人白細(xì)胞介素-2蛋白質(zhì)的制備方法
【專(zhuān)利摘要】一種人白細(xì)胞介素2(IL-2)蛋白質(zhì)的制備方法，通過(guò)在人類(lèi)胚腎細(xì)胞293F細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組人類(lèi)白細(xì)胞介素-2(IL-2)基因進(jìn)行制備，其步驟如下：IL-2基因的克隆、IL-2蛋白表達(dá)篩選、IL-2蛋白質(zhì)純化以及IL-2內(nèi)毒素檢測(cè)。本發(fā)明的方法可以大劑量提純精制其表達(dá)的融合蛋白產(chǎn)物，可進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制且有著非常強(qiáng)的實(shí)用性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】人白細(xì)胞介素-2蛋白質(zhì)的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種白細(xì)胞介素_2蛋白質(zhì)的制備 方法，該方法采用在人類(lèi)胚腎細(xì)胞293F細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組人類(lèi)DNA制備蛋白的技術(shù)，具有通 用性，特別是表達(dá)的質(zhì)粒設(shè)計(jì)。

【背景技術(shù)】
[0002] 人白細(xì)胞介素-2,簡(jiǎn)稱(chēng)人白介素-2,英文簡(jiǎn)稱(chēng)IL-2,又名T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，英文簡(jiǎn) 寫(xiě)為T(mén)CGF。人白介素-2早在1976年就被發(fā)現(xiàn)在激活的淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)液中，人的蛋白序 列的在1983年得以確定，是由153個(gè)氨基酸構(gòu)成，其中含有20的氨基酸的信號(hào)肽在N端。 T淋巴細(xì)胞受到抗原或有絲分裂原的刺激釋放由133個(gè)氨基酸組成的分子量為16kDa的糖 基化白介素-2蛋白，歷經(jīng)三十多年的研究，人白介素_2分子通過(guò)它的受體調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞 的形成和平衡，在腫瘤治療中起著非常關(guān)鍵的作用。目前的蛋白質(zhì)制備，在全球范圍內(nèi)多數(shù) 是把重組人類(lèi)DNA表達(dá)在細(xì)菌內(nèi)，然后從細(xì)菌里制備其表達(dá)的蛋白。其好處是成本低方法 簡(jiǎn)單容易，但缺點(diǎn)是制備的蛋白有諸多方面的缺欠。人類(lèi)蛋白應(yīng)該在人類(lèi)細(xì)胞中制備以符 合人類(lèi)自身的需求，但方法難、產(chǎn)量低一直困擾著人們對(duì)它的渴求，本方法可以大量制備在 人類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)的IL-2人類(lèi)蛋白，可以進(jìn)行質(zhì)量控制，有著極強(qiáng)的實(shí)用性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明突破了重組人類(lèi)DNA在人類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)制備蛋白質(zhì)產(chǎn)量低的技術(shù)瓶頸，提 供了質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和制備方法。通常的方法在1升的培養(yǎng)液中只能制備出不到1毫克的 IL-2蛋白，本發(fā)明可高達(dá)57. 6毫克，方法可行，質(zhì)量可控，實(shí)用性極強(qiáng)。
[0004] 因此，本發(fā)明的目的是提供一種可進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制且有非常強(qiáng)的實(shí)用性的人 白細(xì)胞介素-2蛋白質(zhì)的制備方法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] -種人白細(xì)胞介素-2(IL_2)蛋白質(zhì)的制備方法，包括如下步驟：
[0007] 1)IL_2基因的克隆
[0008] 先通過(guò)PCR擴(kuò)增連接物（KSS)和IL-2片段，然后利用瓊脂糖凝膠回收PCR片段 KSS和IL-2,與pTT5連接、轉(zhuǎn)染到細(xì)菌內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)挑取菌落做PCR，根據(jù)PCR結(jié)果測(cè)序，最后 將正確的PTT5-KSS-IL-2進(jìn)行克隆，提取質(zhì)粒；
[0009] 2) IL-2蛋白質(zhì)表達(dá)篩選
[0010] 先進(jìn)行人類(lèi)胚腎細(xì)胞293F細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定其蛋白在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 293F細(xì)胞中的表達(dá)量，篩選出高表達(dá)的條件，進(jìn)行IL-2蛋白的表達(dá)；
