE-5PW柱(21cm×30cm、Tosoh公司)上經(jīng)高速液相層析(Gilson HPLC系統(tǒng)，Gilson有限公司)使此溶液流動吸附(flow adsorption)，然后在70％-85％溶劑B的pH梯度(其產(chǎn)生于A＝50mM Tris/HCl+2.5M尿素(Ph8.0)，和B＝50mM MES[2-(N-嗎啉代)乙基磺酸]+2.5M尿素(pH4.0))中320毫升/分的流速洗脫70分鐘，得到5.84升hGH級分。向其中加入16毫升10M NaOH溶液將pH值調(diào)至7.1，分8批進行高速液相層析(Gilson HPLC系統(tǒng)，Gilson有限公司)。使指定量濃縮液流過POROS 20R1柱(5cm×60cm，Nihon PerSeptive Ltd.)并與之吸附，然后在50％-85％溶劑B的pH梯度(通過A＝25％正丙醇+75％50mM Tris/HCl(pH8.5)、B＝35％正丙醇+65％50mM Tris/HCl(pH8.5)產(chǎn)生)中以50毫升/分的流速洗脫150分鐘，得到34.7升洗脫物，為hGH級分。將該洗脫物加蒸餾水稀釋到200升，然后在Pellicon盒系統(tǒng)(PTGC膜，Millipore公司)中濃縮到5升，再分3次經(jīng)高速液相層析(Gilson HPLC系統(tǒng)，Gilson有限公司)流過DEAE-5PW柱(10.8cm×20cm、Tosoh公司)并吸附，在70％-85％的pH梯度(通過A＝50mM Tris/HCl+2.5M尿素(pH8.0)和B＝50mM MES[2-(N-嗎啉代)乙基磺酸]+2.5M尿素(pH4.0)產(chǎn)生)中以80毫升/分的流速洗脫70分鐘，得到1616毫升的hGH級分。向該hGH級分中加入2毫升的10M NaOH溶液將pH調(diào)至7.1，用超濾膜(Omega膜，富士膠片公司)濃縮，得到0.4升濃縮液。使之以2升/h的流速流過用蒸餾水平衡的Sephacryl S-100柱(11.3cmφ×50cm、Pharmacia Biotech公司)，得到hGH級分。此外，使該溶液濾過Millipack60(Millipore公司)，獲得2391ml hGH溶液(4683mg hGH)。
實施例4(hGH的鑒定)(a)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析向?qū)嵤├?所得hGH中加入等量樣品緩沖液(其含有100mM DTT[Laemmli，自然，227，680(1979)]并充分攪拌，95℃加熱2分鐘，用Multigel10/20(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.)電泳。電泳后的凝膠用考馬斯亮藍染色，發(fā)現(xiàn)約22Kda的一條帶，從而證實純化的hGH是單體(圖1)。
(b)N-末端氨基酸序列分析用氣相蛋白質(zhì)測序儀(Perkin Elmer Applied Biosystems，477A型)測定N-末端氨基酸序列。所得hGH的N-末端氨基酸序列與由cDNA堿基序列推導的hGH的N-末端氨基酸序列一致(表1)。
表1殘基編號所測的PTH1)氨基酸(pM) 由hGH堿基序列推導的氨基酸1Phe(848) Phe2Pro(520) Pro3Thr(403) Thr4Ile(620) Tle5Pro(401) Pro6Leu(429) Leu7Ser(92) Ser8Arg(262) Arg9Leu(376) Leu10 Phe(283) Phe11 Asp(182) Asp12 Asn(175) Asn13 Ala(175) Ala14 Met(194) Met
15Leu(261) Leu16Arg(181) Arg17Ala(144) Ala18His(80) His19Arg(152) Arg20Leu(200) Leu21His(71) His1)苯基硫代乙內(nèi)酰脲用1nmol進行分析。
(c)氨基酸組成的分析用氨基酸分析儀(L-8500A、日立)測定了氨基酸組成。所得hGH的氨基酸組成與由cDNA堿基序列推導的氨基酸組成一致(表2)。
表2氨基酸每摩爾的殘基數(shù)由hGH堿基序列推導的值A(chǔ)sx 19.8 20Thr1)9.7 10Ser1)16.1 18Glx 27.0 27Pro 7.7 8Gly 8.0 8Ala 6.9 7Cys2)N.D. 4Val 6.8 7Met 2.9 3Ile 7.4 8Leu 26.6 26Tyr 7.9 8Phe 12.4 13His 3.0 3Lys 8.7 9Arg 10.7 11
Trp 0.9 1酸水解(使用6N HCl-4％巰基乙酸，110℃、水解24和水解48小時的平均值)1)0小時外插值。
2)未檢出。
用約10μg進行分析。
(d)C-末端氨基酸的分析用氨基酸分析儀(L-8500A、日立)測定了C-末端氨基酸。所得hGH的C-末端氨基酸與由cDNA堿基序列推導的C-末端氨基酸一致(表3)。
表3C-末端氨基酸 回收率(％)Phe 94氣相肼解(Phase hydrazinolysis)(100℃6小時)用20nmol進行分析。
實施例5(測定hGH活性)實施例3所得的純化hGH對Nb2細胞的生長促進活性(臨床內(nèi)分泌學和代謝，51卷，1058頁(1980))等同于標準品(Chemicon Intemational，Inc.，Temecula，Califomia，USA)。
實施例6(除去N-末端Met)實施例3所得具有蛋胺酰二酮殘基的hGH級分0.4ml，向其中加入20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)，稀釋至2毫升。向該溶液中加入等量的4M乙酸、4M乙酸鈉、和6M尿素溶液，以及80mM N-甲基-1，2-苯二胺溶液，充分攪拌，30℃反應(yīng)20小時。然后使溶液以60ml/h的流速流過用20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)預(yù)平衡的Sephadex G-25柱(1cmφ×30cm，Pharmacia公司)，收集到hGH級分10ml。然后將此溶液上樣于DEAE-5PW柱(2.15cm×15cm，Tosoh公司)，經(jīng)高速液相層析(Gilson HPLC系統(tǒng)，Gilson公司)后吸附，在70％-85％溶劑B的pH梯度(通過A＝50mMTris/HCl+2.5M尿素(pH8.0)、B＝50mM MES[2-(N-嗎啉代)乙基磺酸]+2.5M尿素(pH4.0)產(chǎn)生)中以7.5ml/min的流速洗脫70分鐘，得到hGH。
實施例7(除去N-末端Met)
實施例3所得具有蛋胺酰二酮殘基的hGH級分0.4ml，向其中加入20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)，稀釋至2毫升。向該稀釋液中加入等量的2M乙酸、4M乙酸鈉、和6M尿素溶液，以及80mM N-甲基-1，2-苯二胺溶液，充分攪拌，30℃反應(yīng)20小時。然后使溶液以60ml/h的流速流過用20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)預(yù)平衡的Sephadex G-25柱(1cmφ×30cm，Pharmacia公司)，收集到hGH級分10ml。然后將此溶液上樣于DEAE-5PW柱(2.15cm×15cm，Tosoh公司)，經(jīng)高速液相層析(Gilson HPLC系統(tǒng)，Gilson公司)后吸附，在70％-85％溶劑B的pH梯度(通過A＝50mMTris/HCl+2.5M尿素(pH8.0)、B＝50mM MES[2-(N-嗎啉代)乙基磺酸]+2.5M尿素(pH4.0)產(chǎn)生)中以7.5ml/min的流速洗脫70分鐘，得到hGH。
