專利名稱：堿性氨基酸的一種提純方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及堿性氨基酸的一種提純方法，這種氨基酸以發(fā)酵的方法生產(chǎn)并含有蛋白質(zhì)-基雜質(zhì)。
堿性氨基酸，例如L-精氨酸，是用發(fā)酵的方法生產(chǎn)的。在一種提純這類氨基酸的方法中把發(fā)酵肉湯，在除去細(xì)胞后或者直接裝到離子交換樹脂中吸收堿性氨基酸，并經(jīng)過洗脫隨后直接結(jié)晶或經(jīng)過用活性碳脫色。發(fā)酵肉湯含有各種雜質(zhì)，包括水溶性蛋白質(zhì)。水溶性蛋白質(zhì)被吸吸到離子-交換樹脂上，然后用堿性洗脫劑與堿性氨基酸一起洗脫。它們在隨后的結(jié)晶階段沉淀出來，這樣使雜質(zhì)難于除去。相應(yīng)地傳統(tǒng)的去除方法使用一種工藝，在該工藝中把一種蛋白質(zhì)促凝劑加入到氨基酸的水溶液中，并把混合物加熱用以凝結(jié)蛋白質(zhì)，然后將其濾掉。
堿性氨基酸主要用作藥物的原料，例如用于營養(yǎng)制劑中，包括氨基酸注射液或中和劑，并且通常使用時(shí)的pH值在中性至弱酸性。不過，當(dāng)堿性氨基酸被溶解而形成水溶液時(shí)，同時(shí)調(diào)整其在中性和弱酸性之間然后用過濾法經(jīng)過一膜濾器滅菌時(shí)，過濾的速度會(huì)顯著地下降。
這里膜濾器是指用于滅菌的微過濾膜，其孔徑從0.22-1.0μm。
本發(fā)明的目的是提供一種提純堿性氨基酸的方法，該方法用膜濾器過濾處理含堿性氨基酸的中性或弱酸性水溶液時(shí)也不會(huì)引起過濾能力降低的問題。
在作出努力解決上述問題時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，由于堿性氨基酸是堿性的，使用普通的提純方法不能有效地除去象蛋白質(zhì)類的雜質(zhì)，因而這些雜質(zhì)仍然在酸性pH值下經(jīng)歷沉淀作用，結(jié)果是阻滯了過濾過程。由于不論是中性的和酸性的氨基酸還是堿性氨基酸，大多數(shù)氨基酸產(chǎn)物呈鹽的形式，因此，它們的水溶液被過濾提純是在pH值從中性到弱酸性之間進(jìn)行的。在中性或弱酸性水溶液中，膠體物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)趨向于凝結(jié)，從而便于用過濾法除去。但是，對于不是鹽形式的堿性氨基酸來說，其水溶液是堿性的，膠體物質(zhì)很少凝結(jié)并且偶會(huì)通過過濾器。此外，堿性的條件能使蛋白質(zhì)的溶解度提高，其中的一些呈溶解態(tài)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的這種性能和其它雜質(zhì)會(huì)引起如上文所述的堿性氨基酸的堿性水溶液過濾困難。
因此，為了提高在中性和弱酸性pH值之間的過濾作用，必須完全除去如上述性能的物質(zhì)并除去在堿性條件下溶解而在酸性條件下沉淀的物質(zhì)。
除去這類物質(zhì)的一種方法是用諸如鹽酸之類的一種酸中和堿性氨基酸的堿性水溶液，然后用膜濾器過濾該中和的溶液。但是，這種方法不適于作為獲得堿性氨基酸的堿性水溶液或結(jié)晶的方法，因?yàn)檫@需要中和作用的酸并且需要用離子交換樹脂處理去除陰離子成份例如氯離子。
