專利名稱：黑素瘤抑制蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黑素瘤抑制蛋白質(zhì)(MIA)，編碼該蛋白質(zhì)的核酸，該蛋白質(zhì)的分離和檢測方法，及其在制備治療劑上的用途。
細(xì)胞生長調(diào)節(jié)被起正調(diào)節(jié)作用和負(fù)調(diào)節(jié)作用的因子控制。起正調(diào)節(jié)作用的因子包括已知的生長因子如表皮生長因子(EGF)，血小板衍生的生長因子(PDGF)，胰島素和促生長因子。具有負(fù)調(diào)節(jié)作用即具有抑制活性的因子除包括能作為生長刺激物及生長抑制劑的TGF-β(Robert et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.82(1985)，119-123)外，還包括來自結(jié)腸癌細(xì)胞(Levine et al.，CancerResearch 45(1985)，2248-2254)，黑素瘤(Bogdahn et al.，Cancer Research 49(1989)，5358-5363)以及來自鼠乳腺正常上皮細(xì)胞(Ethier et al.，J.Cell.Phys，142(1990)，15-20)的內(nèi)源性腫瘤抑制因子。
這一調(diào)節(jié)系統(tǒng)的失調(diào)例如由于具有正調(diào)節(jié)作用的生長因子的過度產(chǎn)生或者由于這些生長因子上突變細(xì)胞的降低的依賴性(Rodeck etal.，International Journal of Cancer 40(1987)，687-690)能使腫瘤細(xì)胞以不受控制的方式增殖，上文提到的來自各種腫瘤組織的腫瘤抑制因子代表可能能夠有治療意義地介入這一損傷的調(diào)節(jié)系統(tǒng)的令人感興趣的化合物。大量和以可再現(xiàn)的純度為這一治療用途提供這些因子是很可能的。然而對(duì)于大多數(shù)這些因子來說至今只描述了來自細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的富集級(jí)分，由于它們的復(fù)合物和有時(shí)的未知的組合物，以及與生產(chǎn)它們的相伴的不可重現(xiàn)性，使它們不適于治療用途。
本發(fā)明基于一種新的黑素瘤抑制蛋白質(zhì)(以下以MIA蛋白質(zhì)，或MIA表示，該蛋白質(zhì)抑制細(xì)胞系HTZ 19-dM和ATCC CRL 1424的生長，且該蛋白質(zhì)a)由編碼成熟蛋白或者有N端前序列的蛋白質(zhì)的SEQ ID NO 1所示的DNA序列或者由SEQ ID NO 3所示的基因組序列編碼，b)由與SEQ ID NO 1或3所示DNA序列或這些DNA序列在其編碼成熟蛋白之DNA區(qū)的片段雜交的DNA序列所編碼。
生長抑制作用被理解為抗增殖活性。在本方法中向培養(yǎng)基中加入MIA蛋白質(zhì)大大阻滯細(xì)胞的生長。為此合適的濃度是例如0.1μg MIA蛋白質(zhì)/ml培養(yǎng)基。然而較高或較低的MIA蛋白質(zhì)濃度也適于生長抑制作用，根據(jù)不同的濃度可發(fā)現(xiàn)較高或較低的生長抑制作用。
在Cancer Research 49(1989)，5358-5363，CancerResearch 50(1990)，6981-6986，Melanoma Research 2(1992)，327-336中，發(fā)明人已描述過這種蛋白質(zhì)的性質(zhì)。但在這些出版物中沒有陳述可重復(fù)的制備該蛋白質(zhì)的方法。該蛋白質(zhì)可由人黑素瘤細(xì)胞系HTZ 19-dM獲得，該細(xì)胞系以前是公眾不能得到的。該細(xì)胞系得自轉(zhuǎn)移的惡性黑素瘤并且在確定成份的無血清培養(yǎng)基(50％Dulbecco極限必需培養(yǎng)基，50％F-12)中在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下進(jìn)行單層培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基中含有0.8mmol/1 L-谷氨酰胺，非必需氨基酸，10μg/ml鐵傳遞蛋白，30nmol/l亞硒酸鈉和4μg/ml慶大霉素。該細(xì)胞系于93年6月23日在Braunschweig的“Deutsche Sammlung fr Mikroorganismen undZellkulturen GmbH”保藏(DSM ACC 2133)。這也是本發(fā)明的進(jìn)一步主題。按照本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以通過對(duì)具有大約11kD的蛋白級(jí)分進(jìn)行凝膠色譜分離和通過對(duì)該級(jí)分進(jìn)行反相高效液相色譜(HPLC)的后續(xù)純化從這種細(xì)胞系的培養(yǎng)物上清液中獲得。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可由其DNA序列和由其衍生的氨基酸序列限定。該MIA蛋白質(zhì)可存在各個(gè)不同的自然等位變異(例如SEQ ID NO 24)。這樣的氨基酸變異通常是氨基酸替代。然而它們也可以是整個(gè)序列中氨基酸的缺失，插入或添加。就大小和類型而言，依據(jù)其在其中被表達(dá)的細(xì)胞和細(xì)胞類型本發(fā)明的MIA蛋白質(zhì)可以是糖基化的或非糖基化的形式。
根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以用重組方法產(chǎn)生。當(dāng)在原核生物中用重組法產(chǎn)生時(shí)得到非糖基化MIA蛋白質(zhì)。借助本發(fā)明提供的核酸序列，在任何所需細(xì)胞(例如，除人細(xì)胞外，還有其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的基因組中尋找MIA基因或其變異體、鑒定它們、并分離編碼MIA蛋白質(zhì)的所期望的基因是可能的。這種方法和合適的雜交條件對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的，并且在例如J.Sambrook的Molecular cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，1989和B.D.Hames，S.G.Higgins的Nucleic acid hybridisation-a practicalapproach(1985)IRL Press，Oxford，England中有描述。在這種情況下，這些出版物中描述的標(biāo)準(zhǔn)方案通常被用于本實(shí)驗(yàn)中。
應(yīng)用重組DNA技術(shù)能生產(chǎn)多種MIA蛋白質(zhì)衍生物。這種衍生物可以例如在一個(gè)或幾個(gè)氨基酸位置通過取代，缺失或添加來修飾?？梢酝ㄟ^例如位點(diǎn)定向誘變的方法來進(jìn)行衍生作用。這種變異可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行(J.Sambrook，B.D.Hames，Loc.Lit.)。只是要確保保留MIA蛋白質(zhì)的特有的性質(zhì)(上文提到的細(xì)胞系的抑制作用)。
因此本發(fā)明還涉及一種MIA蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)
a)是外源DNA的原核生物或真核生物的表達(dá)產(chǎn)物，b)由編碼成熟蛋白或帶一個(gè)N端前序列的蛋白質(zhì)的SEQ ID NO 1所示的DNA序列或者由SEQ ID NO 3所示的基因組序列編碼，c)由與SEQ ID NO 1或3所示DNA序列或這些DNA序列在其編碼成熟蛋白之DNA區(qū)的片段雜交的DNA序列所編碼，或d)由假若不存在遺傳密碼的簡并性時(shí)將會(huì)與b)至c)中定義的序列雜交的并編碼具有氨基酸序列的多肽的DNA序列編碼。
由SEQ ID NO 1中核苷酸40～432或112至432編碼的，或被由于遺傳密碼簡并性而編碼具有相同氨基酸序列的多肽的DNA序列所編碼的蛋白質(zhì)是優(yōu)選的。
來自HTZ 19-dM的MIA蛋白質(zhì)分子量大約是11kD，是熱穩(wěn)定的(在100℃穩(wěn)定3分鐘)，且對(duì)蛋白酶例如胰蛋白酶敏感。
本發(fā)明涉及編碼MIA蛋白質(zhì)的核酸，它選自以下組a)SEQ ID NO 1和3所示的DNA序列或其互補(bǔ)序列，b)與a)中序列之一雜交的核酸序列，c)假若不存在遺傳密碼的簡并性時(shí)將會(huì)與a)或b)所述序列之一雜交的核酸序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如小鼠、大鼠、牛、羊)的黑素瘤抑制蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)能以基本類似的方式抑制細(xì)胞系HTZ19-dM和ATCC CRL 1424的生長，如人MIA蛋白質(zhì)。
通過按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法用含有編碼人MIA的序列的雜交樣品篩選各個(gè)哺乳動(dòng)物的cDNA文庫，進(jìn)行DNA序列和人及鼠MIA蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO 1-5)的序列比較，并鑒別編碼片段，可獲得類似于人MIA蛋白質(zhì)的這些蛋白質(zhì)。
本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是鼠MIA蛋白質(zhì)及為其編碼的核酸序列(SEQ ID NO4)。該鼠蛋白質(zhì)由SEQ ID NO 4的核苷酸110-499或179-499編碼。
借助于這些核酸可以可重復(fù)制備的方式大量獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)。為在原核或真核生物體(如原核宿主細(xì)胞或真核宿主細(xì)胞)中表達(dá)，按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法將核酸整合到合適的表達(dá)載體中。這種表達(dá)載體優(yōu)選地含有調(diào)節(jié)型/誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。然后為了表達(dá)，將這些重組載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，例如，大腸桿菌(原核宿主細(xì)胞)或釀酒酵母、畸胎瘤細(xì)胞系PA-1 sc 9117(Bttner et al.，Mol.Cell.Biol.11(1991)3573-3583)、昆蟲細(xì)胞、CHO或COS細(xì)胞(真核宿主細(xì)胞)，并且將被轉(zhuǎn)化的或被轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞在使得異源基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)?？捎霉姆椒◤乃拗骷?xì)胞或宿主細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中分離所述蛋白質(zhì)。這樣的方法被例如Ausubel I.，F(xiàn)rederick M.，Current Protocols in Mol.Biol.(1992)，John Wiley and Sons，New York描述。該蛋白質(zhì)的體外反應(yīng)活性也可能是必需的。
具有SEQ ID NO 1(cDNA)的核苷酸40-432或112-432(編碼序列)的DNA或按照SEQ ID NO 3的基因組DNA優(yōu)選地用于按照本發(fā)明的蛋白質(zhì)的重組制備中。
另外，本發(fā)明涉及一種通過用凝膠色譜分離法分離黑素瘤細(xì)胞系HTZ 19-dM的培養(yǎng)物上清液并用反相HPLC純化相應(yīng)分子量為約11kD(SDS-PAGE，非還原型)的級(jí)分，從而獲得MIA蛋白質(zhì)的方法。用這種方法能獲得大約0.2μg/l培養(yǎng)物上清液。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，天然MIA蛋白質(zhì)在分離和純化過程中經(jīng)酸處理。通過這一步驟可增加MIA活性。使用約為2的pH值是有利的，就酸來說，例如乙酸是合適的。
重組產(chǎn)生MIA蛋白質(zhì)的被轉(zhuǎn)化或被轉(zhuǎn)導(dǎo)之宿主細(xì)胞的檢測和所述蛋白質(zhì)的純化優(yōu)選地借助與這種蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體來實(shí)現(xiàn)。用本發(fā)明蛋白質(zhì)作抗原或免疫原，根據(jù)已知方法的簡單方式能獲得這樣的抗體。
因此本發(fā)明還涉及具有本發(fā)明的黑素瘤抑制活性的蛋白質(zhì)在產(chǎn)生與該蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體上的用途。
為此，用本發(fā)明的蛋白質(zhì)使通常用于此目的的動(dòng)物如，特別是羊、兔或小鼠免疫，然后按已知方法從免疫過的動(dòng)物身上分離抗血清，或按Khler和Milstein(Nature 256(1975)，495-497)的方法，使免疫過的動(dòng)物的脾細(xì)胞與無限增殖化細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞)融合。這些產(chǎn)生抗MIA蛋白質(zhì)的單克隆抗體的細(xì)胞選自用這種方法得到的雜交瘤細(xì)胞并被克隆。用此方法獲得的單克隆或多克隆抗體能結(jié)合到支持材料(例如纖維素)上，以進(jìn)行黑素瘤抑制蛋白質(zhì)的免疫吸附純化。并且這種抗體可用于樣品(例如被切除的組織或體液)中的MIA蛋白質(zhì)的檢測。