實施例8(除去N-末端Met)在實施例2中得到的1.8ml Met-hGH溶液里加入2.5M乙醛酸、40mM硫酸銅、50％吡啶溶液0.45ml，充分攪拌之后，25℃反應(yīng)60分鐘。然后以100ml/h的流速上樣于用20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)預(yù)平衡的Sephadex G-25柱(1.5cmφ×30cm，Pharmacia Biotech公司)，用平衡液洗脫，得到具有蛋氨酸二酮殘基的hGH級分10毫升。將其加入49.5ml的1.2M乙酸、2.4M甲酸鈉、3.6M尿素溶液和48mM 3，4-二氨基苯甲酸溶液，充分攪拌，然后在37℃溫度緩慢攪拌使之反應(yīng)24小時。然后以500ml/h的流速上樣于用20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)預(yù)平衡的Sephadex G-25柱(4.6cmφ×60cm，Pharmacia Biotech公司)，收集到hGH級分150毫升。然后將此溶液上樣于DEAE-5PW柱(2.15cm×15cm，Tosoh公司)，經(jīng)高速液相層析(Gilson HPLC系統(tǒng)，Gilson公司)吸附，在70％-85％溶劑B的pH梯度(通過A＝50mM Tris/HCl+2.5M尿素(pH8.0)、B＝50mM MES[2-(N-嗎啉代)乙基磺酸]+2.5M尿素(pH4.0)產(chǎn)生)中以7.5ml/min的流速洗脫70分鐘，得到hGH級分6.7mg。
實施例9(除去N-末端Met)在實施例2中得到的1.8ml Met-hGH溶液里加入2.5M乙醛酸、40mM硫酸銅、50％吡啶溶液0.45ml，充分攪拌之后，25℃反應(yīng)60分鐘。然后以100ml/h的流速上樣于用20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)預(yù)平衡的Sephadex G-25柱(1.5cmφ×30cm，Pharmacia Biotech公司)，用平衡液洗脫，得到具有蛋氨酸二酮殘基的hGH級分10毫升。將其加入10ml的2M甲酸、10M甲酸鈉、6M尿素溶液和80mM 3，4-二氨基苯甲酸溶液，充分攪拌，然后在30℃溫度緩慢攪拌使之反應(yīng)3天。然后以500ml/h的流速上樣于用20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)預(yù)平衡的Sephadex G-25柱(4.6cmφ×60cm，Pharmacia Biotech公司)，收集到hGH級分100毫升。然后將此溶液上樣于DEAE-5PW柱(2.15cm×15cm，Tosoh公司)，經(jīng)高速液相層析(GilsonHPLC系統(tǒng)，Gilson公司)吸附，在70％-85％溶劑B的pH梯度(通過A＝50mMTris/HCl+2.5M尿素(pH8.0)、B＝50mM MES[2-(N-嗎啉代)乙基磺酸]+2.5M尿素(pH4.0)產(chǎn)生)中以7.5ml/min的流速洗脫70分鐘，得到hGH級分6.0mg。
實施例10(含有蛋氨酸殘基的20K-hGH(Met-20K-Hgh)的活化)根據(jù)參考例2中平成10年專利申請234386號所述方法得到40g細胞，將其懸浮于100ml PBS(磷酸鹽緩沖液)，然后在超聲儀(Branson UltrasonicsCorporation)上超聲破碎5分鐘使細胞破碎。離心裂解液(10,000rpm 20min)，棄去上清液，得到沉淀。加入2升的50mM Tris/HCl和8M鹽酸胍溶液(pH8.0)使沉淀溶解，之后離心(10,000rpm 120min)。于所得的2升上清液中加入50mM Tris/HCl、0.28mM GSSG、1.4mMGSH、和0.7M精氨酸(pH8.0)共24升，4℃活化1天。
實施例11(純化Met-20K-hGH)實施例10所得活化溶液在Minitan超濾器(PTGC膜，Millipore公司)中，通過加入20mM Tris/HCl和2.5M尿素(pH8.0)進行脫鹽和濃縮，直到導電性不超過10ms/cm為止，所得濃縮液離心(10,000rpm 20min)，得150ml上清。將其上樣于已用50mM Tris/HCl和2.5M尿素/10％乙腈(pH8.2)平衡的HiLoadTMQ Sepharose 16/10 HP柱(1.6cmφ×10cm，Pharmacia Biotech公司)進行吸附，充分洗滌，用氯化鈉濃度梯度0-0.18M以3.0ml/min的流速洗脫，得28ml Met-20K-hGH級分。將其用Centriplus-10(Millipore公司)進一步濃縮和脫鹽，得濃縮液15ml。將其再次吸附于已用50mM Tris/HCl和2.5M尿素/10％乙腈(pH8.2)平衡的HiLoadTMQ Sepharose 16/10 HP柱(1.6cmφ×10cm，Pharmacia Biotech公司)，充分洗滌，在0％-100％B的pH梯度(用A＝50mM Tris/HCl、2.5M尿素和10％乙腈(pH8.2)以及B＝50mM MES[2-(N-嗎啉代)乙基磺酸]、2.5M尿素和10％乙腈(pH4.0)產(chǎn)生)中以3.0ml/min的流速洗脫60分鐘，得12ml的Met-20K-hGH級分。向其中加入0.6ml 2MTris/HCl(pH7.8)將pH調(diào)為7.2，用Centriplus-10(Millipore公司)濃縮。取0.5ml該濃縮液上樣于已用含10％乙醇的PBS平衡的SuperdexTM75 HR 10/30(1.0cmφ×30cm，Pharmacia Biotech公司)，然后用含10％乙醇的PBS洗脫，得Met-20K-hGH級分7.5ml。
實施例12(除去N-末端Met)將實施例11所得6ml Met-20K-hGH溶液上樣于用20mM Tris/HCl和8M尿素(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱(10mm ID×30cm，Pharmacia Biotech公司)，收集洗脫的Met-20K-hGH級分，再用一種超濾系統(tǒng)(DiafloW膜YM10，25mm，Amicon，Inc.)濃縮成2ml。向其中加入2.5M乙醛酸、40mM硫酸銅、和50％吡啶的溶液0.5ml，充分攪拌，25℃反應(yīng)60分鐘。然后上樣于用20mMTris/HCl和4M尿素(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱(10mm ID×40cm，Pharmacia Biotech公司)，收集到具有蛋氨酸二酮殘基的20K-hGH級分4毫升。向其中加入1.2M乙酸、2.4M甲酸鈉、3.6M尿素、和48mM 3，4-二氨基苯甲酸共20ml，充分攪拌，然后30℃反應(yīng)65小時。將反應(yīng)產(chǎn)物上樣于用20mM Tris/HCl和4M尿素(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱(20mm ID×40cm，Pharmacia Biotech公司)以收集20K-hGH級分，進行高速液相層析(Gilson HPLC系統(tǒng)，gilson公司)，其中將所述級分上樣于已用50mM Tris/HCl和2.5M尿素/10％乙腈(pH8.2)平衡的HiLoadTMQ Sepharose 16/10 HP柱(1.6cmφ×10cm，Pharmacia Biotech公司)進行吸附，充分洗滌后，在0％-100％B的pH梯度(用A＝50mM Tris/HCl、2.5M尿素和10％乙腈(pH8.2)以及B＝50mM MES[2-(N-嗎啉代)乙基磺酸]、2.5M尿素和10％乙腈(pH4.0)產(chǎn)生)中以3.0ml/min的流速洗脫60分鐘，得12ml的20K-hGH級分。向其中加入0.6ml 2M Tris/HCl(pH7.8)將pH調(diào)為7.2，用Centriplus-10(Millipore公司)濃縮。取0.5ml該濃縮液上樣于已用含10％乙醇的PBS平衡的SuperdexTM75 HR 10/30(1.0cmφ×30cm，Pharmacia Biotech公司)，然后用含10％乙醇的PBS洗脫，得20K-hGH級分7.5ml。
