專利名稱：生物抗菌肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物抗菌肽及其制備方法，特別是涉及一種從林蛙蛙皮提取的抗菌肽及其制備方法。
七十年代末期，瑞典科學(xué)家Boman首先從惜古比天蠶(HyalopHoracecropia)蛹中經(jīng)誘導(dǎo)分離純化了天蠶素(cecropins)，引起了人們的廣泛重視，特別是80年代后期以來對抗菌肽的篩選、純化、結(jié)構(gòu)測定、機(jī)理研究、基因克隆和應(yīng)用研究等方面都取得了顯著的進(jìn)展。1989年Lee等人從豬小腸中發(fā)現(xiàn)并純化了抗菌肽，又有人從牛氣管和兩棲類中發(fā)現(xiàn)并純化了抗菌肽，說明抗菌肽類化合物是廣泛存在的。目前已確定一級結(jié)構(gòu)的抗菌肽有二十幾種，可分為有二硫鍵抗菌肽和不含二硫鍵的抗菌肽，這些抗菌肽的殘基數(shù)一般在20-40之間，具有廣譜抗細(xì)菌、抗病毒和抗癌等重要功能，具有重要的應(yīng)用價值。
本發(fā)明的目的是提供一種制備工藝簡單、原料來源廣泛、成本低廉、抗菌譜廣的生物抗菌肽及其制備方法。
本發(fā)明所涉及的生物抗菌肽以林蛙蛙皮為原料，其制備工藝路線如下1、取林蛙干皮或鮮皮，進(jìn)行除脂，除肌肉的前處理；2、加少量(1～2ml/g干皮)的緩沖液(0.01～0.5mol/L,pH2.5～7.0的酸性或中性緩沖溶液)，于4℃～80℃溶脹1～24小時；(鮮皮材料無需此步操作)3、鮮皮或溶脹后干皮于組織勻漿器中勻漿；4、加上述緩沖液(10～100ml/g蛙皮)4℃～80℃抽提2～72小時；5、3000～10000r.p.m,5～30min離心，收集上清，對沉淀物可重復(fù)操作4,5步驟2～3次；6、合并上清液，加(NH4)2SO4沉淀，(NH4)2SO4終濃度為20～80％；或沸水浴5～10min；7、4000～20000r.p.m,10～30min離心，收集上清液；8、對上清液透析24～72小時除鹽；9、透析后上清液超濾濃縮(超濾膜分子量截留值為1000Da)或凍干濃縮；10、濃縮液上CM-纖維素柱，平衡液為pH4.0～5.0,0.01～0.1mol/L NaAc-HAc緩沖液，洗脫液為pH5.0～5.5,0.1～0.5mol/LNaAc～HAc緩沖液，進(jìn)行梯度洗脫，收集活力峰；11、活力峰超濾濃縮(超濾膜分子量截留值為1000Da)或凍干濃縮；12、濃縮液上Sephadex G-25/G-50柱，洗脫條件為pH6.0～7.0,0.01～0.1mol/L磷酸緩沖液，收集活力峰；13、活力峰超濾濃縮(超濾膜分子量截留值為1000Da)或凍干濃縮；14、濃縮液上制備型HPLC,10～80％乙腈(0.01％TFA)洗脫，或梯度洗脫，收集活力峰；15、活力峰凍干，于零下20℃保存，得本發(fā)明所說的從林蛙蛙皮制備的抗菌肽。
本抗菌肽具有如下性能(一)生化特性1、熱穩(wěn)定性林蛙皮抗菌肽80℃ 5小時不失活，100℃ 10min仍有活力；2、pH值穩(wěn)定性在pH2～13范圍內(nèi)活力穩(wěn)定，最適pH值為pH6.4；3、非極性體系穩(wěn)定性抗菌肽在15％六氟異丙醇中呈穩(wěn)定的α-螺旋構(gòu)象，在磷脂脂質(zhì)體中也呈穩(wěn)定α-螺旋構(gòu)象；4、等電點(diǎn)采用pH值調(diào)節(jié)測吸光度法測定蛙皮抗菌肽的pI值pI值為8.0～10.5的堿性多肽；5、分子量采用凝膠過濾層析法、聚丙烯酰氨垂直板電泳法及激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法，測得本抗菌肽的分子量為4～6KD；6、氨基酸組成用6N