因此本發(fā)明進(jìn)一步涉及抗MIA蛋白質(zhì)的抗體。這種抗體通過用MIA蛋白質(zhì)使動(dòng)物免疫并由免疫過的動(dòng)物的血清或脾細(xì)胞分離這種抗體而獲得。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MIA蛋白質(zhì)不僅具有對(duì)黑素瘤細(xì)胞的抑制活性，而且通過抑制DNA合成(3H-thymidine incorporation(Coligan J.E.，Kruisbeek A.M.，Margulies D.H.，Shevach E.M.，StroberW.，Current Protocols Immunology，NIH Monograph，J.Wileyand Sons，New York，1992))，在軟瓊脂或腫瘤干細(xì)胞試驗(yàn)中抑制腫瘤克隆形成(Schlag P.，Hentje D.，Cancer TreatmentRev，11Suppl.A131-137，1984)程度稍差地具有對(duì)其它腫瘤細(xì)胞(例如惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌和神經(jīng)外胚層腫瘤)的抑制活性。相反正常的未變性細(xì)胞的生長不被抑制。這種蛋白質(zhì)在非常低的濃度(毫微克范圍)下就發(fā)生作用。因此這種蛋白質(zhì)適于制備用于腫瘤治療的治療劑。這樣的治療劑特別適用于治療惡性黑素瘤、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、支氣管癌(特別是小細(xì)胞支氣管癌SCLC)和神經(jīng)細(xì)胞瘤。
另外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黑素瘤抑制蛋白質(zhì)抑制外周血淋巴細(xì)胞的白細(xì)胞介素2-依賴和植物血細(xì)胞凝集素誘導(dǎo)的增殖作用。也降低了T-淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性。因此黑素瘤抑制蛋白質(zhì)也適于制備用作免疫抑制劑的治療劑。
因此本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的蛋白質(zhì)在制備可用于腫瘤治療中或用作免疫抑制劑的治療劑上的用途。
如果需要，本發(fā)明蛋白質(zhì)可以在所述治療用途的藥物制劑中與通常使用的輔助劑，填充劑和/或添加劑一同使用。
因此本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有本發(fā)明的黑素瘤抑制蛋白質(zhì)以及如果需要，還可含有通常使用的輔助劑，填充劑和/或添加劑的治療組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及MIA基因序列，優(yōu)選地是編碼具有MIA活性的蛋白質(zhì)的序列，或5′末翻譯區(qū)的活化序列在基因治療中，特別是在制備用于基因治療的藥物中的用途。
通過使用例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其它病毒載體，或通過非病毒基因轉(zhuǎn)移(為了清楚，參考T.Friedmann，Science 244(1989)1275；Morgan 1993，RAC DATA MANAGEMENT REPORT，June 1993)可實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的基因治療。
適合基因治療的載體體系是，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒(Mulligan，R.C.(1991)in Nobel Symposium 8Ethiology of humandisease at the DNA level(Lindsten，J.and PattersunEditors)，pages 143-189，Raven Press)、腺相關(guān)病毒(McLughlin，J.Virol，62(1988)，1963)、牛痘病毒(Moss etal.，Ann.Rev.Immunol.5(1987)305)、牛乳頭狀瘤病毒(Rasmussen et al.，Methods Enzymol，139(1987)642)或皰疹病毒組病毒，如非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒(Margolskee et al.，Mol.Cell.Biol.8(1988)2937)或單純性皰疹病毒。
也有已知的非病毒傳送體系，為此通常使用“裸”核酸，優(yōu)選的是DNA，或與輔助劑(例如轉(zhuǎn)移劑(脂質(zhì)體，dendromers，聚賴氨酸-轉(zhuǎn)鐵蛋白-軛合物(Wagner，1990；Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)7413))一同使用的核酸。
基因治療另一種優(yōu)選的方法以同源重組為基礎(chǔ)。在這種方法中，編碼MIA蛋白質(zhì)的基因能以一個(gè)或多個(gè)拷貝插入到體細(xì)胞基因組中，和/或內(nèi)源性地存在于細(xì)胞中的MIA基因能被調(diào)整，優(yōu)選地是被激活。
同源重組方法已有描述，例如Kucherlapati，Proc，in Nucl.Acids Res，和Mol.Biol.36(1989)301；Thomas，等.，Cell 44(1986)419-428；Thomas和Capecchi，Cell 51(1987)503-512；Doetschman等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)8583-8587和Doetschman等Nature 330(1987)576-578。這些方法中，將在基因組的特定位點(diǎn)被整合的DNA片段(MIA的基因片段)結(jié)合到靶DNA上。該靶DNA是與基因組DNA區(qū)(優(yōu)選地在MIA基因內(nèi)或與其鄰近)互補(bǔ)(同源)的DNA。當(dāng)單鏈DNA(例如靶DNA和基因組DNA)中兩個(gè)同源部分相互緊鄰時(shí)，它們將雜交生成雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)。然后通過重組將MIA基因片段和靶DNA整合到基因組中。這種同源重組能在體外和體內(nèi)(患者體內(nèi))進(jìn)行。
優(yōu)選地使用編碼有MIA活性的蛋白質(zhì)的DNA，抑制MIA表達(dá)的片段(失效序列)，或在細(xì)胞基因組整合后能激活在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)具有MIA活性的蛋白質(zhì)的片段。這樣的片段可以是，例如一個(gè)啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)，它與相應(yīng)的MIA區(qū)是異源的，或者在整合到MIA基因中后在轉(zhuǎn)錄和/或翻譯上激活實(shí)際上的沉默的或在很小程度上被表達(dá)的MIA基因。
因此，通過這種DNA，新將一個(gè)或更多MIA基因引入靶細(xì)胞，或以這種方式激活哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中實(shí)質(zhì)上的轉(zhuǎn)錄沉默基因，使哺乳動(dòng)物細(xì)胞能產(chǎn)生內(nèi)源MIA蛋白質(zhì)。為實(shí)現(xiàn)此目的，通過同源重組將DNA構(gòu)建體插入基因組中。該DNA構(gòu)建體包含一種有效地連接到基因上時(shí)能調(diào)制，最好是刺激該基因表達(dá)的DNA調(diào)節(jié)元件；一個(gè)或多個(gè)同源于這一基因組中的一個(gè)區(qū)的DNA靶片段，所述區(qū)在該基因內(nèi)或鄰近該基因。以使調(diào)節(jié)片段有效地連接到編碼具有MIA活性的蛋白質(zhì)的基因上的方式，將該構(gòu)建體插入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組中。該構(gòu)建體最好還包含擴(kuò)增序列，特別是在編碼具有MIA活性的蛋白質(zhì)的基因被插入到細(xì)胞中時(shí)。
為將MIA基因?qū)氚屑?xì)胞，該構(gòu)建體包括一個(gè)調(diào)節(jié)元件，一個(gè)或多個(gè)MIA基因和一個(gè)或多個(gè)靶片段。以使靶片段與基因組的合適的區(qū)雜交，從而在同源重組后，被插入的外源MIA基因被表達(dá)的方式選擇靶片段。
公知的許多方法能啟動(dòng)同源重組作用，優(yōu)選地同源重組發(fā)生在細(xì)胞的DNA復(fù)制或有絲分裂期間。這種DNA可以用來制備治療腫瘤的藥劑，或者在一宿主生物中制備同源的或異源的MIA蛋白質(zhì)。
提供以本發(fā)明提供的MIA蛋白質(zhì)的核酸序列為基礎(chǔ)的試驗(yàn)是可能的，它可用來檢測編碼MIA蛋白質(zhì)的核酸。這種實(shí)驗(yàn)可以例如在細(xì)胞或細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中進(jìn)行?？梢杂煤怂嵩\斷學(xué)的方法來進(jìn)行這種試驗(yàn)。在這種情況下被檢驗(yàn)的樣品和與編碼MIA蛋白質(zhì)的核酸序列雜交的探針接觸。探針和樣品中核酸的雜交表明被表達(dá)的MIA蛋白質(zhì)的存在。這樣的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的，并且在例如WO89/06698，EP-A0200362，USP2915082，EP-A0063879，EP-A0173251，EP-A0128018中有描述。
在一個(gè)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，在試驗(yàn)前擴(kuò)增樣品中編碼MIA蛋白質(zhì)的核酸，例如通過公知的PCR技術(shù)。在核酸診斷學(xué)領(lǐng)域通常使用衍生化的(標(biāo)記的)核酸探針。使該探針與樣品中載體結(jié)合的變性DNA或RNA接觸，并且在這種方法中，選擇溫度，離子強(qiáng)度，pH值和其它的緩沖液條件，選擇的方式是依據(jù)核酸樣品的長度和期望的雜交體的形成的解鏈溫度，使標(biāo)記DNA或RNA能與同源DNA或RNA結(jié)合(雜交作用，也參見J.Mol.Biol.98(1975)，503；Proc.Natl.Acad.Sci.USA76(1979)，3683)合適的載體是以硝基纖維素(例如Schleicher和Schll，BA 85，Amersham Hybond，C.)，強(qiáng)化或結(jié)合的粉末狀硝基纖維素為基質(zhì)的膜和載體材料，或用各種功能基(例如硝基)衍生的綿綸膜(例如Schleicher和Schll，Nytran NEN，Gene Screen；Amersham Hybond M.；Pall Biodyne)。
通過對(duì)載體充分洗滌并飽和以阻止非特異結(jié)合后，將載體與抗體或抗體片段一起溫育來檢測雜交DNA或RNA。所用抗體或抗體片段在衍生化作用中直接針對(duì)摻入到核酸探針中的物質(zhì)。將抗體本身標(biāo)記，但使用直接標(biāo)記的DNA是可能的。與抗體一起溫育后，再次洗滌以便只檢測特異結(jié)合的抗體軛合物。然后按已知方法經(jīng)抗體或抗體片段的標(biāo)記進(jìn)行測定。
可以用例如如下的方法進(jìn)行MIA表達(dá)的檢測——使用固定化組織涂片和分離的中期細(xì)胞分裂染色體用固定化整細(xì)胞原位雜交，——集落雜交(細(xì)胞)和噬斑雜交(噬菌體和病毒)，——Northern雜交(RNA檢測)，——血清分析(例如通過狹線印跡分析進(jìn)行的血清細(xì)胞的細(xì)胞類型分析)，——擴(kuò)增作用后(例如PCR技術(shù))。
因此本發(fā)明包括檢測編碼MIA蛋白質(zhì)的核酸的方法，其特征在于被檢測樣品與選自下組的核酸探針一同溫育a)SEQ ID NO 1和3所示的DNA序列或其互補(bǔ)序列b)與a)中序列之一雜交的核酸，核酸探針與樣品中的核酸一同溫育，檢測樣品中核酸和核酸探針的雜交作用，如果需要，通過進(jìn)一步的結(jié)合配偶體進(jìn)行檢測。
因此，在腫瘤診斷學(xué)中(轉(zhuǎn)移、發(fā)展)，MIA是有價(jià)值的預(yù)后性標(biāo)記。
結(jié)合下面的實(shí)施例和圖示，通過序列表更詳細(xì)地闡述本發(fā)明，在這種情況下SEQ ID NO 1——表示具有前序列的人MIA的cDNASEQ ID NO 2——表示蛋白質(zhì)SEQ ID NO 3——表示MIA的基因組DNASEQ ID NO 4——表示具有前序列的鼠MIA的cDNASEQ ID NO 5——表示蛋白質(zhì)SEQ ID NO 6——表示引物SEQ ID NO 7——表示引物SEQ ID NO 8——表示克隆片段
SEQ ID NO 9——表示引物SEQ ID NO 10——表示引物SEQ ID NO 11——代表銜接子SEQ ID NO 12——表示銜接子SEQ ID NO 13——表示融合蛋白SEQ ID NO 14——表示融合蛋白SEQ ID NO 15——表示引物SEQ ID NO 16——表示引物SEQ ID NO 17——表示引物SEQ ID NO 18——表示在大腸桿菌中表達(dá)的融合游離的MIASEQ ID NO 19——表示引物SEQ ID NO 20——表示引物SEQ ID NO 21——表示引物SEQ ID NO 22——表示引物SEQ ID NO 23——表示多接頭SEQ ID NO 24——表示MIA的基因組DNA(等位變異體)

圖1描述了人MIA的發(fā)病抑制活性(以％表示的有或沒有MIA的細(xì)胞的動(dòng)物的抑制作用)B16＋mMIA用鼠MIA的試驗(yàn)。圖2描述了以CD4+T細(xì)胞的％溶解表示的T-細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性被MIA抑制的抑制作用。圖3描述了LAK-細(xì)胞的細(xì)胞毒活性被MIA抑制的抑制作用。圖4描述植物血細(xì)胞凝集素依賴性淋巴細(xì)胞擴(kuò)增被MIA抑制的抑制作用(MIA的濃度以ng/ml表示)。圖5描述IL-2刺激的PBMC增生被MIA抑制的抑制作用(MIA的濃度以ng/ml表示)。圖6表示表達(dá)質(zhì)粒pQE40-MIA的質(zhì)粒圖(實(shí)施例5a)。圖7表示載體pCMX-PL1的質(zhì)粒圖(實(shí)施例7a)。
實(shí)施例1從HTZ 19-dM細(xì)胞分離黑素瘤抑制蛋白質(zhì)在含0.8mmol/1 L-谷氨酰胺(Gibco，U.K.)，非必需氨基酸(Gibco，U.K.)，10μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(Boehringer MannheimGmbH，Catalogue NO.1073974)，30nmol/(亞硒酸鈉(Sigma)和4μg/ml慶大霉素(Merck)的確定成份的無血清組織培養(yǎng)培養(yǎng)基(50％Dulbecco′s極限必需培養(yǎng)基，50％F-12，BoehringerMannheim GmbH)中單層培養(yǎng)HTZ 19-dM細(xì)胞。在3至4天之間移出這一培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液并在-70℃保存至純化。