實施例13(鑒定20K-hGH)(a)N-末端氨基酸序列分析用氣相蛋白質(zhì)測序儀(Perdin Elmer Applied Biosystems，477A型)測定N-末端氨基酸序列。所得20K-hGH的N-末端氨基酸序列與由cDNA堿基序列推導的20K-hGH的N-末端氨基酸序列一致(表4)。
表4殘基編號 所測的PTH1)氨基酸(pM) 由20K-hGH堿基序列推導的氨基酸1 Phe(642)Phe2 Pro(504)Pro3 Thr(342)Thr4 Ile(410)Ile5 Pro(200)Pro6 Leu(378)Leu7 Ser(95) Ser8 Arg(170)Arg9 Leu(285)Leu10 Phe(262)Phe1)苯基硫代乙內(nèi)酰脲用1nmol進行分析。
(b)氨基酸組成的分析用氨基酸分析儀(6300系統(tǒng)，Beckman公司)測定了氨基酸組成。實施例12中得到的20K-hGH的氨基酸組成與由20K-hGH的cDNA堿基序列推導的氨基酸組成一致(表5)。
表5氨基酸 每摩爾的殘基數(shù) 由20K-hGH堿基序列推導的值A(chǔ)sx 20.220Thr1)9.7 10Ser1)16.517Glx 22.022Pro 6.9 7Gly 8.0 8Ala 6.2 6Cys2)N.D.4Val 7.0 7Met 2.9 3Ile 6.5 7
Leu 24.3 25Tyr 5.96Phe 12.2 12His 3.13Lys 7.17Arg 10.7 11Trp N.D. 1酸水解(使用6N HCl-1％苯酚，110℃，水解24和水解48小時的平均值)，用約20μg進行了分析。
1)0小時外插值。
2)未檢出。
實施例14(20K-hGH的活性測定)實施例12所得的20K-hGH對Nb2細胞的生長促進活性(臨床內(nèi)分泌學和代謝，51卷，1058頁(1980))得到證實。
實施例15(具有蛋氨酸殘基的人BTC(人Met-BTC)的產(chǎn)生)根據(jù)平成6年專利申請87894號(EP-A-A0555785)中實施例4-6，8和13，用以下方法產(chǎn)生人Met-BTC。
(在大腸桿菌中構(gòu)建人BTC cDNA表達載體)將編碼人前BTC(1-147氨基酸殘基)的0.6Kb EcoRI-BamHI片段從平成6年專利申請87894號(EP-A-0555785)之實施例5所述質(zhì)粒pTB1515中分離。將帶有ATG翻譯起始密碼子(5′-TATGGATGGG-3′；5′-AATTCCCATCCA-3′)的人工合成接頭連接至所述0.6Kb EcoRI-BamHI片段的EcoRI位點，將所得0.6Kb的NdeI-BamHI片段插入含T7啟動子(Gene、56卷、125頁(1987))的質(zhì)粒pET-3c中，構(gòu)建質(zhì)粒pTB1505。
為了獲得編碼人BTC的80個氨基酸殘基(平成6年專利申請87894號(EP-A-0555785)的圖10-1和圖10-2中1(Asp)到80(Tyr))，以質(zhì)粒pTB1505為模板，2個寡核苷酸(5′-ATACATATGGATGGGAATTCCA-3′；5′-CCGGATCCTAGTAAAACAAGTCAACTCT-3′)為引物進行PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))。產(chǎn)物用NdeI及BamHI消化，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，分離得到0.25Kb目的DNA片段。用T4 DNA連接酶將這個0.25Kb的NdeI-BamHI片段連接于pET-3c的T7啟動子下游，獲得了質(zhì)粒pTB1516(參照平成6年專利申請87894號(EP-A-0555785)的圖13)。
(在大腸桿菌里表達人Met-BTC)將大腸桿菌MM294用含T7 RNA聚合酶基因的λ噬菌體(Studier，出處同上)溶源化。然后將質(zhì)粒pLysS導入該大腸桿菌MM294(DE3)，獲得了大腸桿菌MM294(DE3)/pLysS。將上述質(zhì)粒pTB1516導入這些細胞，獲得了大腸桿菌MM294(DE3)/pLysS，pTB1516。
將該轉(zhuǎn)化體于2升燒瓶中含50μg/ml氨芐青霉素和15μg/ml氯霉素的1升LB培養(yǎng)基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉)內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)8小時。將得到的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至含有19升發(fā)酵培養(yǎng)基(1.68％磷酸氫二鈉、0.3％磷酸二氫鉀、0.1％氯化銨、0.05％氯化鈉、0.05％硫酸鎂、0.02％消泡劑、0.00025％硫酸亞鐵、0.0005％鹽酸硫胺素、1.5％葡萄糖、1.5％酪蛋白氨基酸)的50升裝發(fā)酵罐里，在30℃開始通氣攪拌培養(yǎng)。當培養(yǎng)液濁度達到約500克萊特單位時添加100mg/L異丙基硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTQ)，繼續(xù)培養(yǎng)，7小時以后終止培養(yǎng)。離心分離培養(yǎng)液，得到約340g濕重的細胞，-80℃凍存。
將該轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(MM294(DE3)/pLysS，pTB1516)于1992年4月21日保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)，保藏號FERM BP-3836，并于1992年4月16日保藏于財團法人發(fā)酵研究所(IFO)，保藏號IFO 15282。
將上述方法所得具有N-末端蛋氨酸殘基的人β-動物纖維素(Met-BTC)10mg溶于4ml的3M尿素溶液，加入80mM硫酸銅0.25ml、乙醛酸0.25g、和吡啶0.5ml的混合液，25℃下反應(yīng)1小時。然后將反應(yīng)液上樣于用2.5M尿素+50mM磷酸緩沖液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(25mm ID×600mm L)，用平衡液以6ml/min的流速繼續(xù)，收集具有蛋氨酸二酮殘基的BTC級分。向其中加入等量的2M乙酸、4M甲酸鈉、3M尿素溶液，然后加3，4-二氨基苯甲酸至40mM濃度，抽氣，氮氣密封，25℃反應(yīng)5天。然后將反應(yīng)液上樣于用50mM磷酸緩沖液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(46mm ID×600mm L)，用平衡液以10ml/min的流速展開，收集不含有N-末端蛋氨酸殘基的BTC級分。將收集到的級分調(diào)整到pH6.0，吸附至已用50mM磷酸緩沖液+0.1M NaCl+2.5M尿素(pH5.0)平衡的CM-5PW(21.5mm ID×150mm L，Tosoh Corporation)，在0-100％B(B＝50mM硼酸緩沖液+0.1M NaCl+2.5M尿素，pH9.0)的梯度中以6ml/min的流速洗脫60分鐘，得到BTC級分。將其吸附于已用0.1％TFA平衡的C4P-50(10mm ID×250mmL，Showa Denko K.K.)，在20-60％B(B＝80％乙腈/0.1％TFA)的梯度中以2ml/min的流速洗脫40分鐘。收集BTC級分，凍干，獲得約2.6mg的BTC。
實施例16(BTC的鑒定)a)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的分析將實施例15得到的BTC懸浮于樣品緩沖液(Laemmli，自然，227，680(1970))100℃加熱1分鐘后，用Multigel 15/25(第一化學藥品株式會社)電泳。電泳后的凝膠用考馬斯亮藍染色，觀察到一條蛋白質(zhì)帶，從而證實純化產(chǎn)物基本為單體(圖2)。