[0011] 3)IL-2蛋白質(zhì)的純化精制
[0012] 對(duì)目標(biāo)IL-2蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化，并對(duì)其進(jìn)行定量分析；
[0013] 4)IL_2內(nèi)毒素檢測(cè)
[0014] 將步驟3)中純化后的IL-2進(jìn)行內(nèi)毒素含量的檢測(cè)。
[0015] 進(jìn)一步地，所述步驟1)中PCR擴(kuò)增KSS片段和IL-2片段所用的引物為：IL-2_1F， 序列如 SEQ ID N0:1 所示，IL-2-1R，序列如 SEQ ID N0:2 所示，IL-2-2F，序列如 SEQ ID N0:3所示，IL-2-2R，序列如SEQ ID N0:4所示以及表達(dá)質(zhì)粒的設(shè)計(jì)中引物為：人工序列 PTT5-KSS-IL-2,序列如 SEQ ID NO :5 所示。
[0016] 進(jìn)一步地，所述步驟1)中所述PCR反應(yīng)條件為：在體系1中98°C預(yù)變性3min后 進(jìn)行98°C變性30s、65°C復(fù)性30s、72°C延伸45s，進(jìn)入體系2中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，72°C 延伸IOmin后保存于16°C。
[0017] 進(jìn)一步地，步驟1)中連接和轉(zhuǎn)化pTT5-KSS-IL-2的步驟是將pTT5、KSS、IL-2、5X Enzyme Buffer以及IOX Enzyme Mix的連接反應(yīng)體系混勻，在室溫下放置30min，將感受態(tài) 細(xì)胞置于冰上溶化后加入8ul連接產(chǎn)物到50ul感受態(tài)細(xì)胞中并輕輕混勻，冰上孵育30min ; 然后在42°C下準(zhǔn)確熱激30s，立刻立即轉(zhuǎn)移至冰上放置2min ;再加入250ul室溫的SOC培 養(yǎng)基，在37°C，200rpm的條件下孵育Ih ;最后取IOOul細(xì)胞均勻涂布于LB平板（100ug/ml Amp)上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，觀察平板上細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
[0018] 進(jìn)一步地，步驟1)中瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌落通過(guò)PCR結(jié)果進(jìn)行顯示，所用引物 為PTT5-F和pTT5-R，所述的PCR反應(yīng)條件為：在體系1中94°C預(yù)變性IOmin后進(jìn)行94°C變 性30s、55°C復(fù)性30s、72°C延伸lmin，進(jìn)入體系2中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，72°C延伸IOmin 后保存于16 C。
[0019] 進(jìn)一步地，所述步驟2)中以最佳IL-2蛋白進(jìn)行表達(dá)的步驟是先對(duì)人類(lèi)胚腎細(xì)胞 293F細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞密度和活率，細(xì)胞活率必須> 90% ;然后將所述的293F細(xì)胞 密度調(diào)整至IX 1〇6,接種到玻璃三角細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；再進(jìn)行細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，具體為分 別取相應(yīng)量的質(zhì)粒與聚乙烯亞胺（PEI)混勻，室溫孵育5min，加入接種293F細(xì)胞的三角細(xì) 胞培養(yǎng)；最后將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在37°C，二氧化碳濃度8%， 搖床轉(zhuǎn)速17〇rpm/min的條件下,培養(yǎng)7天,收細(xì)胞懸液,進(jìn)行蛋白純化。
[0020] 進(jìn)一步地，步驟3)中所述的分離純化步驟是先將層析系統(tǒng)和層析柱處理好，然后 再進(jìn)行層析純化，通過(guò)電泳檢測(cè)純化結(jié)果，純化中的條件為離心樣品速度4700rpm/min，在 4°C條件下離心40min，采用0. 22um濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，上樣流速5ml/min。
[0021] 進(jìn)一步地，步驟4)中所述的內(nèi)毒素檢測(cè)步驟是先取IOOul準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品 用加到去內(nèi)毒素的管中，加 IOOul的鱟試劑到每個(gè)管中，蓋上蓋子，混勻，放入37°C恒溫孵 箱中45min ;然后加 IOOul顯色基質(zhì)到每個(gè)管中，混勻，放入37°C恒溫孵箱中6min ;再加不 同的500ul顏色穩(wěn)定劑到每個(gè)管中，混勻；最后從每個(gè)管中取IOOul液體加到酶標(biāo)板中，用 讀板機(jī)在545nm的波長(zhǎng)下讀板，利用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品內(nèi)毒素含量。