為了純化，將細(xì)胞培養(yǎng)物上清液濾過0.45μm過濾器(BectonDickinson，Heidelberg)并用帶Amicon YM2膜(排阻限2000 D，Amico Danvers Massachusetts，USA)的膜超濾作用濃縮至為初始體積1％的終體積。將所得物用0.1mol/l乙酸透析30小時(shí)(透析膜排阻限為1000D，Reichelt，Heidelberg)，緊接著在4℃以100,000g下進(jìn)行超離心。棄除沉淀，將上清液凍干用于后續(xù)步驟。
用1mol/l乙酸溶解凍干的透析物，在Biogel P-10柱(Pharmacia，Uppsala，2.6×100cm；Biogel P-10，200-400目，Biorad Laboratories，Richmond，加利弗尼亞，USA)上進(jìn)一步用凝膠滲透色譜純化。用1mol/l乙酸在22℃平衡凝膠材料，透析物以每5ml 1mol/l乙酸中130-145mg的濃度使用。用1mol/l乙酸以12ml/小時(shí)的流速洗脫，以每份4ml收集級(jí)分。通過抗腫瘤活性測定(參考實(shí)施例5)確定三個(gè)活性成份樣品池，其中再用反相HPLC純化對(duì)應(yīng)分子量為8000至17000 D的中間的樣品池。為此，首先將這些級(jí)分凍干一次，然后溶解在1％三氟乙酸(TFA)中。將所得溶液的100μl等分樣每一份進(jìn)行反相HPLC(流速0.5ml/min)。每一份收集750μl級(jí)分。有關(guān)HPLC分離的進(jìn)一步數(shù)據(jù)如下梯度控制溶液A在水中的0.06TFA溶液B0.056％TFA，80％乙腈5分鐘內(nèi)2～25％溶液B120分鐘內(nèi)25～50％溶液B5分鐘內(nèi)50～100％溶液B5分鐘內(nèi)再轉(zhuǎn)至2％柱mino RPC(Pharmacia)HPLC梯度混合器，泵和檢測器Pharmacia以1.5ml一個(gè)級(jí)分收集洗脫液。將等份樣品凍干并如實(shí)施例5所述進(jìn)行抗腫瘤活性檢驗(yàn)。
用這種方法由5l培養(yǎng)物上清液可得到大約1μg黑素瘤抑制蛋白質(zhì)。
實(shí)施例2實(shí)施例2a克隆編碼人黑素瘤抑制蛋白質(zhì)的cDNA純化蛋白質(zhì)的Asp-N和胰蛋白酶消化及用這種方法獲得的肽片段的再純化后，在序列儀中測定MIA的氨基酸序列。C-端肽序列和位于鄰近N-端的肽序列被選作兩個(gè)引物合成的基礎(chǔ)。該引物是具有增加的限制性酶切位點(diǎn)的簡并寡核苷酸。上游引物1(有義)(UP1)(SEQ ID NO 6)5′TGTGAATTCAGTTIA/TG/CIGCIGAT/CCAA/GGAA/GTG 3′EcoRI位點(diǎn)斜線(/)表示這個(gè)位置的堿基在斜線前或在斜線后。這種寡核苷酸是32種不同分子量的混合物，因此覆蓋了幾乎所有可能的密碼子。與靶序的G-T錯(cuò)配只能發(fā)生在12和13位，不增強(qiáng)雜交物的穩(wěn)定性但也不降低其穩(wěn)定性。另外一種EcoRI接頭額外地與5′端相連接是為了能通過PCR容易地再克隆可能的產(chǎn)物。還有3個(gè)非特定堿基位于在5′終點(diǎn)的這一接頭的前面以使限制性酶切位點(diǎn)不是恰好在末端，因?yàn)樵诖宋恢孟拗泼覆荒芎芎玫孛盖?。下游引?(反義)(DP1)(SEQ ID NO 7)5′TGTGTCGACTGTTCGTAGAAA/GTCCCATCTTA/GTC 3′SalI位點(diǎn)DP1相應(yīng)于8個(gè)C-端氨基酸，是8-倍簡并的且含有一個(gè)SalI酶切位點(diǎn)。
引物DP1被用于特定的第一鏈合成的下述混合物中5μl 10×PCR緩沖液3μl HTZ-19總RNA混合并加熱5分鐘至65℃。用移液管加入以下成份1μl 100mM MgCl210μl 2.5mM dNTP0.5μl胎盤RNase抑制劑2μl DP1(1μg)1μl反轉(zhuǎn)錄酶。在37℃溫育1小時(shí)后向上述混合物中加入下列成份1μl UP1(1μg)5μl 10×PCR緩沖液
70.5μl H2O1μlTaq聚合酶用下面方法進(jìn)行30輪擴(kuò)增94℃30秒55℃30秒72℃60秒最后一輪后將混合物在72℃再溫育7分鐘以使所有產(chǎn)物完全延伸。
用苯酚/氯仿提取并用EtOH沉淀后，所述PCR混合物用EcoRI和SalI在37℃消化2小時(shí)。酶激活后，接著在5％PAA凝膠中分離并整夜洗脫320bp片段。洗脫液的一半與100ng EcoRI/SalI消化的pbluescript整夜結(jié)合。由細(xì)菌(大腸桿菌DH5a)中能采集白色重組體菌落，將其在第二天轉(zhuǎn)化，并在含有Amp和X-Gal/IPTG SOB瓊脂平片上培養(yǎng)。
分離質(zhì)粒后，用購自Pharmacia的T-7Deaza測序試劑盒將再克隆的插入物測序。T-3和T-7引物(Stratagene)作為引物可購得。下圖由閱讀序列的重疊形成(引物用粗體)
(SEQ ID NO 8)GAATTC AAG TTT TCG GCG GAT CAG GAG TGC AGC CAC CCT ATC TCC ATGEcoR1 Lys Phe Ser Ala Asp Gln Glu Cys Ser His Pro Ile Ser MetGCT GTG GCC CTT CAG GAC TAC ATG GCC CCC GAC TGC CGA TTC CTG ACCAla Val Ala Leu Gln Asp Tyr Met Ala Pro Asp Cys Arg Phe Leu ThrATT CAC CGG GGC CAA GTG GTG TAT GTC TTC TCC AAG CTG AAG GGC CGTIle His Arg Gly Gln Val Val Tyr Val Phe Ser Lys Leu Lys Gly ArgGGG CGG CTC TTC TGG GGA GGC AGC GTT CAG GGA GAT TAC TAT GGA GATGly Arg Leu Phe Trp Gly Gly Ser Val Gln Gly Asp Tyr Tyr Gly AspCTG GTC GCT CGC CTG GGC TAT TTC CCC AGT AGC ATT GTC CGA GAG GACLeu Val Ala Arg Leu Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Ile Val Arg Glu AspCAG ACC CTG AAA CCT GGC AAA GTC GAT GTG AAG ACA GAT AAA TGG GATGln Thr Leu Lys Pro Gly Lys Val Asp Val Lys Thr Asp Lys Trp AspTTC TAC GAA CAGTCGACPhe Tyr Glu SalI
用于克隆由在確定成份的培養(yǎng)基(dM)中生長的HTZ-19黑素瘤細(xì)胞的RNA合成的完全cDNA的λgt11 cDNA文庫是可獲得的。
以8000 pfu涂布共25塊平板，每板上置有2個(gè)硝基纖維素過濾器，它們與用切口平移標(biāo)記的純化的MIA-PCR插入物雜交(50ml雜交溶液，2×106cpm/ml)。經(jīng)過兩天放射自顯影后得到幾個(gè)信號(hào)，它們?cè)趦蓚€(gè)濾器上給出相應(yīng)的雜交信號(hào)。收集相應(yīng)的噬菌體-噬斑并進(jìn)行再篩選。為此每個(gè)分離的噬斑的四個(gè)稀釋步驟被制成平板，具有100-300pfu的平板被用于兩次進(jìn)一步的再篩選。
50ml過夜培養(yǎng)后，從由這種方式分離的噬斑可分離λDNA，其40μg用EcoRI消化并在5％PAA凝膠中分離。洗脫插入物，8ng用于與100ng EcorRI-消化的去磷酸化載體(pbluescript，Stratagene)連接。連接混合物的一半用于感受態(tài)大腸桿菌DH5a的轉(zhuǎn)化作用，大腸桿菌DH5a涂布在含有IPTG和X-Gal的SOB/Amp平板上以進(jìn)行蘭/白選擇。采集重組體克隆，分離質(zhì)粒DNA，插入物被測序。具有完全編碼序列的插入物的序列見SEQ ID NO 1。
用這種方法得到的質(zhì)粒是pbs L 7MIA，該質(zhì)粒于93年7月14日在德國Braunschweig的“Deutsche Sammlung frMikroorganismen und Zellkulturen GmbH”(DSM)(DSM 8420)保藏。
用于克隆的所有方法在J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis(1989)，Molecular cloninga laboratorg manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor USA中有詳細(xì)描述。
實(shí)施例2b克隆編碼人黑素瘤抑制蛋白的基因?qū)⑸虡I(yè)上可由Stratagene(Heidelberg)購得的噬菌體λFIXII(Elgin et al.，Serategies 4(1991)8～9)中的人基因組DNA文庫根據(jù)已建立的方法(Sambrook et al.，MolecularCloning(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press)覆蓋在硝基纖維素濾膜上。為了用作雜交樣品，按已建立的技術(shù)(Sambrook et al.，Molecular Cloning(1989)，Cold SpringHarbor Laboratory Press)放射標(biāo)記并使用得自實(shí)施例2a的編碼人MIA的cDNA預(yù)雜交(2小時(shí))和雜交(16小時(shí))在60℃下在6×SSC，5×Denhardt′s溶液，100μg/ml鮭魚精液DNA和0.1％SDS中進(jìn)行。以1×106cpm/ml濃度向雜交制劑中加入32P-dCTP-標(biāo)記的樣品。然后在60℃用2×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜兩次20分鐘，再用1×SSC，0.1％SDS洗滌兩次20分鐘，最后用0.25×SSC，0.1％SDS洗滌兩次20分鐘。接著將濾膜干燥并暴露于X-射線膠片下24至48小時(shí)。經(jīng)再雜交分離并確認(rèn)用這種方法產(chǎn)生陽性雜交信號(hào)的噬斑。通過使用MIA cDNA樣品的Southern雜交作用鑒定這些噬菌體中含有的作為插入物的人基因組DNA。為此目的，噬菌體DNA用限制性內(nèi)切核酸酶XbaI切割，在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，然后按照Southern的方法(J.Mol.Biol，98 (1975)503)轉(zhuǎn)移到硝基纖維素上。在上述條件下，將如此得到的濾膜與作為樣品的完整的MIAcDNA雜交，由此大約1.4kb和大約2.2kb大小的兩個(gè)XbaI片段給出陽性信號(hào)。將這兩個(gè)片段中的每一個(gè)克隆到適于測序且可由Stratagene(Heidelberg)購得的質(zhì)粒pbluescriptsk(Short et al.，Nucl.Acids Res.16(1988)7583-7600；Alting-Meese andShort，Nucl.Acids Res.17(1989)9494)上。編碼人MIA的完整序列位于四個(gè)外顯子中，它們與其側(cè)翼序列一起示于SEQ ID NO3中。由于沒有研究MIA外顯子位于其上的兩個(gè)XbaI片段之間是否有一個(gè)或甚至幾個(gè)另外的XbaI片段，因此不能得出內(nèi)含子2事實(shí)上更大的結(jié)論。
實(shí)施例2c克隆編碼鼠黑素瘤抑制蛋白質(zhì)的cDNA用實(shí)施例2a的方法，將市售的(Novagene，New York)得自13.5日齡的小鼠胚胎在載體λEXlox(Palazzolo et al.，Gene88(1990)25-36)中的cDNA文庫轉(zhuǎn)移到膜上。就雜交樣品來說，使用來自實(shí)施例2a的以放射性標(biāo)記形式的編碼人MIA的cDNA。除雜交和洗滌過程中在這里使用的溫度是55℃外，雜交條件與實(shí)施例2b中的相同。將如此經(jīng)再雜交獲得并確認(rèn)的噬斑中存在的cDNA插入物測序。含有鼠MIA的完全編碼DNA的插入物序列示于SEQ ID NO4中。實(shí)施例2d克隆編碼鼠黑素瘤抑制蛋白質(zhì)的基因在這一實(shí)施例中，用類似于實(shí)施例2b的方式，用來自實(shí)施例2c的鼠MIA cDNA為樣品研究鼠基因組DNA文庫(來自BALB/C成年小鼠的肝臟，在EMBL 3載體(Frischauf et al.，J.Mol.Biol.170(1983)827)中可從Clontech，Palo Alto CA購得)。條件與實(shí)施例2b相同。進(jìn)一步的處理方法也以類似的方式進(jìn)行。
實(shí)施例3實(shí)施例3a測定黑素瘤抑制蛋白質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗增殖作用為了測定實(shí)施例1得到的黑素瘤抑制蛋白質(zhì)或蛋白級(jí)分對(duì)黑素瘤細(xì)胞的抗增殖作用，在96孔微量培養(yǎng)板(Costar，Zrich)上培養(yǎng)指數(shù)生長的HTZ 19-dM細(xì)胞24小時(shí)，每板有100μl無血清培養(yǎng)基(見實(shí)施例1)，密度為每孔3×103個(gè)細(xì)胞(按照Chambard etal.，J.Cell.Physiol.135(1988)，101-107)。然后這些細(xì)胞與待測蛋白質(zhì)級(jí)分一起在37℃/5％CO2條件下溫育4-5天。向每孔加入1μCi3H-胸腺嘧啶脫氧核苷(特異性活性23Ci/mmol，Amersham Buchler，Braunschweig，德國)后，在相同條件下將細(xì)胞再溫育8小時(shí)，然后用液體閃爍記數(shù)器用常規(guī)方法在酸沉淀后測定3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入到細(xì)胞DNA中的摻入作用。待測蛋白質(zhì)級(jí)分的活性以與未處理過的對(duì)照細(xì)胞3H-胸苷摻入作用比較處理過的細(xì)胞3H-胸苷摻入作用的百分比表示。通過用不同濃度的純化的黑素瘤抑制蛋白質(zhì)，可測定與未處理的對(duì)照相比，這種3H-胸苷摻入作用50％被抑制的濃度(IC50值見下面表1)。
表1黑素瘤抑制蛋白質(zhì)對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的抗增殖作用
1)使用了第一純化步驟后得到的蛋白質(zhì)(過Biogel P10柱后，比完全純化后低50-100倍活性)。