b)N-末端氨基酸序列分析用氣相蛋白質(zhì)測序儀(Perdin Elmer Applied Biosystems，477A型)測定N-末端氨基酸序列。所得BTC的N-末端氨基酸序列與由BTC cDNA堿基序列推導的BTC N-末端氨基酸序列一致(表6)。
表6殘基編號所測的PTH1)氨基酸(pM) 由BTC堿基序列推導的氨基酸(pM)1 Asp(261) Asp2 Gly(457) Gly3 Asn(300) Asn4 Ser(107) Ser5 Thr(75) Thr6 Arg(181) Arg7 Ser(121) Ser8 Pro(245) Pro9 Glu(55) Glu10Thr(71) Thr11Asn(133) Asn12Gly(149) Gly13Leu(132) Leu14Leu(155) Leu
15 N.D. Cys16 Gly(111) Gly17 Asp(70) Asp18 Pro(65) Pro19 Glu(29) Glu20 Glu(64) Glu用1nmol進行了分析。
N.D.未檢出1)苯基硫代乙內(nèi)酰脲c)氨基酸組成分析用氨基酸分析儀(Beckman 6300E系統(tǒng))測定了氨基酸組成。所得BTC的氨基酸組成與由BTC的cDNA堿基序列推導的氨基酸組成一致(表7)。
表7氨基酸每摩爾的殘基數(shù)由BTC堿基序列推導的值A(chǔ)sx 7.0 7Thr1)6.1 6Ser1)4.8 5Glx 9.3 9Pro 3.8 4Gly 7.1 7Ala 4.0 4Cys2)N.D. 8Val 3.9 4Met 00Ile 1.9 2Leu 3.0 3Tyr 3.7 4Phe 3.3 3His 2.3 2Lys 5.0 5Arg 6.9 7
Trp 00酸水解(使用6N HCl和1％苯酚，110℃、水解24和水解48小時的平均值)1)0小時外插值。
2)未檢出。
用約20μg進行分析d)C-末端氨基酸的分析用氨基酸分析儀(Beckman 6300E系統(tǒng))測定了C-末端氨基酸。所得到的BTC與cDNA堿基序列推導的C-末端氨基酸序列一致(表8)。
表8C-末端氨基酸分析C-末端氨基酸 回收率(％)BTCTyr 44.6氣相肼解(100℃、3.5小時)對15nmol進行分析。
e)BTC的生物活性根據(jù)分子細胞生物學8、588(1988)記載的方法，使用BALB/C3T3A31-714克隆4(國際癌癥雜志，12，463(1973))測定純化產(chǎn)物的活性，證實所述產(chǎn)物的活性與標準品的等同。
實施例17如平成10年專利申請72489號(EP-A-812856)參考例5所述，獲得具有N-末端蛋氨酸殘基的人白細胞介素2(Met-IL-2)50mg，將其溶于40ml的4M尿素溶液，然后加入100mM硫酸銅2.5ml、乙醛酸2.5g、吡啶溶液5.0ml的混合液，25℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液上樣于用10mM磷酸緩沖液+2.5M尿素(pH5.0)平衡的Sephadex G-25柱(46mm ID×600mm L)，用平衡液以10ml/min的流速洗脫，收集具有蛋氨酸二酮殘基的IL-2級分。向其中加入等量的2M乙酸、4M甲酸鈉、3M尿素溶液，然后加3，4-二氨基苯甲酸至終濃度40mM，抽氣，氮氣密封，25℃反應(yīng)5天。
反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液上樣于用10mM磷酸緩沖液+2.5M尿素(pH5.0)平衡的Sephadex G-25柱(46mm ID×600mm L)，用平衡液以10ml/min的流速洗脫，收集不含N-末端蛋氨酸殘基的IL-2級分。將收集到的IL-2級分吸附至已用25mM磷酸緩沖液(pH7.0)平衡的SP-5PW(21.5mm ID×150mm L，Tosoh Corporation)，然后在30-80％B(B＝25mM磷酸緩沖液，pH8.0)梯度中以6ml/min的流速洗脫60分鐘，得到17.3mg的IL-2級分。
實施例18(IL-2的鑒定)a)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的分析將實施例17得到的IL-2懸浮于樣品緩沖液(Laemmli，自然，227，680(1970))100℃加熱1分鐘后，用Multigel 15/25(第一化學藥品株式會社)進行了電泳。電泳后的凝膠用考馬斯亮藍染色，觀察到一條蛋白質(zhì)帶，從而證實純化的蛋白質(zhì)基本為單體(圖3)。
b)N-末端氨基酸序列分析用氣相蛋白質(zhì)測序儀(Perdin Elmer Applied Biosystems，477A型)測定N-末端氨基酸序列。所得IL-2的N-末端氨基酸序列與由IL-2 cDNA堿基序列推導的IL-2 N-末端氨基酸序列一致(表9)。
表9殘基編號所測的PTH1)氨基酸(pM) 由IL-2堿基序列推導的氨基酸1Ala(701)Ala2Pro(354)Pro3Thr(359)Thr4Ser(122)Ser5Ser(128)Ser6Ser(78) Ser7Thr(46) Thr8Lys(176)Lys9Lys(61) Lys10 Thr(40) Thr用1nmol進行分析。
1)苯基硫代乙內(nèi)酰脲c)氨基酸組成分析用氨基酸分析儀(Beckman 6300E系統(tǒng))測定了氨基酸組成。所得BTC的氨基酸組成與由IL-2的cDNA堿基序列推導的氨基酸組成一致(表10)。
表10氨基酸每摩爾的殘基數(shù)由IL-2堿基序列推導的值
Asx 11.812Thr1)12.913Ser1)7.0 8Glx 18.418Pro 4.8 5Gly 2.0 2Ala 4.8 5Cys2)N.D.3Val 3.5 4Met 3.8 4Ile 7.7 9Leu 22.022Tyr 2.8 3Phe 5.6 6His 2.9 3Lys 10.311Arg 3.7 4Trp 0.9 1酸水解(使用6N HCl-4％巰基乙酸，110℃，水解24和水解48小時的平均值)1)0小時外插值。
2)未檢出。
d)C-末端氨基酸的分析用氨基酸分析儀(Beckman 6300E系統(tǒng))測定了C-末端氨基酸。所得到的IL-2與cDNA堿基序列推導的C-末端氨基酸一致(表11)。
表11C-末端氨基酸分析C-末端氨基酸 回收率(％)IL-2Thr 32.5氣相肼解(100℃，3.5小時)用15nmol進行分析。
e)IL-2的生物活性根據(jù)日沼(Hinuma)所述利用依賴IL-2的細胞的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.，109，363(1982))測定生物活性，證實了該生物活性與標準品具有同等活性。
實施例19(Met-hGH的活化)將4升50mM Tris/乙酸，8M鹽酸胍溶液(pH8.5)加入?yún)⒖祭?所得的1kg細胞中，使細胞溶解，然后離心(10,000rpm)。所得上清液4升中加入44升的50mM Tris/乙酸，1.09mM還原型谷胱苷肽，0.055mM氧化型谷胱苷肽、109mM精氨酸、4.36M尿素溶液(pH8.0)，4℃活化3天。活化后，加入約25升的20mM Tris/乙酸，2.5M尿素溶液(pH8.0)，在Pellicon盒系統(tǒng)(Biomax 8膜，Millipore Corporation)中濃縮并脫鹽，直到導電性不超過5mS/cm。加入20mM Tris/乙酸(pH8.0)約35升再次脫鹽，然后離心(10,000rpm)獲得上清。將上清液吸附于經(jīng)20mM Tris/乙酸(pH8.0)平衡的DEAE-Toyopearl 650M柱(30cmφ×60cm，Tosoh公司)，再用20mM Tris/乙酸(pH8.0)及20mM Tris/乙酸、25mM氯化鈉溶液(pH8.0)充分洗滌，用20mM Tris/乙酸和55mM氯化鈉溶液(pH8.0)洗脫，獲得50升的Met-hGH級分。經(jīng)Pellicon盒系統(tǒng)(Biomax 8膜，Millipore Corporation)濃縮和脫鹽，得到Met-hGH。
