專利名稱：治療包括骨質(zhì)疏松的絕經(jīng)后疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合雌激素受體的治療劑，并發(fā)現(xiàn)該治療劑可用于治療骨質(zhì)疏松。
背景技術(shù)：
對于絕經(jīng)后婦女，絕經(jīng)期發(fā)生的雌激素降低是骨質(zhì)疏松骨折和心血管疾病發(fā)病率增加的一個重要病因。雖然，可通過雌激素替代治療(ERT)防止絕經(jīng)后骨損失，但是，預(yù)防性ERT增加了子宮內(nèi)膜癌癥的危險性。理想的治療應(yīng)維持雌激素對骨骼和心血管的作用，但對生殖組織無不良作用。他莫昔芬是雌激素拮抗劑，它能降低膽固醇水平并防止絕經(jīng)后婦女的骨損失。他莫昔芬還對骨質(zhì)疏松的卵巢切除鼠模型有效。但是，他莫昔芬具有不良副作用，特別是引起子宮內(nèi)膜增生和子宮內(nèi)膜癌癥。見1:Love RR,Wiebe DA,Newcomb PA,Cameron L,Leventhal H,Jordan VC,Feyzi J,DeMets DL.(1991)，“他莫昔芬對絕經(jīng)后婦女心血管發(fā)病率的作用”，Annals of Internal Medicine,115,860-864。2:Love RR,Mazess RB,Barden HS,Epstein S,Newcomb PA,Jordan VC,Carbone PP,DeMets DL.(1992)，“他莫昔芬對患乳腺癌的絕經(jīng)后婦女骨密度的作用”，New England Journalof Medicine,326,852,856。3:Turner RT,Wakely GK,HannonKS,Bell NH.(188)，“他莫昔芬對卵巢激素缺乏鼠破骨細胞介導(dǎo)的小梁骨吸收的抑制”，Endocrinology,122,1146-1150。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了預(yù)防和治療絕經(jīng)后疾病的方法，該方法無明顯的親子宮作用。此方法包括給有此需要的病人使用有效量的式Ⅰ化合物及其可藥用的酸加成鹽

其中X表示3位或4位碘或溴原子，符號R1和R2可相同或不同，表示C1-C3烷基，特別是甲基或乙基，或者R1表示氫原子而R2表示C1-C3烷基，或者R1和R2與它們連接的氮原子一起表示飽和雜環(huán)，一般是5或6元環(huán)，特別是1-吡咯烷基、哌啶子基、4-甲基哌啶子基或嗎啉代基團。
發(fā)明詳述本發(fā)明是治療絕經(jīng)后疾病的治療方法，該方法使用以前制備的并確定對治療雌激素受體陽性乳腺癌有效的化合物。這些化合物以上述式Ⅰ描述并描述在美國專利4839155中。
用于本治療方法的優(yōu)選的化合物為

(E)-1-[2-[4-[1-(4-碘代苯基)-2-苯基-1-丁烯基]苯氧基]吡咯烷已知這些化合物結(jié)合雌激素受體并依所研究組織不同而引起雌激素激動或拮抗作用。
術(shù)語“絕經(jīng)后疾病”指骨質(zhì)疏松和動脈粥樣硬化性心血管疾病如心肌梗塞和中風以及血漿膽固醇的增加。本發(fā)明方法可有效預(yù)防骨損失并產(chǎn)生與降低動脈硬化發(fā)病率有關(guān)的血脂分布。
通過對骨質(zhì)疏松的卵巢切除鼠模型及絕經(jīng)后婦女的研究評價防止骨損失的能力。
組織形態(tài)測定研究表明當摘除雌性成年鼠卵巢時，鄰脛骨干骺端發(fā)生進行性骨損失。卵巢切除后(OVX)三個月后，通過骨更新增加，60-70％的網(wǎng)狀骨質(zhì)被除去，其中過量的骨吸收占優(yōu)勢。腰椎也發(fā)生骨損失，但速率較慢。OVX引起的鼠骨損失(可通過雌激素替代劑量徹底預(yù)防)形成了最廣泛使用的、性能最好的骨質(zhì)疏松動物模型的基礎(chǔ)。