實(shí)施例3b測定黑素瘤抑制蛋白質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用為了測定對(duì)MIA轉(zhuǎn)移的抑制作用，使用了改良的Boyden ChamberSystem(Albini et al.，Cancer Res.47(1987)3239-3245)。由堅(jiān)固的Costar得到腔室(Blind Well Chamber No.441200)。為了模擬下腔室中化學(xué)引誘劑和上腔室中細(xì)胞之間基底類膜屏障，將52μl Matrigel(Becton Dickinson Cat.No.40234)加到聚碳酸酯纖維濾器上(孔大小8μm，Costar No.150446)。下腔室裝入210μl成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘劑。按下述方法獲得該培養(yǎng)基在不加牛胎血清下，將正常人皮膚成纖維細(xì)胞保持在DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中的第10和第20通道之間24小時(shí)。這種條件培養(yǎng)基以不稀釋狀態(tài)作為化學(xué)引誘劑使用。向Boyden儀上腔室中加入2×105個(gè)待測的在800μl有和沒有MIA活性成份的DMEM(Gibco，無牛胎血清)中的腫瘤細(xì)胞。用所描述的有關(guān)經(jīng)MIA對(duì)其遷移行為的抑制作用的方法能試驗(yàn)人(見實(shí)施例3a或?qū)嵤├?)或動(dòng)物腫瘤細(xì)胞(例如，B16(ATCC CRL 6322))，當(dāng)不加黑素瘤抑制蛋白時(shí)，在約4小時(shí)期間內(nèi)大約10％的腫瘤細(xì)胞由上腔室遷移到下腔室中，在那里粘著在Matrigel膜的較低的一邊。在那里，將其固定，染色，然后計(jì)數(shù)。如果將人或鼠黑素瘤抑制蛋白質(zhì)MIA加到上腔室中，則細(xì)胞遷移被大大抑制。圖1給出了所得到的抑制值([在下腔室中計(jì)數(shù)細(xì)胞，有MIA的實(shí)驗(yàn)]-＼[在下腔室中計(jì)數(shù)細(xì)胞，沒有MIA的實(shí)驗(yàn)]×100％)。
實(shí)施例4測定免疫學(xué)活性實(shí)施例4aMIA抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性在標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放試驗(yàn)中特異于MBP肽87-106的CD4+T細(xì)胞系D7.1能溶解存在MBP及肽87-106的靶(靶Daudi細(xì)胞，R.Martin，U.Utz，J.E.Coligan，J.R.Richert，M.Flerlage，E.Robinson，R.Stone，W.E.Biddison，D.E.MacFarlin，H.F.MacFarland Diversity.in fine specificity and T cellreceptor usage of the human CD4+cytotoxic T cellresponse specific for the immunodominant myelin basicprotein peptide 87-106，J.Immunol.(1992)，148(5)，1359-1366)。加入MIA后(使用量相當(dāng)于大約50-100ng/ml純化的MIA)，肽特異性細(xì)胞毒性被抑制大約55％(圖2a)，而MBP特異性細(xì)胞毒性被抑制大約50％(圖2b)。如所期望的，抑制作用稍稍依賴于效應(yīng)物-靶比值(E∶T)該比值在這種情況下在1∶1或5∶1的非常低的水平，因而抑制作用是高度特異性的(圖2)。
實(shí)施例4bMIA抑制淋巴因子激活外周血淋巴細(xì)胞(LAK細(xì)胞)的細(xì)胞毒活性LAK細(xì)胞是非克隆擴(kuò)增的淋巴因子激活的外周血淋巴細(xì)胞，占優(yōu)勢(shì)地是T淋巴細(xì)胞(A.A.Rajncr，E.A.Grimm，M.T.Lotze，E.W.Chu，S.A.Rosenberg，Lymphokine activated killer(LAK)cellsAnalysis of factors relevant for immunotherapyof human cancer，Cancer 55(1985)，1327-1333)。它們被用于腫瘤治療的許多免疫療法中的標(biāo)準(zhǔn)方法中。在本次實(shí)驗(yàn)中，在微細(xì)胞毒性測定中檢驗(yàn)LAK細(xì)胞以HTZ-19黑素瘤細(xì)胞為靶的細(xì)胞毒性。在效應(yīng)物-靶比值為1∶1、5∶1和10∶1時(shí)，最大細(xì)胞毒性(CTX)幾乎達(dá)40％。加入MTA后(濃度如實(shí)施例4a)，該毒性得到了大大抑制，且在低效應(yīng)物-靶比值時(shí)可達(dá)最大80％抑制，這一比值很可能預(yù)期接近腫瘤本身(圖3)。
實(shí)施例4cMIA抑制IL-2依賴性和植物血細(xì)胞凝集素依賴性淋巴細(xì)胞的增殖作用可用標(biāo)準(zhǔn)化的經(jīng)典的方法用植物血細(xì)胞凝集素(PHA)和白介素-2(IL-2)刺激外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)(J.E.Coligsn，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W.Strober，Current protocols in immunology，NIH Monograph，J.WileySons，Now York，1992)。在這一方法中，T細(xì)胞幾乎單一地由PHA刺激，而IL-2占優(yōu)勢(shì)地刺激T淋巴細(xì)胞但也刺激具有IL-2受體的B細(xì)胞。當(dāng)它們?cè)谒鰟┝糠秶?蛋白質(zhì)純度第一純化步驟后(Biogel P10柱)其活性比完全純化后低大約50-100倍)與MIA共同溫育時(shí)，獲得PHA應(yīng)答的非常強(qiáng)的抑制作用是可能的(圖4)。IL-2應(yīng)答在較高劑量范圍內(nèi)被抑制(圖5)。
實(shí)施例5MIA作為融合蛋白在大腸桿菌中的重組表達(dá)實(shí)施例5a表達(dá)載體的構(gòu)建為了表達(dá)具有適于在大腸桿菌中作為載體的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)MIA，可以使用例如市售的載體pQE40(Cat.No.33403，DIAGEN GmbH，Dsseldorf)。編碼成熟形式MIA的cDNA片段被插入到載體限制性位點(diǎn)SphI和HindIII(每個(gè)位點(diǎn)只出現(xiàn)一次)之間。使用作為模板的克隆MIAcDNA和兩個(gè)合適的引物(5 ′-GATGCATGC-GGTCCTATGCCCAAGCTG-3′(SEQ ID NO 9)和5′-GATAAGCTTTCA-CTGGCAGTAGAAATC-3′(SEQ ID NO 10)。按現(xiàn)有技術(shù)經(jīng)PCR擴(kuò)增可很簡單地制備這種類型的片段。用SphI和HindIII切割所得的PCR片段并將其連接到用相同方法處理過的載體pQE40上。所得質(zhì)粒表達(dá)DHFR(二氫葉酸鹽還原酶作載體)和MIA的融合蛋白。為了從這種融合蛋白質(zhì)中解脫分裂出游離的MIA，將編碼IgA蛋白酶(Ser Arg ProPro/Ser)的識(shí)別序列的DNA片段克隆到DHFR和MIA之間。這一過程按以下完成用BgIII(具有線性化載體后續(xù)分離的部分限制性)和SphI切開表達(dá)質(zhì)粒，然后插入銜接子(5′-GATCTAGCCGGCCGCCCAGCCCGGCATG-3′(SEQ ID NO 11)和5′-CCGGGCTGGGCGGCCGGCTA-3′(SEQ ID NO 12)，雜交成雙鏈。所得表達(dá)質(zhì)粒pQE40-MIA編碼DHFR和MIA融合蛋白，其IgA蛋白酶酶切位點(diǎn)位于DHFR和MIA之間。該融合蛋白在N-端攜帶6個(gè)組氨酸，它在Ni-螯合凝膠材料的幫助下可用于純化該融合蛋白。這類方法在EP-A0282042和EP-A0253303在此一并作為參考中有描述。圖6示出了表達(dá)質(zhì)粒pQE40-MIA。
通過消除載體蛋白DHFR并用盡可能小且能完成相同功能的肽取代它，可優(yōu)化MIA內(nèi)含物。這種合適的肽是，例如，MetArgGlySer-HisHisHisHisHisHisGlySerSerArgProPro(SEQ ID NO 13)(這種肽可被IgA蛋白酶從緊接著的成熟MIA的氨基酸序列分裂開來，這種方法在WO91/11520中描述。這里一并作為參考)或MetArgGlySerHisHisHisHisHisHisGlySerValAspAspAspAspLys-(SEQ ID NO 14)(這種肽可由腸激酶從緊接著的成熟MIA的氨基酸序列分裂開來)。用下面方法可以制備編碼這種MIA肽融合物的表達(dá)質(zhì)粒用作為模板的MIA cDNA(SEQ ID NO1)和引物5′-AAAAAGGATCCAGCCGGCCGCCCG-GTCCTATGCCCAAGCTGGC-3′(SEQ ID NO 15)和5′-GGCGAGCAG-CCAGATCTCCATAG-3′(SEQ ID NO 16)的PCR擴(kuò)增得到用BamHI和BgIII再切割的片段。也用BamHI和BgIII限制性酶切表達(dá)載體pQE40-MIA；所得片段的較小片段被棄掉并被所描述PCR片段取代。由此得到一種表達(dá)載體，它在誘導(dǎo)后表達(dá)融合蛋白MetArgGlySerHisHisHisHis-HisHisGlySerSerArgProPro-MIA(SEQ ID NO 13)。用引線物5′-AAAAAAGGATCCGTTGATGATGACGATAAAGGTCCTATGCCCAAGCTGGC-3′(SEQ ID NO 17)和5′-GGCGAGCAGCCAGATCTCCATAG-3′(SEQ ID NO 16)以完全類以的方式獲得融合蛋白MetArgGlySerHisHisHisHisHisHisGlySerValAspAspAspAspLys-MIA(SEQ ID NO 14)。
用類似方法可制得其它相似的肽和MIA的融合蛋白，并在合適的(特別是強(qiáng)的和誘導(dǎo)型)啟動(dòng)子的控制下，克隆到從大腸桿菌發(fā)現(xiàn)的許多質(zhì)粒中的一個(gè)中，并使其表達(dá)。在大腸桿菌中引起融合蛋白分泌到周質(zhì)中，然后分裂并釋放MIA的多肽與MIA的融合是另一種可選擇的方式。WO88/09373中描述了這種方式，這里一并作為參考。
實(shí)施例5b融合蛋白的表達(dá)和MIA的回收表達(dá)質(zhì)粒pQE40-MIA(或例如通過使用基本載體或其它載體蛋白質(zhì)或載體肽能得到的相似的表達(dá)質(zhì)粒，這些可供選擇的方法除在實(shí)施例5a中描述外，還在Methods of Enzymology 185(GeneExpression Technology)，ed David V.Goeddel，AcademicPress 1991中有描述)，轉(zhuǎn)染到合適的有足夠lac抑制劑表達(dá)作用的大腸桿菌菌株中，以便得到MIA融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。為此目的，有合適的例如菌株大腸桿菌M15[pREP4]，(它可與pQE40(DiagenGmbH，Dsseldorf)一起購得)或其它大腸桿菌菌株，例如UT5600(Earhart et al.，F(xiàn)EMS Microbiology Letters 6 (1979)277-280)，或大腸桿菌BL21(Godborg and Dunn，J.Bacteriol.170(1988)1245-1254)，它們事先已被lac抑制劑表達(dá)輔助質(zhì)粒(如，pUBS520(描述于Brinckmann et al.，Gene 85(1989)109-114或EP-B-0373365中))轉(zhuǎn)染。其次，通過下述方法可得MIA在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌M15[pREP4/pQE40-MIA]直至光密度達(dá)到0.6(在550nm測量)，然后以1mM的終濃度加入IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，Boehringer MannheimGmbH)，然后再培養(yǎng)4小時(shí)。離心分離細(xì)胞，置于有300mM NaCl，pH7.5的100mM磷酸鈉緩沖液中并經(jīng)冷凍和解凍三次溶解，然后用超聲處理。向經(jīng)離心澄清的溶胞產(chǎn)物中加入Ni-NTA-瓊脂糖(DiagenGmbH)，考慮到制備者所述的最大結(jié)合能力，在室溫下攪拌溫育過夜。用低速離心分離如此載有融合蛋白的凝膠材料，用100mM pH7.5的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次并用pH6.1的磷酸鈉緩沖液洗滌兩次。此后，經(jīng)在37℃在100mM pH7.5磷酸鈉緩沖液中用IgA蛋白酶(BoehringerMannheim GmbH)的凝膠材料的過夜溫育從融合蛋白上分裂出MIA，離心過夜分離凝膠材料，無菌過濾后含MIA的上清液用于實(shí)施例3和4所描述的活性試驗(yàn)中。
實(shí)施例6非融合MIA在大腸桿菌中的重組表達(dá)以使其在大腸桿菌中有效表達(dá)的方式修飾編碼MIA的DNA序列。為達(dá)到此目的，使用作為模板的人MIA cDNA(SEQ ID NO1)和引物1(5′-AAAAACATATGGGACCAATGCCAAAATTAGCAGATCGTAAATTATGTG-CAGATCAGGAG-3′(SEQ ID NO 19))和2(5′AAAAAAAGCTTTCAC-TGGCAGTAGAAATC-3′(SEQ ID NO 20))，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物1以在不改變MIA氨基酸序列時(shí)，DNA序列和其mRNA序列對(duì)大腸桿菌是最適的方式改變N-端區(qū)的編碼MIA的序列，加入起始密碼子met，就在這一位點(diǎn)插入了限制性內(nèi)切核酸酶Ndel的識(shí)別序列，這一序列使得接著將這樣修飾的MIA編碼片段克隆到了含有(最好是強(qiáng)的和誘導(dǎo)型的)啟動(dòng)子和具有后來置于的Ndel酶切位點(diǎn)的翻譯起始序列(ShineDalgarno Sequence)的載體上。引物工作為3′-反向引物起作用并含有HindIII酶切位點(diǎn)，以便使修飾的MIA編碼片段作為Ndel HindIII片段插入到載體中。如此修飾的MIA編碼序列示于SEQ ID NO 18中。用這種方法制備的一種表達(dá)質(zhì)粒是pH379(DSM9267)，該質(zhì)粒已于1994年6月29日在Braunschweig的“Deutsche Sammluny vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH”，D-38124保藏。