實施例20(Met-hGH的活化)將50mM Tris/乙酸，8M鹽酸胍溶液(pH8.5)4升加入?yún)⒖祭?所得的1kg細胞中，使細胞溶解，然后離心(10,000rpm)。所得上清液4升中加入44升的50mM Tris/乙酸，5.45mM一水合半胱氨酸鹽酸，109mM精氨酸和4.19M尿素溶液(pH8.0)，4℃活化3天。活化的Met-hGH比實施例19所得多約1.2倍。活化后，加入25升的20mM Tris/乙酸，2.5M尿素溶液(pH8.0)，在Pellicon盒系統(tǒng)(Biomax 8膜，Millipore Corporation)中濃縮并脫鹽，直到導電性不超過5mS/cm。加入20mM Tris/乙酸(pH8.0)約35升再次脫鹽，然后離心(10,000rpm)獲得上清。將上清液吸附于經(jīng)20mM Tris/乙酸(pH8.0)平衡的DEAE-Toyopearl 650M柱(30cmφ×60cm，Tosoh公司)，再用20mM Tris/乙酸(pH8.0)及20mM Tris/乙酸、25mM氯化鈉溶液(pH8.0)充分洗滌，用20mM Tris/乙酸和55mM氯化鈉溶液(pH8.0)洗脫，獲得50升的Met-hGH級分。經(jīng)Pellicon盒系統(tǒng)(Biomax 8膜，Millipore Corporation)濃縮和脫鹽，得到Met-hGH。
實施例21(Met-hGH的活化)
將5升50mM Tris/乙酸，8M鹽酸胍溶液(pH8.5)加入?yún)⒖祭?所得的1.25g細胞中，使細胞溶解，然后離心(10,000rpm)。所得上清液5升中加入55ml的50mM Tris/乙酸，5.45mM N-乙酰-L-半胱氨酸，109mM精氨酸、和4.91M尿素溶液(pH8.0)，4℃活化3天。所觀察到的活化效率等同于實施例20的(其中添加的是一水合半胱氨酸鹽酸)。
實施例22(Met-hGH的活化)將5升50mM Tris/乙酸，8M鹽酸胍溶液(pH8.5)加入?yún)⒖祭?所得的1.25g細胞中，使細胞溶解，然后離心(10,000rpm)。所得上清液5升中加入55ml的50mM Tris/乙酸，5.45mM半胱氨酸鹽酸，109mM精氨酸、和4.91M尿素溶液(pH8.0)，4℃活化3天。所觀察到的活化效率等同于實施例20的(其中添加的是一水合半胱氨酸鹽酸)。
實施例23根據(jù)平成10年專利申請72489號(EP-A-812856)的參考例3記載的方法產(chǎn)生具有N-末端蛋氨酸殘基的人促神經(jīng)激素-3(Met-NT-3)。
將50mg具有N-末端蛋氨酸的人促神經(jīng)激素-3(Met-NT-3)溶于8ml 3M尿素溶液中，加入0.2M硫酸銅0.4ml、乙醛酸0.5g、吡啶1ml的混合液10ml，25℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液上樣于用2.5M尿素+10mM磷酸緩沖液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(25mm ID×66mm L)，用平衡液以4ml/min的流速洗脫，收集具有蛋氨酸二酮的NT-3級分。向其中加入等量的2M乙酸、4M甲酸鈉、3M尿素溶液，然后加3，4-二氨基苯甲酸至終濃度40mM，25℃反應(yīng)5天。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液上樣于用2.5M尿素+10mM磷酸緩沖液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(46mm ID×600mm L)，用平衡液以10ml/min的流速洗脫，收集N-末端不含有蛋氨酸殘基的人促神經(jīng)激素-3(NT-3)級分。將其pH調(diào)整為5.0，再吸附至已用50mM磷酸緩沖液+0.2MNaCl+2.5M尿素pH5.0)平衡的CM-5PW(21.5mm ID×150mm L，Tosoh公司)，然后用0-100％B(B＝50mM磷酸緩沖液+0.2M NaCl+2.5M尿素、(Ph8.0))的梯度以6ml/min的流速洗脫60分鐘，收集NT-3級分。再將NT-3級分吸附于經(jīng)過0.1％TFA平衡的C4P-50(21.5mm ID×300mm L，昭和電工(株))，然后通過20-60％B(B＝80％乙腈/0.1％TFA)梯度以5ml/min的流速洗脫40分鐘。收集NT-3級分，冷凍干燥，獲得約5mg NT-3凍干粉。
實施例24(NT-3的鑒定)
a)N-末端氨基酸序列分析用氣相蛋白質(zhì)測序儀(Perdin Elmer Applied Biosystems，477A型)測定N-末端氨基酸序列。所得NT-3的N-末端氨基酸序列與由NT-3 cDNA堿基序列推導的NT-3 N-末端氨基酸序列一致(表12)。
表12殘基編號所測的PTH1)氨基酸(pM) 由NT-3堿基序列推導的氨基酸1Tyr(410) Tyr2Ala(521) Ala3Glu(155) Glu4His(213) His5Lys(587) Lys6Ser(91)Ser7His(161) His8Arg(318) Arg9Gly(214) Gly10 Glu(108) Glu11 Tyr(104) Tyr12 Ser(50)Ser13 Val(208) Val14 N.D. Cys15 Asp(99)Asp16 Ser(41)Ser17 Glu(24)Glu18 Ser(27)Ser19 Leu(63)Leu20 Trp(26)Trp用1nmol進行分析。
N.D.未檢出*)苯基硫代乙內(nèi)酰脲b)氨基酸組成分析用氨基酸分析儀(Beckman 6300E系統(tǒng))測定了氨基酸組成。所得氨基酸組成與由NT-3 eDNA堿基序列推導的氨基酸組成一致(表13)。
表13氨基酸 每摩爾的殘基數(shù) 由NT-3堿基序列推導的值A(chǔ)sx 11.0 11Thr*)8.7 9Ser*)10.4 12Glx 11.0 11Pro 1.7 2Gly 8.0 8Ala 4.8 5Cys N.D. 6Val 8.7 9Met 0 0Ile 6.7 7Leu 5.0 5Tyr 5.1 5Phe 1.2 1His 4.3 4Lys 9.7 10Arg 9.6 10Trp 3.8 4酸水解(使用6N HCl-4％巰基乙酸，110℃，水解24和水解48小時的平均值)N.D.未檢出*)0小時外插值。
用約20μg進行分析。
d)C-末端氨基酸的分析用氨基酸分析儀(Beckman 6300E系統(tǒng))測定了C-末端氨基酸。所得氨基酸與cDNA堿基序列推導的C-末端氨基酸一致(表14)。
表14
C-末端氨基酸 回收率(％)NT-3Thr 42.0氣相肼解(100℃，3.5小時)用15nmol進行分析。
e)NT-3的生物活性實施例23所得NT-3的生物活性用DRG(脊后根神經(jīng)節(jié)，取自37.5℃孵8-10天的受精卵)測定，其證實所述NT-3具有與從CHO細胞得到的NT-3相同的活性程度。
實施例25在實施例2所得14.75ml的Met-hGH溶液加入6M尿素溶液至終體積為60ml，再加入0.5M硫酸銅1.2ml、乙醛酸3.75g、和吡啶7.5ml的混合液至終體積為75ml，然后25℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后，使反應(yīng)液流過已用4M尿素+20mM Tris緩沖液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱(4.6cm ID×60cmL)，用平衡液以10ml/min的流速洗脫，收集具有蛋氨酸二酮殘基的hGH級分。向其中加入等量的由2M乙酸、4M甲酸鈉、和4M尿素組成的溶液，然后加3，4-二氨基苯甲酸使終濃度為40mM，30℃反應(yīng)4天。反應(yīng)結(jié)束后，使反應(yīng)液流過用4M尿素+20mM Tris緩沖液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱(11.3cm ID×80cm L)，用平衡液以30ml/min的流速洗脫，收集N-末端不含有蛋氨酸殘基的hGH級分。將收集的hGH級分上樣于用50mM Tris緩沖液+2.5M尿素(pH8.0)平衡的DEAE-5PW(5.5cm ID×20cm L，Tosoh公司)而吸附，然后用0-100％B(B＝50mM MES+2.5M尿素、pH4.0)的梯度以15ml/min的流速洗脫60分鐘，收集到了hGH級分約60mg。