HCl于100～120℃下在真空安瓿瓶內(nèi)水解10～24小時，水解后除去過量鹽酸，于HITACHI 835-50氨基酸自動分析儀上測定抗菌肽含有氨基酸種類為天門冬氨酸(Aspartic acid)；蘇氨酸(Threonine)；絲氨酸(Serine)；谷氨酸(Glutamic acid)；甘氨酸(Glycine)；丙氨酸(Alanine)；半胱氨酸(Cystine)；纈氨酸(Valine)；甲硫氨酸(Methionine)；異亮氨酸(Isoleucine)；亮氨酸(Leucine)；酪氨酸(Tyrosine)；苯丙氨酸(Phenylalanine)；賴氨酸(Lysine)；組氨酸(Histidine)；精氨酸(Arginine)；脯氨酸(Proline)。
(二)生理活性采用兩種方法測定抗菌肽的生理活性
1、液體比濁法將處于對數(shù)生長期的菌液預(yù)冷后，3000r.p.m離心10分鐘得菌體，用pH7.0、0.2M磷酸緩沖液洗去殘余培養(yǎng)基后，將菌體懸浮于pH7.0、0.2M磷酸緩沖液中，使OD值為0.3～0.4，按2ml/管加入菌液，并加入適量的待測樣，設(shè)立陽性、陰性對照，混勻后，37℃搖床培養(yǎng)45分鐘，冰浴10分鐘。
λ600nm處測OD值根據(jù)μ2=(A0-A)/A計算抑菌活力μ活力單位；A0陰性對照OD值；A樣品管OD值。
2、抑菌圈法用相同大小濾紙片分別加入不等量抗菌肽，晾干后，置于涂菌液的培養(yǎng)皿內(nèi)，24小時后觀察結(jié)果，以抑菌圈大小來測定抑菌活力。
3、實驗結(jié)果經(jīng)測定，林蛙皮抗菌肽可廣泛抑制多種革蘭氏陽性、陰性細(xì)菌及真菌，下表給出了幾種細(xì)菌的最低抑菌濃度。
最小抑菌濃度(μg/ml)
(三)水果保鮮試驗A組選取草莓6枚，水洗后室溫放置(標(biāo)記為A1～A6)；B組選取草莓4枚，水洗后噴抗菌肽蛙皮初提液(相當(dāng)于步驟5得到的抗菌肽)(標(biāo)記為B1～B4)；C組選取草莓4枚，水洗后噴步驟15后得到的抗菌肽(標(biāo)記為C1～C4)。
試驗結(jié)果如下(單位小時)
生理活性試驗及水果保鮮試驗表明本發(fā)明的生物抗菌肽可廣泛地用于食品、水果保鮮，護(hù)膚品等領(lǐng)域。
本抗菌肽來源于生物，是一種小肽分子，屬天然物質(zhì)，且水溶性極好，用于水果保鮮，抗菌肽會形成一層無色保護(hù)膜，隔絕空氣的接觸并能殺死水果表面的細(xì)菌，從而達(dá)到水果保鮮保水的目的，對水果的色香味影響不明顯。
抗菌肽對于皮膚上存在的各種細(xì)菌具有高效殺傷作用，如銅綠假單孢菌，其活性比溶菌酶還高，抗菌肽制劑應(yīng)用于皮膚消毒，具有對皮膚無損害，殺菌效果好的優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用于護(hù)膚品中，由于其特有的殺菌性及高穩(wěn)定性，可以在護(hù)膚同時得到殺菌的效果，對于常見的皮膚病如青春痘、粉刺等有一定的療效。
可以看出，本發(fā)明的生物抗菌肽具有制備工藝簡單，抗菌譜廣，抗菌效果好，穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。
下面舉例說明本發(fā)明生物抗菌肽的制備實施例11、取林蛙干皮1g，除脂除肌肉；2、加2ml 0.01mol/L、pH2.5檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液，于4℃溶脹24小時；3、溶脹蛙皮勻漿；4、加10ml步驟2所述的緩沖液，進(jìn)行抽提，于4℃抽提72小時；5、3000r.p.m,30min離心，收集上清；沉淀重抽提兩次；