為了表達(dá)，將用于表達(dá)未融合MIA的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到合適的大腸桿菌菌株中。在使用lac阻遏物控制下的表達(dá)質(zhì)粒(如表達(dá)質(zhì)粒p11379 )的情況下，這樣的菌株是具有足夠高lac阻遏物細(xì)胞內(nèi)濃度的菌株?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)染第二質(zhì)粒如pREP4(Diagen GmbH)，pUBS500或pUBS520(Brinckmann et al.，Gene 85(1989)109-114)制備這些類型的菌株。所用大腸桿菌菌株最好具有低的細(xì)胞本身的蛋白酶活性，例如，用E.coli UT5600(Earhart et al.，F(xiàn)EMSMicrobiology Letters 6(1979)277-280)，E.coli BL21(Grodberg and Dann，J.Bacteriol 170(1988)1245-1253)或E.coli B就是這種情況。然后以類似于實(shí)施例5b的方法進(jìn)行表達(dá)培養(yǎng)。為了回收MIA，可按照EP0241022，EP0364926，EP0219847和DE-A4037196中描述的方法處理作為蛋白質(zhì)聚集體從大腸桿菌獲得的蛋白質(zhì)。
更詳細(xì)地，例如用下述方法實(shí)現(xiàn)該目的將來源于大腸桿菌發(fā)酵(稱作“inclusion bodies”)的含MIA的蛋白質(zhì)聚集體(所謂“包含體”)溶解在6M鹽酸胍，100mM pH8的Tris HCl，1mM EDTA中然后調(diào)pH3至4，并在pH3.5下對(duì)4M鹽酸胍透析。然后在pH8的1M精氨酸，1mM EDTA，5mM GSH(谷胱苷肽，還原態(tài))和0.5mMGSSG(谷胱苷肽，氧化態(tài))中使溶解的蛋白質(zhì)復(fù)性。通過復(fù)性制備可得到MIA，例如，加入1.4M硫酸銨后被疏水凝膠基質(zhì)(如FractogelTSK Butyl(E.Merck，Darmstadt))吸附，然后用20mM pH7的Tris HCl洗脫。
實(shí)施例7MIA在真核細(xì)胞中的重組表達(dá)實(shí)施例7aMIA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的重組表達(dá)為此，將人(SEQ ID NO1)或鼠(SEQ ID NO4)MIAcDNA或其相應(yīng)基因組DNA片段連接到載體上，以強(qiáng)啟動(dòng)子一增強(qiáng)子系統(tǒng)為基礎(chǔ)在所述載體中，所述cDNA和DNA片段被轉(zhuǎn)錄到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中(在基因組MIA片段的情況下，這一步是必須的，因?yàn)镸IA本身的啟動(dòng)子只在某些細(xì)胞類型，例如黑素瘤中有活性，因此不適于一般重組表達(dá)；但通過如實(shí)施例9所描述的體外同源重組也可進(jìn)行表達(dá))。這樣的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子大多數(shù)來自病毒如SV40，hCMV，多形瘤或逆轉(zhuǎn)錄病毒?；蛘咭部梢允褂锰禺愑谀承┘?xì)胞類型或組織類型的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子體系，例如WAP-MMTV-或免疫球蛋白啟動(dòng)子，或其它誘導(dǎo)型體系，例如金屬硫蛋白啟動(dòng)子。這種載體補(bǔ)充具有RNA加工的供體和受體信號(hào)以及poly-A-加成信號(hào)的MIA cDNA(如果使用后者)。例如圖7所示pCMX-pL1(Umesono et al.，Cell 65(1991)1255-1266)就是這種合適的載體。被提供EcoRI接頭的MIA cDNA連接到這一載體的一個(gè)位點(diǎn)且只是EcoRI酶切位點(diǎn)上，其中通過借助這種載體(見SEQ ID NO23)多接頭中其它酶切位點(diǎn)的限制性分析，保證MIA cDNA朝CMV啟動(dòng)子的閱讀方向取向。當(dāng)克隆到其它載體(例如pCDNA3(Invitrogen，San Diego/USA)或pSG5(Stratagene，LaJolla/USA)中時(shí)使用絕對(duì)相似的方法。由大腸桿菌制備由此得到的表達(dá)質(zhì)粒的DNA并使用特定情況下特異于細(xì)胞類型的技術(shù)(Methodsof Enzymology 185(Gene Expression Technology)，ed.Dayid V.Goeddel，Academic Press 1991，Section V)轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。按照已公開的方法(Bttner et al.，Mol.Cell.8iol.13(1993)4174-4185)將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人畸胎瘤細(xì)胞系PA-lsc9177(Bttner et al.，Mol.Cell.Biol.11(1991)3573-3583)中，其中每100mM培養(yǎng)皿的200,000個(gè)細(xì)胞被5μg DNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后在無牛胎血清的MEM(Gibco)中培養(yǎng)細(xì)胞，由此，48小時(shí)后在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中可測定MIA。
實(shí)施例7bMIA在昆蟲細(xì)胞中的重組表達(dá)為在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，將編碼MIA的DNA片段，尤其是人MIA cDNA(SEQ ID NO1)插入到得自AcMNPV(苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒)或BmNPV(家蠶核型多角體病毒)的載體中。為此，使MIAcDNA在強(qiáng)啟動(dòng)子控制下首先引入，所述強(qiáng)啟動(dòng)子適于昆蟲細(xì)胞(D.R.O′Reilly，L.K.Millor and V.A.Luckow，BaculovirusExpression Vectors-A Laboratory Manual(1992)，W.H.Freeman & Co.，New York)，如poIH啟動(dòng)子或p10啟動(dòng)子。為了借助于poIH啟動(dòng)子表達(dá)MIA，使用了以下方法按公知技術(shù)，使用MIA cDNA為模板和引物5′-CGTGAATTCAACATGGCCCGGTCCCTGGTGTGC-3′(SEQ ID NO 21)和5′-TATCTGCAGTCACTGGCAGTAGAAATCCCA-3′(SEQ ID NO 22)。通過PCR擴(kuò)增獲得編碼MIA并含有限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI(與后MIA轉(zhuǎn)錄的5′端相鄰)和PstI(與后MIA轉(zhuǎn)錄的3′端相鄰)酶切位點(diǎn)的DNA片段。用EcoRI和PstI再切割該片段(為了產(chǎn)生相應(yīng)的粘端)并連接到用相同內(nèi)切核酸酶限制性酶切的轉(zhuǎn)移載體pVL 1393上(D.R.O′Reilly，L.K.Miller and V.A.Luckow，BaculovirusExpression Vectors-A Laboratory Manual(1992)，W.H.Freeman & Co.，New York)，該轉(zhuǎn)移載體pVL是商業(yè)上可購得的(PhorMingen，San Diego，CA或Invitrogen Corporation，SanDiego，CA)。為進(jìn)行增殖，將所得轉(zhuǎn)移表達(dá)質(zhì)粒pVL 1393-MIA轉(zhuǎn)染到大腸桿菌K12，并按已建立的方法制備質(zhì)粒DNA。按已建立的方法(O′Reilly et al.(1992)，見上文)，通過同源重組完成在poIH啟動(dòng)子控制下的MIA DNA由轉(zhuǎn)移質(zhì)粒向桿狀病毒載體的轉(zhuǎn)移。為此將0.5μg Baculo Gold DNA(具有致死缺失作用和在poIH啟動(dòng)子控制下的LacZ表達(dá)的線性化的AcNPV病毒DNA，可由PharMingen購得，序號(hào)21100D)和2μg pVL13-93-MIA混合，室溫下溫育5分鐘，然后與1ml，125mM，pH7.1的Hepes，125mM CaCl2，140mM NaCl混合。將該混合物加至事先用1ml含有10％牛胎血清的Grace′s培養(yǎng)基鋪蓋的直徑為60mm的培養(yǎng)皿中的2×106SF9昆蟲細(xì)胞中(Invitrogen，Order No.13825-01)。在4℃溫育4小時(shí)后，移去含DNA的培養(yǎng)基，細(xì)胞在27℃在新鮮培養(yǎng)基中溫育4天。接著通過噬斑形成將以這種方式得到的重組桿狀病毒純化兩次(O′Reilly et al.(1992)，見上文)，其中通過β-半乳糖苷酶活性的缺失(在5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷存在下因沒有藍(lán)色可光學(xué)識(shí)別)可從使用的野生型病毒(具有致死缺失作用和在poIH啟動(dòng)子控制下的LacZ表達(dá)作用的AcNPV，可由Pharmingen購得，序號(hào)21100D)中識(shí)別通過重組作用已被插入MIA的病毒。按已建立的方法(O′Reilly et al.(1992)，見上文)用如此得到的MIA表達(dá)重組桿狀病毒浸染SF9細(xì)胞(MOI＝20pfu/細(xì)胞)，并在無血清培養(yǎng)基(細(xì)胞/完全Bac無血清昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，Stratagene，序號(hào)205120)在27℃再溫育至少36小時(shí)。接著移去細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，通過超離心(Beckmann Ti 60 Rotor，30,000rpm)分離包含在上清液中的病毒，然后通過Microcon 100 Filter(Amicon，排阻限100kD)過濾上清液)。如此得到的含MIA的溶液可用于實(shí)施例3和4中所述的試驗(yàn)中，或根據(jù)實(shí)施例1進(jìn)一步純化。
實(shí)施例8各種細(xì)胞中MIA mRNA的檢測一方面，可用已建立的核酸雜交方法(例如Northern雜交，原位雜交，斑點(diǎn)或狹線雜交，和由此衍生的診斷技術(shù)。(Sambrook etal.，Molecular Cloning-ALaboratory Manual(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Nucleid AcidHybridisation-A Practical Approach(1985)，eds.B.D.Hames and S.J.Higgins，IRL Press；WO 89/06698，EP-A0200362，USP2,915,082，EP-A0063879，EP-A0173251，EP-A0128018)完成特定細(xì)胞中的MIA表達(dá)和由此的MIAmRNA存在的檢測。另一方面，可以使用來自使用MIA特定引物(PCRProtocols-A Guide to Methods and Applications(1990)，eds.M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky，T.J.White，Academic Press Inc；PCR-A Practical Approach(1991)，eds.M.J.McPherson，P.Quirke，G.R.Taylor(1991)，IRLPress)的多種擴(kuò)增技術(shù)的方法。表2A和2B示出了MIA在各種人腫瘤、腫瘤細(xì)胞系和正常細(xì)胞中的表達(dá)，在這種情況下是用放射性標(biāo)記的人MIA cDNA(SEQ ID NO1)的Northern雜交進(jìn)行測定的。為此目的，從按(homczynski和Sacchi，Anal.Biochem.162(1987)156-159的方法所列的細(xì)胞分離RNA。在1％瓊脂糖甲醛凝膠上分離20μg總RNA并按標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook et al.，MolecularCloning-A Laboratory Manual(1989)，Cold Spring HarborLaboratory Press)將其轉(zhuǎn)移到綿綸膜(Amersham，Braunschweig)上。放射標(biāo)記(Feinberg and Vogelstein，Anal.Biochem，137(1984)266-267)這個(gè)完整的人MTA cDNA(SEQ ID NO1)作為樣品。在68℃，在5×SSC，5×Denhardt′s 0.5％SDS，10％硫酸葡聚糖和100μg/ml鮭魚精液DNA中進(jìn)行雜交。然后在68℃以1×SSC每小時(shí)洗滌膜兩次，然后使膜對(duì)X-射線膠片曝光。表2A
>實(shí)施例9MTA編碼核酸用于治療目的的用途MIA抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在動(dòng)物模型和患者中，不僅可以通過MIA蛋白的內(nèi)源導(dǎo)入也可以通過DNA片段的插入產(chǎn)生這一效果，所述DNA片段在合適啟動(dòng)子的控制下編碼MIA，或含有能通過同源重組在細(xì)胞自身MIA基因之前整合到基因組中的合適的啟動(dòng)子。在后一種情況下，該啟動(dòng)子一定是處于在5′-未翻譯區(qū)以盡可能高的程度與人(或以動(dòng)物為模型的情況下是動(dòng)物)MIA基因同源或優(yōu)選地甚至是相同的序列部分的側(cè)翼(參見例如WO91/09955)。通過這一方法，如果DNA片段被插入到腫瘤細(xì)胞本身中，獲得腫瘤細(xì)胞以增加的程度表達(dá)MIA，因而抑制它自身的增生和轉(zhuǎn)移是可能的。然而在很多情況下，相應(yīng)的基因片段不必特定地和單獨(dú)地插入到腫瘤細(xì)胞本身中，因?yàn)樵谄渌w細(xì)胞，尤其是與腫瘤相鄰的體細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)通過增加MIA釋放也產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的抑制作用，下面的實(shí)施例給出了MIA編碼DNA片段在動(dòng)物模型中的治療效果。