實施例26(人apelin-36結(jié)構(gòu)基因的制備)用圖4所示的6種DNA片段(#1和#5Greiner Japan Co.Ltd.；#2和#6Kikotedc Co.；#3和#4Amersham Pharmacia Biotech)制備apelin-36結(jié)構(gòu)基因(圖5)。
a)DNA寡聚體的磷酸化除了#1和#6寡聚體以外，將其余4種寡聚體各1μg指定為5′末端，在100μL磷酸化反應(yīng)液[50mM Tris/HCl(pH7.6)，10mM MgCl2，1mM亞精胺、10mM DTT，0.1mg/ml牛血清清蛋白，1mM ATP，10單位的T4多核苷酸激酶(日本基因)]中37℃反應(yīng)1小時，使5′末端磷酸化。經(jīng)酚抽提后，吸取上層水相，加入2倍體積的乙醇冷卻至-70℃，離心使DNA沉淀。
b)DNA片段的連接將上述a)所得磷酸化的DNA片段與#1和#6各1μg混合至終體積120μL。將上述混合液在80℃保溫10分鐘，緩慢冷卻到室溫，使所述片段退火。用第二代TaKaRa DNA連接試劑盒(寶酒造)進行連接反應(yīng)。在退火溶液30μL中加入溶液II30μL，充分混合，再加入溶液I60μL，37℃1個小時以便實施連接。酚抽提后，吸取上層水相，加入2倍體積的乙醇，冷卻至-70℃，離心使DNA沉淀。
c)5′末端的磷酸化將沉淀物溶于10μL TE緩沖液(10mM Tris/HCl(pH8.0)，1mM EDTA)，使之在100μL磷酸化反應(yīng)液[50mM Tris/HCl(pH7.6)，10mM MgCl2，1mM亞精胺，10mM DTT，0.1mg/ml牛血清清蛋白，1mM ATP，10單位的T4多核苷酸激酶(日本基因)]中37℃反應(yīng)1小時。酚抽提后，吸取上層水相，加入2倍體積的乙醇，冷卻至-70℃，離心使DNA沉淀將其溶于20μl TE緩沖液中。
實施例27人apelin-36表達質(zhì)粒的制備用XbaI及AvaI消化pTB960-2(EP-A-499990小山等，生物技術(shù)雜志32卷，273頁)，經(jīng)過1％的瓊脂糖電泳，用QIAquick Gel ExtractionKit(QIAGEN)抽提約4.4Kbp的DNA片段，將其溶于25μL TE緩沖液中。將這些pTB960-2的XbaI及AvaI片段和上述制備的人apelin-36結(jié)構(gòu)基因通過第二代TaKaRa DNA連接試劑盒(寶酒造)來進行連接反應(yīng)。即，將pTB960-2的XbaI及AvaI片段溶液1μL與人apelin-36結(jié)構(gòu)基因溶液4μL混合，加入5μL的溶液I，16℃反應(yīng)30分鐘以實施連接。用10μL連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞(東洋紡)，將其接種在含有10μg/ml四環(huán)素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)1天，選擇四環(huán)素抗性菌落。這些轉(zhuǎn)化體用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，用QIAprep 8 Miniprep Kit(QIAGEN)制備質(zhì)粒pTB960-13。用Applied Biosystems 377型DNA測序儀證實該人apelin-36結(jié)構(gòu)基因片段的堿基序列。用質(zhì)粒pTB960-13轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)株(Novagen公司)，將其接種在含有10μg/ml四環(huán)素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)1天，得到人apelin-36-CS23融合蛋白表達菌株BL21(DE3)/pTB960-13(圖6)。將這個轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)/pTB960-13于1998年12月2日保藏于通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工學工業(yè)技術(shù)研究所，保藏號FERM BP-6590，另于1998年11月11日保藏于財團法人發(fā)酵研究所(IFO)，保藏號IFO16220。
實施例28在含1升LB培養(yǎng)基(1％蛋白胨，0.5％酵母抽提物，0.5％氯化鈉)和5.0mg/l四環(huán)素的2升裝燒瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)實施例27所得轉(zhuǎn)化細胞8小時。將所得培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至含19升發(fā)酵培養(yǎng)基(1.68％磷酸氫二鈉、0.3％磷酸二氫鉀、0.1％氯化銨、0.05％氯化鈉、0.05％硫酸鎂、0.02％消泡劑、0.00025％硫酸亞鐵、0.00025％鹽酸硫胺素、1.5％葡萄糖、1.5％酪蛋白氨基酸)的50升裝發(fā)酵罐里，30℃開始通氣培養(yǎng)。當培養(yǎng)液濁度達約500Klett單位時，添加異丙基硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷至終濃度為12mg/l，然后再培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)結(jié)束后，離心培養(yǎng)液，得濕重約660g的細胞，-80℃凍存。
實施例29人apelin-36的獲得在實施例28所得550g細胞中加入10mM EDTA+1mM(對酰胺基苯基)-甲磺酰氯鹽酸(pH6.0)溶液1500ml，超聲破碎(Branson超聲儀450型)，離心(10,000rpm，60min)。收集上清液，沉淀物再次重復(fù)同樣的操作。將所收集的上清液pH調(diào)至6.0，上樣于已用50mM磷酸緩沖液(pH6.0)平衡的AF-Heparin Toyopearl 650M層析柱(30mm ID×500mm L，Tosoh公司)，以便吸附，然后洗脫，再用0-100％B(B＝50mM磷酸緩沖液+2MNaCl，pH6.0)梯度洗脫，得到530ml人apelin-36-CS23融合蛋白級分。
用Pellicon Mini盒(Millipore公司)加0.1M乙酸使該洗脫液濃縮，得到人apelin-36-CS23融合蛋白的0.1M乙酸溶液。添加尿素至終濃度為6M，然后加入1-氰基-4-二甲基氨基吡啶嗡鹽(DMAP-CN)35mg，室溫反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液上樣于用10％乙酸平衡的Sephadex G-25柱(46mmID×600mm L，Pharmacia)，用平衡液10％乙酸以6ml/min的流速洗脫，獲得S-氰化的人apelin-36-CS23融合蛋白級分。使該洗脫液在Pellicon Mini盒(Millipore Corporation)中濃縮并脫鹽，得到人apelin-36-CS23融合蛋白的脫鹽液。向其中加入尿素至終濃度為6M，再加入1N苛性鈉至終濃度0.06N，0℃反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用乙酸調(diào)整pH為6.0，得到人apelin-36。將其上樣于已用含3M尿素之50mM磷酸緩沖液(pH6.5)平衡的SP-5PW(21.5mm ID×150mm L，Tosoh公司)進行吸附，洗滌后，用0-40％B(B＝50mM磷酸緩沖液+1M NaCl+3M尿素，pH6.5)梯度洗脫，得到人apelin-36級分。將它們上樣于已用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡的C4P-50(21.5mm ID×300mm L，昭和電工)，洗滌后，用15-30％B(B80％乙腈/0.1％TFA)的梯度洗脫，收集到人apelin-36級分，凍干，得到人apelin-36凍干粉。