因此，我們嘗試用一種超濾膜(孔徑從0.002到0.1μm)，該膜通常用于去除藥用氨基酸中的熱原，藥用氨基酸用作注射液的原材料，該膜的孔徑小于微過濾中膜濾器中的孔徑，在結(jié)晶階段之前的提純階段使用該膜，以便除去前文中所述的雜質(zhì)。但是，盡管使用了具有比膜濾器孔徑小得多的超濾膜，但是溶解有所得的堿性氨基酸并且pH值調(diào)整在從中性到弱酸性之間的水溶液的過濾性設(shè)有顯著地改善。
因此，我們進(jìn)一步研究開發(fā)高效率的過濾方法并最后發(fā)現(xiàn)，使用一種最近開發(fā)出來的緊密-超濾膜的過濾方法最適合于本目的，從而確定了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及提純堿性氨基酸的方法，其中，由發(fā)酵方法產(chǎn)生的堿性氨基酸的水溶液用緊密-超濾器膜過濾。
適用于本發(fā)明的方法的堿性氨基酸不受特別地限制，包括了L-賴氨酸，L-精氨酸，L-鳥氨酸，L-組氨酸，等等。本發(fā)明的方法對于水溶液是強(qiáng)堿性的并且能夠用結(jié)晶的方法提純的情形最有效，因而，從這一觀點(diǎn)看，L-精氨酸、L-賴氨酸和L-鳥氨酸是優(yōu)選的，而L-精氨酸是更優(yōu)選的。
優(yōu)選讓氨基酸的堿性水溶液處于在某種程度上被提純的物理和化學(xué)狀態(tài)，因?yàn)槟切┖兄T如細(xì)胞等大量不溶物質(zhì)的，例如發(fā)酵肉湯，不能有效地被過濾。優(yōu)選的這類例子有一種洗提液，通過如下方法獲得把在發(fā)酵肉湯中的堿性氨基酸吸收到陽離子樹脂中，隨后除去未吸收的溶液，再用一種堿的水溶液，例如氫氧化鈉水溶液洗脫；通過用活性碳的脫色作用從這種洗脫液中獲得一種脫色的溶液，一種溶解有粗晶的水溶液，該粗晶通過從這種洗脫液中結(jié)晶堿性氨基酸獲得，通過使用活性碳對這種粗晶的水溶液脫色而獲得一種脫色的溶液；以及通過向這種粗晶水溶液加入蛋白質(zhì)凝結(jié)劑然后用活性碳脫色而獲得一種脫色的溶液。堿性氨基酸的堿性水溶液的pH接近于等電位pH，通常在等電位pH±0.5的范圍內(nèi)。堿性氨基酸在水溶液中的濃度優(yōu)選為低于過濾進(jìn)行時(shí)的溫度下的氨基酸的飽和溶解度，該溫度的確定基于避免堿性氨基酸的熱分解和緊密-超濾膜的可允許的溫度。為了更易于操作，優(yōu)選使?jié)舛冉咏陲柡腿芙舛鹊臐舛?。例如，?dāng)通過緊密-超濾膜在40℃過濾L-精氨酸的水溶液時(shí)，L-精氨酸的濃度優(yōu)選為從20到30克/分升，因?yàn)長-精氨酸在40℃時(shí)的飽和溶解度大約為35克/分升。
就分離分子量而言，緊密-超濾膜是一種被認(rèn)為介于超濾膜和反滲透膜之間的中間膜，其分離分子量的范圍從幾百到幾千。NaCl排斥率被經(jīng)常用來表示一種膜的分離性能。本發(fā)明所用的緊密-超濾膜的NaCl排斥率為1到50％，優(yōu)選5到30％，膜的材料可以是乙酰纖維素、聚酰胺、聚苯并咪唑-或聚砜為基質(zhì)的材料。
就過濾條件而言，溫度為5-95℃，優(yōu)選為20到60℃。雖然在所用的具體超濾膜允許的壓力限度內(nèi)，壓力可以任意選擇，但優(yōu)選壓力還是要考慮到其效率，因?yàn)樘偷膲毫ρ娱L了過濾時(shí)間。一般壓力使用的范圍從5到100kg/cm2。至于過濾裝置，任何市場上所售的都可以使用。
用發(fā)酵法生產(chǎn)的并含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)的堿性氨基酸的堿性水溶液用緊密-超濾膜過濾，在水溶液中分子量大于分離分子量的膠顆粒和水溶性蛋白質(zhì)仍然未通過過濾器，而堿性氨基酸卻通過了，從而實(shí)現(xiàn)了分離。