Sprague-Dawley鼠的鼠齡為7-8個月。通過雙能量X線吸光分析(DXA)對脊柱的腰3-6區(qū)和鄰脛骨干骺端測定骨密度基值(BMD)。然后，將鼠分成對腰BMD具有約相同的平均值和標準偏差的8-10個組。這些組中的鼠雙側(cè)卵巢切除(OVX)并且每一實驗中有一組未切除。
將艾多昔芬制備為口服制劑，即在1％羧甲基纖維素水溶液中的懸浮液。通過口腔管飼法每天對鼠給藥一次。在每一實驗中，一組OVX和未切除組每天通過管飼法服用口服制劑載體。手術(shù)后那天即開始給藥。
治療2周后測定血漿膽固醇水平。腰和脛骨BMD測定周期為1個月。將動物處死，摘除子宮并測量濕重。死后收集脛骨、植入并切片進行組織形態(tài)測定(15)。在距生長板上1.2mm的次級松質(zhì)中測定網(wǎng)狀骨質(zhì)區(qū)和周邊。網(wǎng)狀骨質(zhì)區(qū)(Cn.B.Ar)以髓狀區(qū)的百分率表示。使用Parfitt等人開發(fā)的方程由主區(qū)和周邊測定次級結(jié)構(gòu)參數(shù)、小梁寬、小梁長和小梁分離。艾多昔芬對骨質(zhì)疏松的卵巢切除鼠模型的骨損失、血漿膽固醇和子宮重量作用的起始劑量范圍研究本研究的目的為了確定艾多昔芬預(yù)防骨質(zhì)疏松OVX鼠模型骨損失的最佳劑量。
BMD在治療1、2及3個月后測定。除了摘除脛骨進行組織形態(tài)測定外，切除股骨和椎骨(L1和2)進行離體BMD測定(只測股骨)和機械性實驗。艾多昔芬劑量為2、8、40和200μg/kg/天。
按照所有測定參數(shù)，艾多昔芬無作用劑量為2μg/kg。
只有200μg/kg的艾多昔芬對OVX引起的腰脊柱中BMD降低有顯著預(yù)防作用。此劑量是有效的并在1個月內(nèi)造成骨損失的100％抑制。對腰脊柱治療3個月后，200μg/kg的艾多昔芬引起約50％的骨損失抑制。
在鄰脛骨中，在1個月時8-200μg/kg的艾多昔芬引起約50％骨損失抑制。在3個月時此保護程度降至約25％，無顯著性。這表明對此骨骼部位200μg/kg的艾多昔芬不是最佳劑量。
離體骨密度測量表明200μg/kg的艾多昔芬維持鄰股骨BMD在未切除對照組的水平。此劑量也維持股骨中干髓質(zhì)橫切面在未切除對照組的水平，這表明艾多昔芬防止皮質(zhì)和網(wǎng)狀骨質(zhì)的損失。艾多昔芬在3點彎曲實驗中對股骨骨干或在軸向壓力實驗中對L2脊柱體的機械強度無不利影響。
組織形態(tài)測定表明治療3個月后艾多昔芬對鄰脛骨網(wǎng)狀骨質(zhì)區(qū)只有小的并且是非顯著的作用，這與BMD測定吻合。在小梁寬度方面，各組之間無差別。盡管艾多昔芬對脛骨網(wǎng)狀骨質(zhì)區(qū)缺乏長期效果，但劑量低到40μg/kg時對小梁數(shù)目和分離的活性也是明顯的。
艾多昔芬(200μg/kg)顯著降低血漿膽固醇(圖5)。治療3個月后，艾多昔芬的所有劑量都引起非常弱但有統(tǒng)計學顯著性的子宮重量增加。艾多昔芬對骨質(zhì)疏松的卵巢切除鼠模型中骨損失、血漿膽固醇和子宮重量作用的精確劑量研究本研究的目的為了確定艾多昔芬預(yù)防骨質(zhì)疏松OVX鼠模型骨損失的最佳劑量。在1個月時測定BMD并在收集子宮和脛骨前再繼續(xù)治療2周。
200和500μg/kg的艾多昔芬完全防止了腰椎中發(fā)生的骨損失。1000μg/kg的艾多昔芬對腰椎無顯著性作用。200-1000μg/kg的艾多昔芬完全防止了鄰脛骨骨干中的骨損失。
組織形態(tài)測定表明防止OVX引起的網(wǎng)狀骨質(zhì)損失的艾多昔芬最佳劑量為500μg/kg。200和500μg/kg的艾多昔芬顯著防止OVX引起的小梁寬度降低。500和1000μg/kg的艾多昔芬顯著保護了小梁的數(shù)量。200-1000μg/kg的艾多昔芬顯著防止了OVX引起的小梁分離的增加。