給小鼠C57BL的尾靜脈注射鼠B16黑素瘤細(xì)胞(ATCC CRL 6322)，然后確定肺轉(zhuǎn)移量，是建立的轉(zhuǎn)移形成的體內(nèi)模型。在C57BL小鼠眼球后注射黑素瘤細(xì)胞系1316的100,000個(gè)細(xì)胞(第1天16只動(dòng)物)。48小時(shí)后，對(duì)8只動(dòng)物的每一只在尾靜脈注射在與DOTAP轉(zhuǎn)染劑(Leventis and Silvius，Biochim，Biophys.Acta.1023(1990)124-132，由Boehringer Mannheim GmbH購得，Cat.No.1202375)混合的TE(10mM Tris HCl pH8.0 1mM EDTA)中的100μg MIA表達(dá)質(zhì)粒pCMX-PL1-MIA(實(shí)施例7a)。給對(duì)照組(8只動(dòng)物)注射相同的質(zhì)粒，但無MIA序列。13天后，無MIA的對(duì)照組8只動(dòng)物中的6只發(fā)展為局部腫瘤；在肺、脾、腎和肝中轉(zhuǎn)移的平均數(shù)為7.8。已給予MIA編碼質(zhì)粒的組的8只動(dòng)物中只有4只發(fā)展為局部腫瘤，且轉(zhuǎn)移平均數(shù)為2.7。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名BOEHRINGER MANNHEIM GMBH(B)街道Sandhofer Str.116(C)城市Mannheim(D)州BW(E)國家德國(F)郵政編碼(ZIP)D-68305(G)電話08856/60-3446(H)光傳真08856/60-3451(ii)發(fā)明名稱黑素瘤抑制蛋白質(zhì)(iii)序列數(shù)24(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型Floppy盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC compatible(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(EPO)(vi)優(yōu)先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朌E P 43 24 247.2(B)申請(qǐng)日1993年7月20日(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度459個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置40..432(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞sig肽(B)位置40..111(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞mat肽(B)位置112..432(xi)序列描述SEQ ID NO1CCAGCACCCC CTTGCTCACT CTCTTGCTCA CAGTCCACG ATG GCC CGG TCC CTG54Met Ala Arg Ser Leu-24 -20GTG TGC CTT GGT GTC ATC ATC TTG CTG TCT GCC TTC TCC GGA CCT GGT 102Val Cys Leu Gly Val Ile Ile Leu Leu Ser Ala Phe Ser Gly Pro Gly-15 -10 -5GTC AGG GGT GGT CCT ATG CCC AAG CTG GCT GAC CGG AAG CTG TGT GCG 150Val Arg Gly Gly Pro Met Pro Lys Leu Ala Asp Arg Lys Leu Cys Ala1 5 10GAC CAG GAG TGC AGC CAC CCT ATC TCC ATG GCT GTG GCC CTT CAG GAC 198Asp Gln Glu Cys Ser His Pro Ile Ser Met Ala Val Ala Leu Gln Asp15 20 25TAC ATG GCC CCC GAC TGC CGA TTC CTG ACC ATT CAC CGG GGC CAA GTG 246Tyr Met Ala Pro Asp Cys Arg Phe Leu Thr Ile His Arg Gly Gln Val30 35 40 45GTG TAT GTC TTC TCC AAG CTG AAG GGC CGT GGG CGG CTC TTC TGG GGA 294Val Tyr Val Phe Ser Lys Leu Lys Gly Arg Gly Arg Leu Phe Trp Gly50 55 60
GGC AGC GTT CAG GGA GAT TAC TAT GGA GAT CTG GCT GCT CGC CTG GGC 342Gly Ser Val Gln Gly Asp Tyr Tyr Gly Asp Leu Ala Ala Arg Leu Gly65 70 75TAT TTC CCC AGT AGC ATT GTC CGA GAG GAC CAG ACC CTG AAA CCT GGC 390Tyr Phe Pro Ser Ser Ile Val Arg Glu Asp Gln Thr Leu Lys Pro Gly80 85 90AAA GTC GAT GTG AAG ACA GAC AAA TGG GAT TTC TAC TGC CAG 432Lys Val Asp Val Lys Thr Asp Lys Trp Asp Phe Tyr Cys Gln95 100 105TGAGCTCAGC CTACCGCTGG CCCTGCC459(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度131氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Arg Ser Leu Val Cys Leu Gly Val Ile Ile Leu Leu Ser Ala-24 -20 -15 -10Phe Ser Gly Pro Gly Val Arg Gly Gly Pro Met Pro Lys Leu Ala Asp-5 1 5Arg Lys Leu Cys Ala Asp Gln Glu Cys Ser His Pro Ile Ser Met Ala10 15 20Val Ala Leu Gln Asp Tyr Met Ala Pro Asp Cys Arg Phe Leu Thr Ile25 30 35 40His Arg Gly Gln Val Val Tyr Val Phe Ser Lys Leu Lys Gly Arg Gly45 50 55Arg Leu Phe Trp Gly Gly Ser Val Gln Gly Asp Tyr Tyr Gly Asp Leu60 65 70Ala Ala Arg Leu Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Ile Val Arg Glu Asp Gln75 80 85
Thr Leu Lys Pro Gly Lys Val Asp Val Lys Thr Asp Lys Trp Asp Phe90 95 100Tyr Cys Gln105(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度3565堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞sig肽(B)位置1378..1449(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1378..1504(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1586..1719(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置2804..2914(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子
(B)位置3232..3252(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞-(B)位置(2216)中之一(D)其它信息/注＝“在位置2216的N表示核苷酸不確定的數(shù)目和序列”(xi)序列描述SEQ ID NO3TCTAGACANA TAAAAATAAA AGAAATCATC CAAGAATGGT GACTTGCCTA CTATTCTACT 60CGAGAGGCTG AGAGGGGAGG ATTTCTTGAC CCCGGNAGTT TAAGGATGCA GTGAGCTATG 120ATCACATCAC TGTACTTCAG CCTGAGCAAC AGCAAGATCC TGTCTCTAAA AATTAAATAA 180GGCTGGGCTT GGTGGCTCAT GCTGTAATCC CAGCACTTTG GAAGGCCATG GTGGGCAGAT 240TGCTTGAGCC CAGGAGTTTG AGACGAGGCT GGGCAACATG ACGAAACCCC GGCTCTACCA 300AAAAATACAA AAAATTAACT GGGCATAATG GTACATGTCT GTGGTCCCAG CTACTCGGTA 360GGCTGAGGTG GGAGGAATGC TTGAGCCCAG GAAATAGGGG CTACAGTGAA CCAGGATGAT 420GCCAGTGCAC TCCAACCTGG GCAACAGAGC AAGACTCTAC CTCAAAATAA TTTAAAAAAA 480TGGATTAATT GGGCATAGGT GGCTTGTGCC TGTAGTCCCA GTTACTCAGG AGCCTGAGGT 540GGGAGGATTG CCTGAGTCTA GGAGGTTGAG GCTGCAGTGA GCCGGGATGG CACCATTGCA 600CTCCACCTGG GCAACAGGGT GAGACCCTGT CTCAAAAAAG AAAAAAAAGG GAGGGGTTAT 660AATCACTCCT CCTGACATGA TACAGAGTAT CCATTTGAGT TCATAACATA AATATGTACT 720TGGTGAATGC TCTGTAACTA TTGGTGAATG CTCTGTAACT ATTGGCTTTT TTATTGTTCC 780CATTTTACAT ATAAGGAAGC TGAGGCTTTG TGAGGAGAAA TAGCTTAGCC CAGGTCATCC 840AGTGGGAAGC GTCTGGTGCA GAGGAATAGT GATCAGGGTG GGACTTTGCC TAGCCTAAGG 900
TTCAGCATAC AATATTCAGT CAGTACTCAA GGGCTGGGCT GTTTCTGGTA ATCAAAGGGC 960CTGCCTTGTC CTCCTCCCCC ACAGCAGGAA ATTCCAAGGT GGTTTTCTTT ACAGGCTCCT 1020CCGCTTCTGT GGCCAGAGGG GACAGCGGAG GACCCCAGGT ACCTAAGCCA ACTCAAGAGA 1080AGATGGAATT GAATATTTCA ACCACCTTAT CTAGGCCTCT GTGATTGTTG AGGAGGGGGC 1140TGTCACTGGG AAAGTTGTGA GCTGCTTTGG ACCTTATCTG GGAATTTCCT TGGGCCTTAC 1200AGCTTTACCC TATCCTTGAA ATGGTTCTGG TTTCATAGCA ACTTCTAGGT GGTGTGGGCG 1260AAGTTTGGGA CTGGTTTAGG GCGGGGACAA GACCAAGAAC ACAAGTTTCC TTGTACGGGA 1320GAGAGGAAAT TGGAGACCCC AGCACCCCCT TGCTCACTCT CTTGCTCACA GTCCACGATG 1380GCCCGGTCCC TGGTGTGCCT TGGTGTCATC ATCTTGCTGT CTGCCTTCTC CGGACCTGGT 1440GTCAGGGGTG GTCCTATGCC CAAGCTGGCT GACCGGAAGC TGTGTGCGGA CCAGGAGTGC 1500AGCCGTAAGA ATGGGGAGGG GTAGAATTGG GCTTGGGTGT TAGCCTGTGT GGATGTGCTG 1560CATTCCCCTT CTATTCCTTC CCTAGACCCT ATCTCCATGG CTGTGGCCCT TCAGGACTAC 1620ATGGCCCCCG ACTGCCGATT CCTGACCATT CACCGGGGCC AAGTGGTGTA TGTCTTCTCC 1680AAGCTGAAGG GCCGTGGGCG GCTCTTCTGG GGAGGCAGCG TGCGTCTTGG GAGAGTGAAA 1740GAGGGAAGGG TACAGAGCTG GGGTAGACTC ATTATCCCCA TGAAGGGAAG ATTTGAGGGG 1800GGTGAACTGA AATAGACATT GTGGGGGGAT ATTGTTACTT ACTTTATTTT ATTTGCTTAT 1860TATTTTTTAA TTTTTTCCGA GACAGAGTCT TGCTCTGTCA CCCAGGCTGG ATGCAATGGC 1920ACGATCTCGG CTCACTGTAA CCTCCACCTC TTGGGTTTAA GCGATTCTCC AGCCTCAGCC 1980TCCCAAGTAC CTGGGATTAC AGGCATGCAC CACCACACCT NNTAATTTTT GTATTTTTAG 2040TAGAGACAGG GTTTTACCAT ATTGGCCAGG CTGGTCTTGA ACTCCTGACC TCATGATCTG 2100CCCGCCTTGG CTCCCGGAGT GCTGGGATTA CAGGTGTGAG CCACTGGCCC CCCAGCCTAT 2160TTTCACTTTA TTTACCAATT TTAGGACCTG ATATGGTCCC ANNNTCTGTT CTAGANTCTA 2220GACACCAAGA TACAACAACA AATGATCCTT TTTATTCTAA TGGAGGGAAA TGAACAAAAA 2280GCAAGGCATA AAAAATAGCA GCAGCCGGGC ACAGTAGCTC ACACCTGTAA TCCCAAGTAA 2340GGCCAAGTNN GGAGGATAGC TTGAGCCCAG GAGTTCGAGA CCAGCCTGGG CAACATAGCA 2400AGACCCCCAT CTCTATAAAA AAAAATTTAA AATTAACTGG GCATCATGGC ATGTGTCTGT 2460