實(shí)施例1依據(jù)在日本公開專利申請02-186995(1990)中的實(shí)例中描述的方法，培養(yǎng)出一種細(xì)菌Brevibacterium flavum AJ12429(FERM BP-2227)并得到25千升L-精氨酸發(fā)酵液體(L-精氨酸含量750千克)。這種發(fā)酵肉湯的pH用鹽酸調(diào)整到從6.5至7，然后用離心法分離出細(xì)胞。再把去除細(xì)胞的溶液裝到一種陽離子交換樹脂(MITSUBISHICHEMICAL Co.，Diaion SK-1B，樹脂床6千升)中以吸收L-精氨酸，然后用8千升水沖洗。隨后，加入1N的NaOH水溶液洗脫L-精氨酸。洗脫液在減壓下濃縮至1千升體積，然后冷卻到10℃，從而結(jié)晶出L-精氨酸的二水合物。這樣獲得的結(jié)晶體用離心法分離得到600kg的粗晶體(L-精氨酸的二水合物，L-精氨酸含量480kg)。600kg的這種粗晶溶于純水中，使其體積為2500升，溫度為60℃。這樣獲得的溶液用0.5升10％的一種蛋白質(zhì)凝結(jié)劑，潔爾滅(Benzalkonium chloride)(Kao Sanyzol)的水溶液相混合，混合物攪拌1小時(shí)，加入6kg活性碳之后，混合物再攪拌45分鐘。然后，脫色的溶液預(yù)涂有硅藻土的陶瓷過濾器過濾，在60℃再加入500升純水并連續(xù)過濾，以回收在過濾器中的殘?jiān)?。這樣所獲得的脫色溶液的體積為3000升。
這種脫色溶液分別用一種傳統(tǒng)的方法，超濾法(UF-法)和本發(fā)明的方法(L-RO-法)提純以獲得相應(yīng)的提純結(jié)晶產(chǎn)物，超濾法作為對比例。[傳統(tǒng)方法]1000升的脫色溶液經(jīng)0.5μm膜濾器過濾后減壓濃縮(680mmHg)至300升體積，以便有效地結(jié)晶。濃縮的漿被送到一結(jié)晶器中，冷卻至10℃同時(shí)攪動(dòng)，然后分離所得的晶體。分離出的晶體用少量無-熱原水沖洗。
所得的濕的提純晶體為170kg。
然后，用一錐形干燥器減壓干燥(720mmHg)該濕的提純晶體，同時(shí)在12小時(shí)內(nèi)逐步把溫度從65℃升到95℃。
干燥的提純的晶體為136kg。(超濾法)1000升脫色溶液用一種超濾膜(NTU-3250，NITTO DEKO Co.，分離分子量(對蛋白質(zhì))大約為6000)，在下列條件下過濾。
UF條件壓力2kg/cm2流速10升/分溫度25至30℃脫色溶液的過濾繼續(xù)進(jìn)行直到濃縮的溶液(被處理的溶液)的體積變?yōu)?.5升時(shí)止，然后用10升純水再過濾以回收的L-精氨酸。透過的體積1010升。
這種透過的溶液經(jīng)過一種類似于傳統(tǒng)的方法經(jīng)0.5μm膜濾器過濾處理，得到了一種干燥的晶體。
所得的干燥的提純的晶體為135kg。將1000升脫色溶液用一種緊密-超濾膜過濾，該膜用帶有磺酰基的合成樹脂制成(NTR-7410，NITTO DENKO Co.，NaCl排斥率10％)，過濾條件如下(L-RO條件) 壓力 10kg/cm2流速 10升/分溫度 25至30℃
脫色溶液的過濾繼續(xù)進(jìn)行，直到濃縮的溶液(被處理溶液)的體積變?yōu)?.5升時(shí)為止，然后用10升的純水繼續(xù)再過濾以回收仍留存的L-精氨酸。透過的溶液體積為1010升。