艾多昔芬的所有劑量顯著降低了血漿膽固醇水平(

圖11)。任何被測劑量的艾多昔芬對子宮的濕重都無作用。
通過以治療OVX鼠6周后的所有測定參數(shù)一致確定了艾多昔芬的500μg/kg劑量為最佳值。
在6周的治療期內(nèi)，發(fā)現(xiàn)艾多昔芬的最佳劑量為500μg/kg。防止椎骨骨損失的最小有效劑量為200μg/kg而降低膽固醇的最小有效劑量為100μg/kg。總之，艾多昔芬的骨保護和降低膽固醇作用對防止絕經(jīng)后疾病是有用的，其對子宮內(nèi)膜無不良作用。
對絕經(jīng)后婦女在3個月的研究中，將艾多昔芬的三個劑量(2.5、5和10mg/kg)與安慰組比較。這些婦女在研究初期骨密度低。通過測定骨吸收(以C-端肽排泄測定的尿膠原交聯(lián)排泄，自由交聯(lián)和總交聯(lián))和骨形成(血清骨鈣蛋白)的生化標記物的變化，來檢測與骨損失速度的降低相一致的對骨作用的存在。
觀察到的與這些生化標記物水平降低有關(guān)的劑量(見下)表示骨更新的降低并與雌激素對絕經(jīng)后婦女骨更新的作用一致。所有變化以相對基值的百分率變化描述。用下列符號表示與安慰組有統(tǒng)計學顯著差異*=p＜0.01,**=p＜0.001

還測定了治療前后不同脂參數(shù)、纖維蛋白原及其它凝集/纖維蛋白溶解參數(shù)水平的變化，將其作為艾多昔芬對心血管疾病危險性的類似作用的指數(shù)。本實驗的結(jié)果如下。<

>當本發(fā)明的化合物及其有活性的可藥用鹽口服時，可制成液體，如糖漿、混懸劑或乳液、片劑、膠囊及錠劑。
一般來說，液體制劑由本發(fā)明化合物或其可藥用鹽在適宜液體載體(一種或多種)中的懸浮液或溶液組成，液體載體有如乙醇、甘油、非水溶劑如聚乙二醇、油或水，其中添加助懸劑、防腐劑、香料或著色劑。
片劑形式的組合物可使用任何常規(guī)用于制備固體制劑的適宜藥用載體(一種或多種)制備。這些載體的例子包括硬脂酸鎂、淀粉、乳糖、蔗糖和纖維素。
膠囊形式的組合物可通過常規(guī)包囊方法制備。例如，可用標準載體制備含活性成分的小丸并再將其填充進硬明膠膠囊；或者，可用任何適宜的載體(一種或多種)如含水膠、纖維素、硅酸鹽或油制備分散液或混懸液，并再將此分散液或混懸液填充如軟明膠膠囊。
當本發(fā)明的化合物及其活性的可藥用鹽非經(jīng)胃腸道(即通過注射或輸注)給藥時，可制備為溶液或混懸液。
非經(jīng)胃腸道給藥組合物一般由在滅菌含水載體或非經(jīng)胃腸道用油中的活性成分的溶液或混懸液組成，非經(jīng)胃腸道用油如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、花生油或芝麻油。或者，可將此溶液凍干并恰在給藥前再用適當溶劑重新配制。
當以此種方式給藥時，典型的栓劑組合物含有本發(fā)明的化合物或其有活性的可藥用鹽，以及粘合劑和/或潤滑劑如聚二醇類、明膠或可可脂或其它低熔點植物或合成蠟或脂肪。
典型的透皮制劑含有常規(guī)水性或非水載體，例如，霜劑、軟膏、洗劑或糊劑，或為含藥硬膏劑、貼劑或膜。
對于局部給藥，采用的藥物組合物包括溶液、混懸液、軟膏及固體插入物。典型的可藥用載體為，例如，水、水和與水混溶溶劑如低級烷醇或植物油的混合物，以及水溶性眼科用無毒聚合物如纖維素衍生物如甲基纖維素。該藥物制劑還可含有無毒輔劑如乳化劑、防腐劑、濕潤劑和成形劑，如聚乙二醇類；抗菌劑成分如季銨化合物；緩沖成分如堿金屬氯化物；抗氧劑如焦亞硫酸鈉；及其它常規(guī)成分如脫水山梨醇單月桂酸酯。