6、上清液加(NH4)2SO4沉淀，至終濃度為20％；7、4000r.p.m,30min離心，收集上清液；8、上清液透析24小時；9、上清液超濾濃縮；10、濃縮液上CM-纖維素柱，pH4.0、0.01mol/L NaAc-HAc緩沖液平衡，以pH5.0、0.1～0.5mol/L NaAc-HAc緩沖液梯度洗脫，收集活力峰；11、活力峰凍干濃縮；12、濃縮液上Sephadex G25柱，pH6.0、0.01mol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液洗脫，收集活力峰；13、活力峰凍干濃縮；14、濃縮液上半制備型HPLC(Sepherisorb C1810μ),10％乙腈(0.01％TFA)洗脫，收集活力峰；15、活力峰凍干于零下20℃保存。
產(chǎn)率2.7mg/g干皮。
實施例2取林蛙干皮1g，前處理后加入2ml、0.5mol/L、pH7.0 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，80℃溶脹1小時，勻漿后加入100ml上面所述的緩沖液進(jìn)行抽提，于80℃抽提2小時，10000r.p.m、10min離心，收集上清液，上清液加入(NH4)2SO4沉淀，(NH4)2SO4終濃度為80％，20000r.p.m、離心10min，收集上清液，透析72小時除鹽，上清液凍干濃縮；濃縮液上CM-纖維素柱，以pH5.0、0.1mol/L NaAc-HAc緩沖液平衡，以pH5.5、0.1～0.5mol/L NaAc-HAc緩沖液梯度洗脫，收集活力峰，活力峰凍干濃縮；濃縮液上Sephadex G50柱，洗脫條件為pH7.0、0.1mol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液，收集活力峰凍干濃縮；濃縮液上半制備HPLC(Sepherisorb C1810μ)，80％乙腈(0.01％TFA)洗脫，收集活力峰；凍干于零下20℃保存。
產(chǎn)率1.9mg/g干皮。
實施例31、取林蛙干皮1g，除脂除肌肉前處理；2、加2ml、0.2mol/L、pH5.0 NaAc-HAc緩沖液，于40℃溶脹4小時；3、勻漿；4、加50ml步驟2所述的緩沖液進(jìn)行抽提，70℃抽提4小時；5、6000r.p.m,15min離心，沉淀反復(fù)抽提兩次；6、沸水浴10min；
7、18000r.p.m,15min離心，收集上清液；8、上清液透析36小時除鹽；9、上清液超濾濃縮；10、濃縮液上CM-纖維素柱，平衡液為pH4.0、0.05mol/LNaAc-HAc緩沖液，以pH5.1、0.2～0.5mol/L NaAc-HAc緩沖液梯度洗脫，收集活力峰；11、活力峰超濾濃縮；12、濃縮液上Sephadex G25柱，pH6.4、0.05mol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液洗脫，收集活力峰；13、活力峰超濾濃縮；14、濃縮液上半制備型HPLC(Sepherisorb C1810μ),20～80％乙腈(0.01％TFA)梯度洗脫，收集活力峰；15、凍干于零下20℃保存。
產(chǎn)率3.5mg/g干皮
權(quán)利要求