a)氨基酸組成分析用氨基酸分析儀(日立L-8500A氨基酸分析儀)測定了氨基酸組成。
如此獲得的氨基酸組成與具有N-末端蛋氨酸殘基之人apelin-36的DNA堿基序列所推導的氨基酸組成一致(表15)。
表15氨基酸組成分析氨基酸 每摩爾的殘基數(shù) 由人apelin-36的堿基序列所推導的值A(chǔ)sx 1.0 1Thr1)0 0Ser1)1.9 2Glx 3.0 3Pro 5.7 6Gly 5.7 6Ala 0 0Cys2)N.D.0Val 1.0 lMet 2.0 1Ile 0 0Leu 2.0 2Tyr 0 0Phe 1.9 2His 1.0 1Lys 1.8 2Arg 7.3 8Trp 0.9 1酸水解(使用6N HCl-4％巰基乙酸，110℃，水解24和水解48小時的平均值)
1)0小時外插值。
2)未檢出。
b)N-末端氨基酸序列分析用氣相蛋白質(zhì)測序儀(Applied Biosystems 477A型)測定N-末端氨基酸序列。所得 apelin-36的氨基酸序列除了在N-末端具有蛋氨酸殘基以外，還與DNA堿基序列所推導的N-末端氨基酸序列一致(表16)。
表16N-末端氨基酸序列殘基編號 所測的PTH1)氨基酸 由人apelin-36的堿基序列推導的氨基酸(pM)1Met(526)2Leu(648) Leu3Val(513) Val4Gln(437) Gln5Pro(463) Pro6Arg(216) Arg7Gly(232) Gly8Ser(129) Ser9Arg(129) Arg10 Asn(142) Asn11 Gly(185) Gly12 Pro(219) Pro13 Gly(202) Gly14 Pro(188) Pro15 Trp(88) Trp16 Gln(116) Gln17 Gly(120) Gly18 Gly(72) Gly19 Arg(56) Arg20 Arg(40) Arg用1nmol進行分析。
1)苯基硫代乙內(nèi)酰脲
c)C-末端氨基酸的分析用氨基酸分析儀(日立L-8500A氨基酸分析儀)測定了C-末端氨基酸。(表17)。
表17C-末端氨基酸的分析C-末端氨基酸 回收率(％)人apelin-36Phe 38.6氣相肼解(100℃，6小時)經(jīng)過以上鑒定，實施例29所得人apelin-36屬于在N-末端具有蛋氨酸殘基的一類分子(Met-apelin-36(人))。
實施例30(生物活性測定)根據(jù)平成10年專利申請271645號中實施例6的方法(Cytosensor)測定實施例29所得Met-apelin-36的活性，證實該Met-apelin-36(人)具有等同于人工合成的人apelin-36的活性。
實施例31(除去N-末端蛋氨酸殘基)將實施例29所得4mg的Met-apelin-36(人)溶于3M尿素溶液0.8ml，加入含有80mM硫酸銅0.05ml、乙醛酸0.046g、和吡啶0.1ml的混合液，25℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液上樣于用2.5M尿素+10mM磷酸緩沖液(pH5.5)平衡的Sephadex G-25層析柱(10mm ID×250mm L)，用平衡液以0.5ml/min的流速洗脫，收集具有蛋氨酸二酮殘基的人apelin-36級分。向其中加入含2M甲酸鈉、4M乙酸、和3M尿素的等體積溶液，再加3，4-二氨基苯甲酸至終濃度為40mM，30℃反應(yīng)3天。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液上樣于用50mM磷酸緩沖液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25層析柱(25mm ID×600mm L)，用平衡液以4ml/min的流速洗脫，收集N-末端不含有蛋氨酸殘基的人apelin-36級分。將收集到的人apelin-36級分的pH值調(diào)整到6.0，再吸附至用50mM Tris緩沖液+0.1 NaCl+2.5M尿素(pH5.0)平衡的CM-5PW(7.5mm ID×75mm L，Tosoh公司)，然后用0-100％B(B＝50mM硼酸緩沖液+0.1M NaCl+2.5M尿素，pH9.0)的梯度以0.8ml/min的流速洗脫40分鐘，收集人apelin-36級分。然后將此人apelin-36級分再吸附至用0.1％TFA平衡的C4P-50(10mm ID×250mm L，昭和電工(株))，然后用15-30％B(B＝80％乙腈/0.1％TFA)的梯度以2ml/min的流速洗脫40分鐘。收集人apelin-36級分，凍干，得到人apelin-36。
a)氨基酸組成分析用氨基酸分析儀(日立L-8500A氨基酸分析儀)測定了氨基酸組成。
如此獲得的氨基酸組成與由hA10L的DNA堿基序列所推導的氨基酸組成一致(表18)。
表18氨基酸組成分析氨基酸 每摩爾的殘基數(shù) 由人apelin-36的堿基序列所推導的值A(chǔ)sx 1.0 1Thr1)0 0Ser1)1.9 2Glx 2.9 3Pro 6.3 6Gly 5.9 6Ala 0 0Cys2)N.D.0Val 1.0 1Met 1.0 1Ile 0 0Leu 2.0 2Tyr 0 0Phe 1.9 2His 1.0 1Lys 1.9 2Arg 7.6 8Trp 0.9 1酸水解(使用6N HCl-4％巰基乙酸，110℃，水解24和水解48小時的平均值)1)0小時外插值。
2)未檢出。
b)N-末端氨基酸序列分析用氣相蛋白質(zhì)測序儀(Applied Biosystems 477A型)測定N-末端氨基酸序列。所得氨基酸序列與人apelin-36的DNA堿基序列所推導的N-末端氨基酸序列一致(表19)。
表19N-末端氨基酸序列殘基編號 所測的PTH1)氨基酸 由人apelin-36的堿基序列推導的氨基酸(pM)1 Leu(475)Leu2 Val(845)Val3 Gln(365)Gln4 Pro(563)Pro5 Arg(425)Arg6 Gly(424)Gly7 Ser(138)Ser8 Arg(423)Arg9 Asn(245)Asn10Gly(290)Gly11Pro(197)Pro12Gly(234)Gly13Pro(197)Pro14Trp(101)Trp15Gln(76) Gln16Gly(84) Gly17Gly(130)Gly18Arg(79) Arg19Arg(116)Arg20Lys(43) Lys用1nmol進行分析。
1)苯基硫代乙內(nèi)酰脲c)C-末端氨基酸的分析用氨基酸分析儀(日立L-8500A氨基酸分析儀)測定了C-末端氨基酸。(表20)。
表20C-末端氨基酸的分析C-末端氨基酸 回收率(％)人apelin-36Phe 86.6氣相肼解(100℃，6小時)實施例32(生物活性測定)根據(jù)平成10年專利申請271646號中實施例6的方法(Cytosensor)測定實施例31所得人apelin-36的活性，證實該人apelin-36具有等同于人工合成的人apelin-36的活性。
工業(yè)實用性通過本發(fā)明能夠從具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽、蛋白質(zhì)或其鹽中特異地選擇且有效除去該蛋氨酸殘基，還能有效地合成不含有可被氧化的N-末端蛋氨酸殘基的肽、蛋白質(zhì)或其鹽。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，在溫和的條件下不論肽或蛋白質(zhì)的種類如何，均可以用化學方法除去N-末端的蛋氨酸殘基，因此用基因工程改造的、含有蛋氨酸殘基的肽、蛋白質(zhì)或其鹽作為原料，有利于生產(chǎn)具有天然氨基酸序列的肽或蛋白質(zhì)。