GGTCCCGGCT ACTCGGGAGG CTGAGGTGGG AGGATTGCTT GATCCCAGAA GTTGAGGCTG 2520CAGTGAGCCG TGATCATGCT ACTGCACCTC AACCTGGCCG ACACAATGAG ACCCTGTTTC 2580CAAAATAATA ATAATAAAAG CAAATATGCG CTGCTGTGAG AATTAACAGA GACTTACTTG 2640GGTGTTCAGA AAGGGCCTCT GAACAGGTGG CATTTAAGCT GAGATTCATA TGACAAGGAT 2700GGAGCAGTTA TGTGGAGATC AGGGAGAGGG GAGAATGCAA AGGCCTTCAG CAGGCACAAG 2760CTTGCCATCT TCCAGACCCT AGCTTTTAAC TCCTCTTCCC CAGGTTCAGG GAGATTACTA 2820TGGAGATCTG GCTGCTCGCC TGGGCTATTT CCCCAGTAGC ATTGTCCGAG AGGACCAGAC 2880CCTGAAACCT GGCAAAGTCG ATGTGAAGAC AGACGTGAGT GTCATGGGGG CTGGCAAGAA 2940ATGTGGGGGG AGGACCCTTA GGTTGTGGGG ATGGGCAAAA ATGCTCCCAC ACTTGGCTCC 3000CTGGCCGCCT AGGTATGTGC GCTGGGAGAA ATTCTTTCCC TGCCTCAATT TTCTCACCAG 3060TAAAATGGGT CCAGTTGGGA GGTGCAAAGA TTAGAGGGCT CTAGGCTAAT TTGCATAGCA 3120NNTGTGTGGC CAGACCTGGG CCCTGCAGCT GCAGCCTTTG CTAAAACCAC TAGATCCTTT 3180GTGGTGTGAC CGCTGGTTTT CTTTCCACTG TTTCCCCTTT CTCTTTTTCA GAAATGGGAT 3240TTCTACTGCC AGTGAGCTCA GCCTACCGCT GGCCCTGCCG TTTCCCCTCC TTGGGTTTAT 3300GCAAATACAA TCAGCCCAGT GCAAACGGCT CGTCTCCGTG GTCTTTGGGG TGGGGTAGGG 3360TAGGGTGGGG ACTGTACAAA TGAAATGTTT CTCTAGGTTG CTGAATCTAA CCAATTAACC 3420CGCTGCCTGT GGTAACGTCA GTGGTTGCTA GGCAGAGTTT CGCTGATGAA AGCCCTGTGC 3480AGTAGGAGCG CTCCTAAGCT TAGGTTTCGA CACAAGCAAA GAAAACCTAA GCAGCCCAAC 3540TAGCGATTGT AGTGTCCTCT CTAGA 3565(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長度581堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA
(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置110..499(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞sig肽(B)位置110..178(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞mat肽(B)位置179..499(xi)序列描述SEQ ID NO4AAGCGGCGGA GACAGGATCG AGAACACAGG TTTCCTTGAT ATTCAGCCTG GAAGGAGGGC60AGGAGGAGCC CAGAGACCTC GTTCTTCACT TGGTCATTCT CAGTCCATG ATG GTG 115Met Val-23TGG TCC CCA GTG CTC CTT GGC ATC GTC GTC TTG TCT GTT TTT TCA GGG 163Trp Ser Pro Val Leu Leu Gly Ile Val Val Leu Ser Val Phe Ser Gly-20 -15 -10CCT AGC AGG GCT GAT CGA GCT ATG CCC AAG CTG GCT GAC TGG AAG CTG 211Pro Ser Arg Ala Asp Arg Ala Met Pro Lys Leu Ala Asp Trp Lys Leu-5 1 5 10TGT GCG GAC GAG GAA TGC AGC CAT CCT ATC TCC ATG GCT GTG GCC CTC 259Cys Ala Asp Glu Glu Cys Ser His Pro Ile Ser Met Ala Val Ala Leu15 20 25CAG GAC TAC GTG GCC CCT GAT TGC CGC TTC TTG ACT ATA TAT AGG GGC 307Gln Asp Tyr Val Ala Pro Asp Cys Arg Phe Leu Thr Ile Tyr Arg Gly30 35 40CAA GTG GTG TAT GTC TTC TCC AAG TTG AAG GGC CGT GGG CGC CTT TTC 355Gln Val Val Tyr Val Phe Ser Lys Leu Lys Gly Arg Gly Arg Leu Phe45 50 55TGG GGA GGC AGT GTT CAG GGA GGT TAC TAT GGA GAC CTG GCA GCC CGC 403Trp Gly Gly Ser Val Gln Gly Gly Tyr Tyr Gly Asp Leu Ala Ala Arg60 65 70 75
CTG GGC TAT TTC CCC AGT AGC ATT GTC CGG GAG GAC CTG AAC TCG AAA 451Leu Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Ile Val Arg Glu Asp Leu Asn Ser Lys80 85 90CCT GGC AAA ATT GAT ATG AAG ACC GAT CAA TGG GAT TTC TAC TGC CAG 499Pro Gly Lys Ile Asp Met Lys Thr Asp Gln Trp Asp Phe Tyr Cys Gln95 100 105TGAGCTCAGC CTACCGCTAT CCCTGCAGTT ACCTTCCGGC TCTATGCAAA TACAGCAGCC 559AATGGCAAAA AAAAAAAAAA AA581(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長度130氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Val Trp Ser Pro Val Leu Leu Gly Ile Val Val Leu Ser Val Phe-23 -20 -15 -10Ser Gly Pro Ser Arg Ala Asp Arg Ala Met Pro Lys Leu Ala Asp Trp-5 1 5Lys Leu Cys Ala Asp Glu Glu Cys Ser His Pro Ile Ser Met Ala Val10 15 20 25Ala Leu Gln Asp Tyr Val Ala Pro Asp Cys Arg Phe Leu Thr Ile Tyr30 35 40Arg Gly Gln Val Val Tyr Val Phe Ser Lys Leu Lys Gly Arg Gly Arg45 50 55Leu Phe Trp Gly Gly Ser Val Gln Gly Gly Tyr Tyr Gly Asp Leu Ala60 65 70Ala Arg Leu Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Ile Val Arg Glu Asp Leu Asn75 80 85Ser Lys Pro Gly Lys Ile Asp Met Lys Thr Asp Gln Trp Asp Phe Tyr90 95 100 105Cys Gln
(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長度31堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞-(B)位置one-of(14，17，20)(D)其它信息/標(biāo)記＝N/注＝“N表示I(肌苷)”(xi)序列描述SEQ ID NO6TGTGAATTCA GTTNWSNGCN GAYCARGART G31(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7TGTGTCGACT GTTCGTAGAA RTCCCATCTT RTC33(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征
(A)長度305堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_RNA(B)位置(1..29，277..305)聯(lián)合(D)其它信息/功能＝“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO8GAATTCAAGT TTTCGGCGGA TCAGGAGTGC AGCCACCCTA TCTCCATGGC TGTGGCCCTT60CAGGACTACA TGGCCCCCGA CTGCCGATTC CTGACCATTC ACCGGGGCCA AGTGGTGTAT 120GTCTTCTCCA AGCTGAAGGG CCGTGGGCGG CTCTTCTGGG GAGGCAGCGT TCAGGGAGAT 180TACTATGGAG ATCTGGTCGC TCGCCTGGGC TATTTCCCCA GTAGCATTGT CCGAGAGGAC 240CAGACCCTGA AACCTGGCAA AGTCGATGTG AAGACAGATA AATGGGATTT CTACGAACAG 300TCGAC 305(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長度27堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO9GATGCATGCG GTCCTATGCC CAAGCTG27
(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長度27堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10GATAAGCTTT CACTGGCAGT AGAAATC27(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)長度28堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11GATCTAGCCG GCCGCCCAGC CCGGCATG28(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA
(xi)序列描述SEQ ID NO12CCGGGCTGGG CGGCCGGCTA20(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)長度16氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO13Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ser Arg Pro Pro1 5 10 15(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)長度18氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO14Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Val Asp Asp Asp1 5 10 15Asp Lys(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征
(A)長度43堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO15AAAAAGGATC CAGCCGGCCG CCCGGTCCTA TGCCCAAGCT GGC43(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)長度23堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO16GGCGAGCAGC CAGATCTCCA TAG 23(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)長度50堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO17AAAAAAGGAT CCGTTGATGA TGACGATAAA GGTCCTATGC CCAAGCTGGC 50
(2)SEQ ID NO18信息(i)序列特征(A)長度330堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞mat肽(B)位置7..327(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_RNA(B)位置4..6(D)其它信息/功能＝“起始密碼子”(xi)序列描述SEQ ID NO18CATATGGGAC CAATGCCAAA ATTAGCAGAT CGTAAATTAT GTGCAGATCA GGAGTGCAGC 60CACCCTATCT CCATGGCTGT GGCCCTTCAG GACTACATGG CCCCCGACTG CCGATTCCTG 120ACCATTCACC GGGGCCAAGT GGTGTATGTC TTCTCCAAGC TGAAGGGCCG TGGGCGGCTC 180TTCTGGGGAG GCAGCGTTCA GGGAGATTAC TATGGAGATC TGGCTGCTCG CCTGGGCTAT 240TTCCCCAGTA GCATTGTCCG AGAGGACCAG ACCCTGAAAC CTGGCAAAGT CGATGTGAAG 300ACAGACAAAT GGGATTTCTA CTGCCAGTGA 330(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特征(A)長度59堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO19AAAAACATAT GGGACCAATG CCAAAATTAG CAGATCGTAA ATTATGTGCA GATCAGGAG 59(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征(A)長度29堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO20AAAAAAAGCT TTCACTGGCA GTAGAAATC29(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)長度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO21CGTGAATTCA ACATGGCCCG GTCCCTGGTG TGC 33(2)SEQ ID NO22信息(i)序列特征