1.一種用林蛙蛙皮制備生物抗菌肽的方法，其步驟如下(1)取林蛙干皮或鮮皮，進(jìn)行除脂，除肌肉的前處理；(2)加少量的緩沖液，于4℃～80℃溶脹1～24小時；(3)鮮皮或溶脹后干皮于組織勻漿器中勻漿；(4)加緩沖液，10～100ml/g蛙皮，于4℃～80℃抽提2～72小時；(5)3000～10000r.p.m,5～30min離心，收集上清，沉淀?？芍貜?fù)操作4,5步驟2～3次；(6)上清液加(NH4)2SO4沉淀，(NH4)2SO4終濃度為20～80％；或沸水浴5～10min；(7)4000～20000r.p.m,10～30min離心，收集上清液；(8)合并上清透析24～72小時除鹽；(9)透析后上清液超濾濃縮，超濾膜分子量截留值為1000Da，或凍干濃縮；(10)濃縮液上CM-纖維柱，平衡液為pH4.0～5.0,0.01～0.1mol/LNaAc-HAc緩沖液，洗脫液為pH5.0～5.5,0.1～0.5mol/LNaAc-HAc緩沖液梯度洗脫，收集活力峰；(11)活力峰超濾濃縮，超濾膜分子量截留值為1000Da，或凍干濃縮；(12)濃縮液上Sephadex G-25/G-50柱，洗脫條件為pH6.0～7.0,0.01～0.1mol/L磷酸緩沖液，收集活力峰；(13)活力峰超濾濃縮，超濾膜分子量截留值為1000Da，或凍干濃縮；(14)濃縮液上制備型HPLC,10～80％乙腈(0.01％TFA)洗脫，或梯度洗脫，收集活力峰；(15)活力峰凍干，于零下20℃保存，得從林蛙蛙皮制備的抗菌肽。
2.如權(quán)利要求1所述的制備生物抗菌肽的方法，其特征在于所說的緩沖液為0.01～0.5mol/L,pH2.5～7.0的溶液。
3.權(quán)利要求1所述方法制備的生物抗菌肽，其具有如下特征(1)熱穩(wěn)定性本抗菌肽80℃5小時不失活，100℃10min仍有活力；(2)pH值穩(wěn)定性在pH2～13范圍內(nèi)活力穩(wěn)定，最適pH值為pH6.4；(3)非極性體系穩(wěn)定性本抗菌肽在15％六氟異丙醇中呈穩(wěn)定的α-螺旋構(gòu)象，在磷脂脂質(zhì)體中也呈穩(wěn)定α-螺旋構(gòu)象；(4)等電點(diǎn)采用pH值調(diào)節(jié)測吸光度法測定蛙皮抗菌肽pI值；pI值為8.0～10.5的堿性多肽；(5)分子量采用凝膠過濾層析法、聚丙烯酰氨垂直板電泳法及激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法，測得本抗菌肽的分子量為4～6KD；(6)氨基酸組成本抗菌肽含有氨基酸種類為天門冬氨酸(Aspartic acid)蘇氨酸(Threonine)；絲氨酸(Serine)谷氨酸(Glutamicacid)；甘氨酸(Glycine)；丙氨酸(Alanine)；半胱氨酸(Cystine)；纈氨酸(Valine)；甲硫氨酸(Methionine)；異亮氨酸(Isoleucine)；亮氨酸(Leucine)；酪氨酸(Tyrosine)；苯丙氨酸(Phenylalanine)；賴氨酸(Lysine)；組氨酸(Histidine)；精氨酸(Arginine)；脯氨酸(Proline)。
4.如權(quán)利要求3所述的生物抗菌肽，可用作食品、水果及蔬菜保鮮劑使用。
5.如權(quán)利要求3所述的生物抗菌肽，可用作護(hù)膚品及皮膚外用藥使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物抗菌肽及其制備方法,本發(fā)明的抗菌肽以林蛙蛙皮為原料,經(jīng)除脂除肌肉前處理、溶脹、勻漿、抽提、離心、沉淀、透析除鹽、濃縮、洗脫、收集活力峰等步驟,最后制得。本抗菌肽具有制備工藝簡單、產(chǎn)率高、抗菌譜廣、殺菌效力高等優(yōu)點(diǎn),可廣泛地應(yīng)用于食品、水果及蔬菜保鮮及護(hù)膚品等領(lǐng)域。
文檔編號C07K1/36GK1216768SQ98123799
公開日1999年5月19日 申請日期1998年10月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月29日
發(fā)明者李青山, 茍小軍, 滕利榮, 王彥忠, 李向暉, 黃程芳 申請人:吉林大學(xué)