[0022] 由于采用以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果包括：
[0023] 本發(fā)明提供的人白細(xì)胞介素_2蛋白質(zhì)的制備方法是可以在人類(lèi)胚腎細(xì)胞 (HEK293)內(nèi)表達(dá)重組人類(lèi)白細(xì)胞介素-2基因并可以大劑量提純精制其表達(dá)產(chǎn)物（融合蛋 白質(zhì)）的一種方法，其可進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制且有著非常強(qiáng)的實(shí)用性。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為本發(fā)明提供的人白細(xì)胞介素_2蛋白質(zhì)的制備方法中PCR擴(kuò)增KSS和IL-2 片段的結(jié)果顯示圖，其中M表明DNA片段分子量的大小，泳道1-2是KSS的PCR產(chǎn)物，泳道 3為IL-2的PCR產(chǎn)物；
[0025] 圖2為本發(fā)明提供的人白細(xì)胞介素-2蛋白質(zhì)的制備方法中pTT5-KSS-IL-2連接 鑒定的PCR結(jié)果顯示圖，其中M表明DNA片段分子量的大小，泳道1-6為pTT5-KSS-IL-2的 PCR產(chǎn)物；
[0026] 圖3為本發(fā)明提供的人白細(xì)胞介素-2蛋白質(zhì)的制備方法中瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 菌落實(shí)驗(yàn)1#菌液（pTT5-KSS-IL-2#l)測(cè)序比對(duì)結(jié)果；
[0027] 圖4為本發(fā)明提供的人白細(xì)胞介素-2蛋白質(zhì)的制備方法中蛋白在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293F 細(xì)胞中表達(dá)量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)電泳檢測(cè)圖，其中M表示蛋白質(zhì)分子量大小，C是對(duì)照組，泳道左1-6 表示細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液，泳道右1-6表示通過(guò)Nickel濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液，B表 不白蛋白；
[0028] 圖5為本發(fā)明提供的人白細(xì)胞介素-2蛋白質(zhì)的制備方法中IL-2蛋白質(zhì)純化中的 層析圖譜；
[0029] 圖6為本發(fā)明提供的人白細(xì)胞介素 -2蛋白質(zhì)的制備方法中電泳檢測(cè)純化的電泳 檢測(cè)圖，其中M表示蛋白質(zhì)分子量大小，泳道1-14表示從層析柱流出的精制蛋白質(zhì)；
[0030] 圖7為本發(fā)明提供的人白細(xì)胞介素-2蛋白質(zhì)的制備方法中SDS-Page電泳檢測(cè)蛋 白純度的電泳檢測(cè)圖；以及
[0031] 圖8為本發(fā)明提供的人白細(xì)胞介素-2蛋白質(zhì)的制備方法中內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì) 本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用 于限定本發(fā)明。
[0033] 下面通過(guò)具體的實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋。
[0034] 實(shí)施例1 :人白細(xì)胞介素-2(IL_2)目的基因的克隆
[0035] 1)連接物（KSS)、人白細(xì)胞介素-2 (IL-2)片段的擴(kuò)增
[0036] 所用材料如下：
[0037] 引物（生工生物工程（上海）股份有限公司，北京合成部）：
[0038] IL-2-1F，序列如 SEQ ID NO :1 所示，IL-2-1R，序列如 SEQ ID NO :2所示，IL-2-2F， 序列如SEQ ID NO :3所示以及IL-2-2R，序列如SEQ ID NO :4所示
[0039] Phusion* 超保真 PCR Master Mix
[0040] dNTP (2. 5mM) (TaKaRa)
[0041] PCR擴(kuò)增KSS片段的實(shí)驗(yàn)步驟是：先按照反應(yīng)體系，配制PCR反應(yīng)液：PCR混 合液 100ul、H20 64ul、5X HF buffer 20ul、dNTP(2.5mM)6ul、IL-2-lF(10umol)4ul、 IL_2_1R( IOumo I) 4ul、Phus ion 超保真 DNA 聚合酶 Iul、Temp late :KSS_IL_2 (lOOng/ul) Iul, 然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：在體系I中98°C預(yù)變性3min后進(jìn)行98°C變性30s、65°C復(fù) 性30s、72°C延伸45s，進(jìn)入體系2中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，72°C延伸IOmin后保存于16°C;