優(yōu)選地，該組合物是單位劑量形式。本發(fā)明化合物在藥物劑量單位中的劑量是有效的、無毒的量，選自0.01-200mg/kg活性化合物，優(yōu)選0.1-100mg/kg。所選劑量給需要治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松或降低血漿膽固醇或預(yù)防心血管疾病的患者每天使用1-6次，使用途徑有口服、直腸給藥、局部給藥或注射，或者通過輸液。給人使用的口服劑量單位優(yōu)選含10至500mg活性化合物。較低劑量一般用于非經(jīng)胃腸道給藥。當對患者來說安全、有效、方便時，就口服給藥。
當本發(fā)明的化合物按照本發(fā)明給藥時，無不能接受的毒性作用。
實施例1通過過篩、混合并按例如如下的比例將各組分填充入硬明膠膠囊，制備式(Ⅰ)活性化合物的口服給藥的口服劑型。
組分 量(E)-1-[2-[4-[1-(4-碘代苯基)-2-苯 100mg基-1-丁烯基]苯氧基]吡咯烷硬脂酸鎂 10mg乳糖 100mg實施例2將蔗糖、硫酸鈣二水合物和口服活性式(Ⅰ)化合物混合并用10％明膠溶液制粒。將此濕顆粒過篩，干燥，并與淀粉、滑石和硬脂酸混合，過篩并壓制成片劑。
組分 量(E)-1-[2-[4-[1-(4-碘代苯基)-2- 75mg苯基-1-丁烯基]苯氧基]吡咯烷硫酸鈣二水合物 100mg蔗糖 15mg淀粉 8mg滑石 4mg硬脂酸 2mg實施例3將(E)-1-[2-[4-[1-(4-碘代苯基)-2-苯基-1-丁烯基]苯氧基]吡咯烷50mg分散于25ml生理鹽水中制備注射液。
實施例4此實驗對艾多昔芬和雷洛昔芬對骨質(zhì)疏松的作用機理進行比較。用含螢蟲素酶報告基因(如下)的雌激素響應(yīng)因子(ERE)上流的構(gòu)件，表明艾多昔芬和雌激素一樣是通過成骨細胞中ERE的純激動劑。天然甾類激素雌激素和艾多昔芬之間的激動作用能力相似。與艾多昔芬濃度(0.01至10μM)相同的雷洛昔芬，其通過ERE信號極弱，幅度與載體對照相似。
進行競爭實驗來確定通過此響應(yīng)因子的作用機理。通過ERE雷洛昔芬抑制雌激素和艾多昔芬的激動活性。配體(雌激素或艾多昔芬)劑量為100nM時，有一個最大激動響應(yīng)。用500nM雷洛昔芬共同治療將報告基因的活性降低至載體對照組的水平。相反，500nM的艾多昔芬不降低100nM雌激素在成骨細胞中的最大激動作用。如果使用艾多昔芬和雌激素的次最大濃度(＜100nM)，在成骨細胞中通過ERE，這兩種激動劑有加合作用。
實驗方法將細胞接種于6孔板中，其濃度為1.5×105個細胞/孔，或以1.5×104細胞/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)基為無酚紅培養(yǎng)基。使用含鼠乳腺癌病毒啟動子的DNA構(gòu)件，其中糖皮質(zhì)激素反應(yīng)因子已被5個拷貝的33堿基對卵黃生成素響應(yīng)因子代替。這是螢蟲素酶報告基因(MMTV-ERE-Luc)的上流(Wen,D.X.,Y-F,Xu,M.K.Goldman and P.McDonnell,1994?！巴ㄟ^靶細胞內(nèi)明顯信號路徑操縱人孕酮受體的A和B異構(gòu)體”，Molec.Cell.Biol.14:8356-8364)。以雙螢蟲素酶檢測方法(Promega,Madison,WI)用renilla-螢蟲素酶載體校正轉(zhuǎn)染效果。通過脂轉(zhuǎn)染方法(Life Technologies,Gaithersburg,MD)將DNA引入鼠骨肉瘤(Ros 17/2.8)細胞。在6孔板中用每孔2μg而在24孔板中用每孔140ng的MMTV ERE-Luc和25ng對照renilla-螢蟲素酶載體(pRL-CMV)共轉(zhuǎn)染細胞。用renilla-螢蟲素酶載體共轉(zhuǎn)染校正轉(zhuǎn)染效果，用不同底物，coelenterazine，針對其生物發(fā)光讀數(shù)(Promega,Madison WI)。細胞培養(yǎng)過夜。