(A)長度30堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO22TATCTGCAGT CACTGGCAGT AGAAATCCCA30(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特征(A)長度260堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO23GTGGGAGGTC TATATAAGCA GAGCTCTCTG GCTAACTAGA GAACCCACTG CTTAACTGGC 60TTATCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG AGACCCAAGC TGTACCAGAT ATCAGGATCC 120CCCGGGCTGC AGGAATTCGA TATCAAGCTT CTCGAGGGGG GGCCCGGTAC CGATCCTGGC 180CAGCTAGCTA GTAGCTAGAG GATCTTTGTG AAGGAACCTT ACTTCTGTGG TGTGACATAA 240TTGGACAAAC TACCTACAGA 260(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特征(A)長度596個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置(40..111，40..166，214..347，393..503，549…569)聯(lián)合(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞sig肽(B)位置40..111(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置40..166(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置214..347(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置393..503(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置549..569(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞-(B)位置(194，369，527)中之一(D)其它信息/注＝“在194，369和527位置的N表示核苷酸不確定的數(shù)目和序列”(xi)序列描述SEQ ID NO24CCAGCACCCC CTTGCTCACT CTCTTGCTCA CAGTCCACGA TGGCCCGGTC CCTGGTGTGC 60CTTGGTGTCA TCATCTTGCT GTCTGCCTTC TCCGGACCTG GTGTCAGGGG TGGTCCTATG 120CCCAAGCTGG CTGACCGGAA GCTGTGTGCG GACCAGGAGT GCAGCCGTAA GAATGGGGAG 180GGTAGAATTG GGNCCCTTCT ATTCCTTCCC TAGACCCTAT CTCCATGGCT GTGGCCCTTC 240AGGACTACAT GGCCCCCGAC TGCCGATTCC TGACCATTCA CCGGGGCCAA GTGGTGTATG 300TCTTCTCCAA GCTGAAGGGC CGTGGGCGGC TCTTCTGGGG AGGCAGCGTG GGTCTTGGGA 360GAGTGAAANA GCTTTTAACT CCTCTTCCCC AGGTTCAGGG AGATTACTAT GGAGATCTGG 420CTGCTCGCCT GGGCTATTTC CCCAGTAGCA TTGTCCGAGA GGACCAGACC CTGAAACCTG 480GCAAAGTCGA TGTGAAGACA GACGTGGAGT GTCATGGGGG CTGGCANTTT CCCCTTTCTC 540TTTTTCAGAA ATGGGATTTC TACTGCCAGT GAGCTCAGCC TACCGCTGGC CCTGCC 59權(quán)利要求
1.抑制細(xì)胞系HTZ 19-dM和ATCC CRL 1424生長的具有黑素瘤抑制活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)a)由編碼成熟蛋白質(zhì)或帶N-端前序列的蛋白質(zhì)的SEQ ID NO1所示DNA序列編碼，或由SEQ ID NO 3所示的基因組序列編碼，或者b)由與SEQ ID NO 1或3所示的DNA序列或這些DNA序列在其編碼成熟蛋白之DNA區(qū)的片段雜交的DNA序列所編碼。
2.如權(quán)利要求1所要求的蛋白質(zhì)，其分子量大約為11kD(SDS-Paye，非還原型)，可由黑素瘤細(xì)胞系HTZ 19-dM的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液獲得，并用凝膠色譜和反相HPLC純化。
3.如權(quán)利要求1或2所要求的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)a)是一種內(nèi)源DNA的原核或真核生物的表達(dá)產(chǎn)物，b)由編碼成熟蛋白或帶N-端前序列的蛋白質(zhì)的SEQ ID NO1所示DNA序列，或者被SEQ ID NO 3所示的基因組序列編碼，c)由與SEQ ID NO 1或3所示的DNA序列或這些DNA序列在其編碼成熟蛋白之DNA區(qū)的片段雜交的DNA序列所編碼。d)由假若不存在遺傳密碼簡并性時(shí)將會(huì)與b)至c)中所定義的序列雜交并編碼有相同氨基酸序列的多肽的DNA序列編碼。
4.如權(quán)利要求1-3所要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由SEQ ID NO1中的核苷酸40-432或112-432編碼。
5.如權(quán)利要求1或3所要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由SEQ ID NO4中的核苷酸110-499或179-499編碼。
6.細(xì)胞系HTZ 19-dM(DSM ACC 2133)。
7.編碼如權(quán)利要求1至5之一所要求的蛋白質(zhì)的核酸，其中，該核酸選自a)SEQ ID NO 1或3所示的DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列，b)與a)中序列之一雜交的核酸序列，c)假若不存在遺傳密碼的簡并性時(shí)將會(huì)與a)或b)中所述序列之一雜交的核酸序列。
8.具有SEQ ID NO 1所示序列的DNA。
9.具有SEQ ID NO 3所示序列的DNA。
10.具有SEQ ID NO 4所示序列的DNA。
11.含有編碼權(quán)利要求1至5所要求的蛋白質(zhì)的DNA并在被轉(zhuǎn)化微生物或被轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞中表達(dá)編碼蛋白質(zhì)之DNA的重組表達(dá)載體。
12.用編碼權(quán)利要求1-5所要求的蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)染并能產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的原核或真核宿主細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求12所要求的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞是大腸桿菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
14.編碼權(quán)利要求1至5所要求的蛋白質(zhì)的DNA在轉(zhuǎn)染原核或真核生物體上的用途。
15.一種通過用凝膠色譜分離法分離黑素瘤細(xì)胞系HTZ 19-dM的培養(yǎng)物上清液并純化相應(yīng)于分子量為大約11kD的上清液級(jí)分獲得具有黑素瘤抑制活性蛋白質(zhì)的方法。
16.一種通過在合適宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求7至10之一所要求的DNA，并從宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞培養(yǎng)物上清液分離蛋白質(zhì)來重組制備具有黑素瘤抑制活性蛋白質(zhì)的方法。
17.權(quán)利要求1-5之一所要求的具有黑素瘤抑制活性的蛋白質(zhì)作為抗原或免疫原在產(chǎn)生與這種蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體上的用途。
18.通過用權(quán)利要求1-5之一所要求的蛋白質(zhì)使動(dòng)物免疫并由該免疫過的動(dòng)物的血清或脾細(xì)胞分離可獲得的抗黑素瘤抑制蛋白質(zhì)的抗體。
19.權(quán)利要求1至5所要求的黑素瘤抑制蛋白質(zhì)在制備能用于腫瘤治療或作為一種免疫抑制劑的治療劑上的用途。
20.含有權(quán)利要求1至5之一所要求的黑素瘤抑制蛋白質(zhì)，如果需要，還含有藥物上的輔助物質(zhì)，填充劑和/或添加劑的治療組合物。
21.檢測編碼MIA蛋白的核酸的方法，其中待測樣品與選自下組的核酸探針一起溫育a)SEQ ID NO 1和3所示的DNA序列或它們的互補(bǔ)序列，b)與a)中序列之一雜交的核酸該核酸探針與樣品的核酸一同溫育，檢測樣品核酸與核酸探針的雜交，如果需要，經(jīng)過進(jìn)一步的結(jié)合配偶體進(jìn)行檢測。
22.如權(quán)利要求21所要求的方法，其中待測核酸在測定前被擴(kuò)增。
23.產(chǎn)生權(quán)利要求1-5的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟通過同源重組將一個(gè)DNA構(gòu)建體插入到細(xì)胞基因組中而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)編碼這種蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因，所述DNA構(gòu)建體包含一個(gè)在有效地連接到所述基因上時(shí)，能調(diào)節(jié)所述基因表達(dá)的DNA調(diào)節(jié)元件，還含有一個(gè)或多個(gè)同源于這一基因組中的一個(gè)區(qū)的DNA靶片段，該區(qū)在所述基因內(nèi)或緊鄰所述基因；培養(yǎng)細(xì)胞并由細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中收集MIA蛋白。
24.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1至5所要求的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟通過同源重組將一個(gè)DNA構(gòu)建體插入到細(xì)胞的基因組中而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)至少一種編碼這種蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因，所述DNA構(gòu)建體包含一個(gè)在有效地連接到所述基因上時(shí)能調(diào)節(jié)所述基因表達(dá)的DNA調(diào)節(jié)元件，一種編碼所述蛋白質(zhì)的DNA元件且還包含一個(gè)或多個(gè)同源于這一基因組中一個(gè)區(qū)的DNA靶片段；培養(yǎng)細(xì)胞，并由細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中回收MIA蛋白質(zhì)。
25.能通過同源重組被導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中的DNA構(gòu)建體在制備腫瘤治療劑和免疫抑制劑上的用途，所述DNA構(gòu)建體包括一個(gè)在有效地連接到基因上時(shí)能調(diào)節(jié)所述基因表達(dá)的DNA調(diào)節(jié)元件，編碼權(quán)利要求1-5的蛋白質(zhì)的所述基因；和一個(gè)或多個(gè)與這一基因組中一個(gè)區(qū)同源的DNA靶片段，這個(gè)區(qū)在所述基因內(nèi)或緊鄰所述基因；并且其中所述構(gòu)建體能以使調(diào)節(jié)片段有效地與編碼MIA活性蛋白的基因連接的方式插入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中。
26.能通過同源重組導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中的DNA構(gòu)建體的用途，所述構(gòu)建體包括一種在有效地連接到基因上時(shí)能調(diào)節(jié)基因表達(dá)的DNA調(diào)節(jié)元件，編碼權(quán)利要求1至5的蛋白質(zhì)的所述基因，和一個(gè)或多個(gè)同源于該基因組中一個(gè)區(qū)的DNA靶片段，在該區(qū)所述構(gòu)建體的插入是合適的，并且其中所述構(gòu)建體能以使調(diào)節(jié)片段調(diào)節(jié)所述基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的方式插入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所述基因組中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種黑素瘤抑制蛋白質(zhì)、編碼該蛋白質(zhì)的核酸序列，這種蛋白質(zhì)的分離方法及其在制備治療劑上的用途。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1133049SQ94192822
公開日1996年10月9日 申請(qǐng)日期1994年7月19日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月20日
發(fā)明者U·波丹, R·布特納, B·卡盧扎 申請(qǐng)人:曼海姆泊靈格股份公司