[0042] PCR擴(kuò)增IL-2片段的實(shí)驗(yàn)步驟是：先按照反應(yīng)體系，配制PCR反應(yīng)液PCR混 合液 IOOul、H2O 64ul、5X HF buffer 20ul、dNTP(2. 5mM)6ul、IL-2-2F(IOumol)4ul、 IL_2_2R( IOumo I) 4ul、Phus ion 超保真 DNA 聚合酶 Iul、Temp late : IL-2 (lOOng/ul) Iul，然后 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：在體系1中98°C預(yù)變性3min后進(jìn)行98°C變性30s、65°C復(fù)性 30s、72°C延伸45s，進(jìn)入體系2中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，72°C延伸IOmin后保存于16°C。
[0043] 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)操作，成功的完成了 KSS片段和IL-2片段的擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0044] 2)瓊脂糖凝膠回收PCR片段KSS、IL-2
[0045] 采用瓊脂糖I*TAE buffer瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收操作，所得瓊脂糖凝膠 回收片段濃度：
[0046] KSS 濃度：15. 2ng/ul OD260/OD280:1. 95
[0047] KSS-IL-2 濃度：6. 8ng/ul OD260/OD280:1. 87
[0048] 3)連接和轉(zhuǎn)染 pTT5-KSS-IL_2
[0049] 所用材料如下：
[0050] 瓊脂糖凝膠回收載體片段pTT5
[0051] 瓊脂糖凝膠回收片段KSS
[0052] 瓊脂糖凝膠回收片段IL-2
[0053] SOC培養(yǎng)基
[0054] LB 平板（Amp)
[0055] (.?1ΞΝ?ΞΛΙΠκ Seamless Cloning and Assembly Kit(Invitrogen)
[0056] 步驟如下：
[0057] 先準(zhǔn)備連接反應(yīng)體系：pTT5 (79. 9ng/ul) I. 50ul、KSS (15. 2ng/ul) 2. 75ul、 IL_2(14.9ng/ul)2.75ul、5X Enzyme Buffer 2.00ul、10X Enzyme Mix I. OOul ;輕輕混勻 上述連接體系，在室溫下放置30min，將One Shot? T0P10感受態(tài)細(xì)胞置于冰上溶化后加入 8ul連接產(chǎn)物到50ul感受態(tài)細(xì)胞中并輕輕混勻，冰上孵育30min ;然后在42°C下準(zhǔn)確熱激 30s，立即轉(zhuǎn)移至冰上放置2min ;再加入250ul室溫的SOC培養(yǎng)基，在37°C，200rpm的條件 下孵育Ih ;最后取IOOul細(xì)胞均勻涂布于LB平板（100ug/ml Amp)上，在37°C培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)過(guò)夜，觀察平板上細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
[0058] 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，平板生長(zhǎng)情況次日可見(jiàn)。
[0059] 4)通過(guò)PCR檢測(cè)連接和轉(zhuǎn)染，并挑取菌落制備質(zhì)粒DNA測(cè)序和克隆
[0060] LB 液體培養(yǎng)基（100ug/ml Amp)
[0061] 引物PTT5-F(生工生物工程（上海）股份有限公司，北京合成部）
[0062] pTT5_R(生工生物工程（上海）股份有限公司，北京合成部）
[0063] 2*Taq MasterMix (北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司）
[0064] 步驟如下：
[0065] 先在每個(gè)平板挑取6個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR，同時(shí)接入I. 5ml環(huán)氧樹(shù)脂（EP)管中， 在37°C，200rpm的條件下培養(yǎng)6h ;然后進(jìn)行菌落PCR，鑒定載體pTT5與DNA片段KSS-IL-2 的連接，其中PCR反應(yīng)體系為：菌落、2*Taq MasterMix 10ul、引物pTT5-F lul、引物pTT5-R lul、ddH20 8ul，反應(yīng)條件為：在體系1中94°C預(yù)變性IOmin后進(jìn)行94°C變性30s、55°C復(fù)性 30s、72°C延伸lmin，進(jìn)入體系2中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，72°C延伸IOmin后保存于16°C。