然后，除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并將細胞在有激素或無激素條件下培養(yǎng)48小時。在磷酸緩沖鹽水中洗滌細胞，然后用500μl/孔1×被動溶解緩沖液(PLB)溶解15分鐘，同時在搖床上搖動樣品。以12000g將裂解物離心30秒并在報告酶分析前將清澈的溶胞產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至試管中。將樣品(20μl)轉(zhuǎn)移至96孔發(fā)光檢測板中并與100μl每種實驗試劑(Promega,Madison,WI)反應(yīng)。通過微光LB96P發(fā)光計(Wallac,Gaithersburg,MD)注射每種實驗試劑，檢測螢蟲素酶活性。螢蟲素酶活性提供了含雌激素響應(yīng)因子(ERE)的雌激素反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄活化的替代物。因此，螢蟲素酶活性的升高是激動作用的指征，而下降表明通過ERE有拮抗作用。
討論艾多昔芬是通過成骨細胞中雌激素響應(yīng)因子(ERE)的激動劑。與艾多昔芬相反，在被測劑量時雷洛昔芬是通過成骨細胞中ERE的拮抗劑，這表明與雷洛昔芬所見的骨節(jié)約作用的機理不同。因此，雷洛昔芬可通過含存在于人TGFβ3啟動子的5′-未翻譯區(qū)中的序列的非ERE起生物作用。在相同的細胞系統(tǒng)中，雷洛昔芬抑制含ERE的卵黃生成素啟動子的表達并因此具有純雌激素拮抗作用。此雷洛昔芬響應(yīng)因子(Yang,N,N.,Venugopalan,M.,Hardikar,S.,and Glasebrook,A.(1996)，被17β-雌二醇代謝物和雷洛昔芬活化的雌激素響應(yīng)因子的確定，Science 273:1222-1225)與ERE不在同一基因上，這表明通過此反應(yīng)因子調(diào)節(jié)將對不同基因產(chǎn)生作用。這使艾多昔芬與選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)因子(SERM)雷洛昔芬的作用機理不同，并使艾多昔芬具有更經(jīng)典的雌激素型機理，其在成骨細胞中通過ERE發(fā)揮生物激動作用。艾多昔芬和雌激素的作用特異性地針對攜帶經(jīng)典ERE的報告基因構(gòu)件。此系統(tǒng)對細胞特異性因子是敏感的并因此成為對內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄作用的有效模型。
權(quán)利要求
1．預(yù)防和治療絕經(jīng)后疾病的方法，包括給需要的患者使用有效量的式Ⅰ化合物。
2．權(quán)利要求1所述的方法，其中絕經(jīng)后疾病是骨質(zhì)疏松。
3．權(quán)利要求1所述的方法，其中式Ⅰ化合物是(E)-1-[2-[4-[1-(4-碘代苯基)-2-苯基-1-丁烯基]苯氧基]乙基]吡咯烷。
4．式Ⅰ化合物在制備用于治療絕經(jīng)后疾病的藥物方面的用途。
5．權(quán)利要求4的用途，其中絕經(jīng)后疾病是骨質(zhì)疏松。
6．權(quán)利要求1的用途，其中式Ⅰ化合物是(E)-1-[2-[4-[1-(4-碘代苯基)-2-苯基-1-丁烯基]苯氧基]乙基]吡咯烷。
全文摘要
描述了治療骨質(zhì)疏松的新方法。艾多昔芬是優(yōu)選的化合物。
文檔編號C07D295/08GK1236299SQ97199492
公開日1999年11月24日 申請日期1997年9月3日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月6日
發(fā)明者J·N·布拉德貝爾, M·戈文 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司