序列表<110>TAKEDA化學工業(yè)公司<120>除去N-末端蛋氨酸的方法<130>2554WOOP<140>PCT/JP99/05456<141>1999-10-04<150>JP10-282476<151>1998-10-05<160>6<210>1<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1ctagaaagga gatatcatat gctggttcaa ccgcgtggtt ct 42<210>2<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2cgtaatggtc cgggtccatg gcaaggtggt cgtcgtaaat ttcgtc 46<210>3<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3gtcaacgtcc gcgtctgtct cataaaggtc cgatgccgtt ttgcc45<210>4<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4gaccattacg agaaccacgc ggttgaacca gcatatgata tctccttt 48<210>5<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>5ggacgttgac gacgaaattt acgacgacca ccttgccatg gacccg 46<210>6<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>6tcggggcaaa acggcatcgg acctttatga gacagacgc 39
權(quán)利要求
1.一種除去可被氧化之蛋氨酸二酮殘基的方法，其特征在于，使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽，在乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉的存在下與3，4-二氨基苯甲酸或其鹽發(fā)生反應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽是通過使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽與α-二酮反應(yīng)而得到的肽或其鹽。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽是經(jīng)基因工程產(chǎn)生的肽。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽是(i)生長激素，(ii)β-動物纖維素，(iii)白細胞介素-2，(iv)促神經(jīng)激素-3，或(v)apelin。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽是生長激素。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉作為緩沖液使用，其濃度約0.1-8mol/l，其pH約2-9。
7.一種除去上述可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮殘基的方法，其中使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽，在乙酸及甲酸鈉的存在下與3，4-二氨基苯甲酸或其鹽發(fā)生反應(yīng)。
8.一種產(chǎn)生N-末端不含有可被氧化之蛋氨酸殘基的肽或其鹽的方法，其特征在于，使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽，在乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉的存在下與3，4-二氨基苯甲酸或其鹽發(fā)生反應(yīng)。
9.權(quán)利要求8的產(chǎn)生方法，其中所述具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽是通過使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽與α-二酮反應(yīng)而得到的肽或其鹽。
10.權(quán)利要求8的產(chǎn)生方法，其特征在于，所述乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉作為緩沖液使用，其濃度約0.1-8mol/l，其pH約2-9。
11.一種產(chǎn)生N-末端不含有可被氧化之蛋氨酸殘基的肽或其鹽的方法，其特征在于，使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽，在乙酸及甲酸鈉的存在下與3，4-二氨基苯甲酸或其鹽發(fā)生反應(yīng)。
12.一種產(chǎn)生N-末端不含有蛋氨酸殘基的人類生長激素或其鹽的方法，其特征在于，使經(jīng)過基因工程產(chǎn)生的、具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的人類生長激素或其鹽在硫酸銅和吡啶存在下與乙醛酸或其鹽反應(yīng)，然后在乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉的存在下與3，4-二氨基苯甲酸或其鹽發(fā)生反應(yīng)。
13.一種應(yīng)用，其用(i)乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其鹽從具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽除去該蛋氨酸殘基。
14.一種應(yīng)用，其用(i)乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其鹽從具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽除去該蛋氨酸二酮殘基。
15.一種應(yīng)用，其用(i)乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其鹽從具有可被氧化之N-末端蛋氨酸殘基的肽或其鹽產(chǎn)生不具有N-末端可被氧化之蛋氨酸殘基的肽或其鹽。
16.一種應(yīng)用，其用(i)乙酸及甲酸鈉、甲酸及甲酸鈉、或甲酸及乙酸鈉，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其鹽從具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽產(chǎn)生不具有N-末端可被氧化之蛋氨酸二酮殘基的肽或其鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使N－末端具有可氧化之蛋氨酸二酮殘基或其鹽的肽除去該蛋氨酸二酮殘基的方法,其特征在于使該肽與3,4－二氨基苯甲酸或其鹽在有乙酸和甲酸鈉、甲酸和甲酸鈉、或甲酸和乙酸鈉存在的情況下反應(yīng);本發(fā)明還涉及一種制備不含N－末端蛋氨酸殘基或其鹽的肽的方法。
文檔編號C07K1/12GK1322211SQ99811785
公開日2001年11月14日 申請日期1999年10月4日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月5日
發(fā)明者西村紀, 淺野常夫, 末永正人, 大前弘明, 奧谷范雄 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社