這種透過的溶液經(jīng)過一種類似在傳統(tǒng)方法中經(jīng)0.5μm膜濾器的過濾處理，得到一種干燥的晶體。
得到的干燥的提純的晶體的為136kg。
用上述三種方法得到的干燥的提純的晶體在下列條件下過濾以便比較其過濾性能。用2N鹽酸水溶液調(diào)整pH，其過濾性能用過濾所要求的時(shí)間長短來評價(jià)。
結(jié)果列于表1中。
(過濾性能評價(jià)的條件)壓力2kg/cm2L-精氨酸濃度5g/分升溫度30℃過濾的體積 1.4升過濾膜 微孔0.22μm GSpH 11，7，5，3表1在各pH時(shí)水溶液的過濾時(shí)間(秒)提純晶體的溶液 pH11 pH7 pH5 pH3傳統(tǒng)的方法 1010 1510 8000 阻塞UF-法 8501400 2640 阻塞L-RO法930 910 880 920用傳統(tǒng)方法和UF-法得到的提純結(jié)晶在pH值從中性到酸性表現(xiàn)出極差的過濾性，特別是在pH值為3時(shí)。另一方面，用L-RO法(本發(fā)明的方法)得到的提純晶體在pH值從中性到酸性卻沒有表現(xiàn)出變劣的過濾性。實(shí)施例2取1000升按與實(shí)施例1相同的方法制取的脫色溶液，用L-RO方法，使用非填充緊密-超濾膜(HR-20，Toray，NaCl排斥率15％)在下列條件下處理(L-RO條件)壓力 25kg/cm2流速 12升/分溫度 20至25℃脫色溶液的過濾繼續(xù)進(jìn)行，直到濃縮的溶液(被處理的溶液)的體積變?yōu)?.5升為止，然后用10升純水繼續(xù)再過濾，以回收仍留存的L-精氨酸。透過的容積為1020升。
這種滲過液用在傳統(tǒng)方法中用經(jīng)0.5μm膜濾器相同的過濾處理后，得到一種干燥的晶體。
所得的干燥的提純的晶體量為132kg。
用上述方法獲得的干燥的提純的晶體，在與例1中相同的條件下過濾，以評價(jià)其過濾性能。
結(jié)果列于表2中。
表2在各pH值時(shí)水溶液的過濾時(shí)間(秒)pH11 pH7 pH5 pH3用L-RO法提純的晶體水溶液921918 920 914使用本發(fā)明的方法，避免了過濾性能下降的問題，甚至當(dāng)堿性溶液中的堿性氨基酸在pH值從中性到酸性的范圍內(nèi)進(jìn)行過濾也如此。
權(quán)利要求
1.一種堿性氨基酸的提純方法，其中，用發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸的堿性水溶液用一種緊密-超濾膜過濾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的氨基酸的提純方法，其中，所述氨基酸選自L-精氨酸、L-賴氨酸和L-鳥氨酸。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種提純堿性氨基酸的方法，該方法甚至在用過濾法處理中性或酸性氨基酸水溶液時(shí)仍不會(huì)引起過濾性變劣的問題。提純堿性氨基酸的方法，其中發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸的堿性水溶液是用緊密-超濾膜過濾的。
文檔編號C07C277/00GK1132741SQ9512052
公開日1996年10月9日 申請日期1995年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月30日
發(fā)明者金兒豐一, 久光邦夫 申請人:味之素株式會(huì)社