[0066] 如圖2所述，通過(guò)上述瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌落實(shí)驗(yàn)，PCR結(jié)果1-6顯示載體pTT5 與DNA片段KSS-IL-2全部連接到位。pTT5-KSS-IL-2正確序列如SEQ ID Ν0:5所示。選 取上述pTT5-KSS-IL-2#l菌液進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如圖3所示。
[0067] 5)正確的pTT5-KSS-IL-2進(jìn)行克隆，提取質(zhì)粒
[0068] 在150ml LB液體培養(yǎng)基（100ug/ml Amp)中分別接入pTT5-KSS-IL-2克隆的甘油 菌，在37°C，200rpm條件下過(guò)夜培養(yǎng)；采用PureYield?Plasmid Mindi System試劑盒進(jìn)行 提取質(zhì)粒，所得PTT5-KSS-IL-2濃度為：
[0069] 128. 8ng/ul OD260/OD280:1. 93
[0070] 實(shí)施例2 :IL_2蛋白表汰篩洗
[0071] 1)293F細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
[0072] 所用材料如下：
[0073] 質(zhì)粒樣品經(jīng)0· 22um過(guò)濾器過(guò)濾除菌，用Nanodrop 2000測(cè)定濃度；
[0074] Freestyle 293F 細(xì)胞，Invitrogen，Cat#R790_07 ;
[0075] Freestyle 293F 細(xì)胞表達(dá)培養(yǎng)基，Invitrogen，Cat#2338_〇2 ;
[0076] Polyethylenimine(PEI)，Polysciences，Cat#23966, lmg/ml:將 500mg 的 PEI 粉 末溶于450mL DDH2O中，用HCL將其pH值調(diào)至7. 0,加入DDH2O定容體積至500mL，0. 22um過(guò) 濾器過(guò)濾除菌，分裝成每管10mL，-80°C凍存?zhèn)溆茫?br> [0077] 0· 22um 過(guò)濾器，Sartorius，17597 ;
[0078] 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，NUNU，Cat#，140675 ;
[0079] 二氧化碳培養(yǎng)箱，SANYO, MC0-20AIC，ID# 為 BINC010 ;
[0080] 托盤(pán)搖床，IKA，KS260basic，ID# 為 B0SC015 ;
[0081] pH 計(jì)，梅特勒-托利多，F(xiàn)E20，ID# 為 ΒΡΗΜ001 ;
[0082] Nanodrop 2000, Thermo，ID# 為 ΒΝ0Ρ001。
[0083] 步驟如下：
[0084] 先對(duì)人類(lèi)胚腎細(xì)胞293F細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞密度和活率，細(xì)胞活率必須 彡90% ;然后將293F細(xì)胞密度調(diào)整至IX 107ml，接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，4ml/孔；按下表1 的優(yōu)化方案進(jìn)行細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，具體操作為分別取相應(yīng)量的質(zhì)粒與聚乙烯亞胺（PEI) 混勻，室溫孵育5min，再取相應(yīng)的體積加入到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞 放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，37°C，二氧化碳濃度8%，搖床轉(zhuǎn)速170rpm/min的條件下， 培養(yǎng)7天，收細(xì)胞懸液，待檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)量。
[0085] 表I IL-2蛋白的表達(dá)優(yōu)化條件
[0086]

【權(quán)利要求】
1. 一種人白細(xì)胞介素-2(IL-2)蛋白質(zhì)的制備方法，通過(guò)在人類(lèi)胚腎細(xì)胞293F細(xì)胞內(nèi) 表達(dá)重組人類(lèi)IL-2基因進(jìn)行制備，其特征在于如下步驟： 1. IL-2基因的克隆 先通過(guò)PCR擴(kuò)增連接物（KSS)和IL-2片段，然后利用瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物KSS和 IL-2,將瓊脂糖凝膠回收載體片段（pTT5)與瓊脂糖凝膠回收產(chǎn)物KSS及IL-2連接并轉(zhuǎn)染 入菌，經(jīng)培養(yǎng)挑取菌落做PCR，根據(jù)PCR結(jié)果測(cè)序，最后將正確的pTT5-KSS-IL-2進(jìn)行克隆， 提取質(zhì)粒； 2. IL-2蛋白表達(dá)篩選 先進(jìn)行人類(lèi)胚腎細(xì)胞293F細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定其蛋白在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293F 細(xì)胞中的表達(dá)量，篩選出高表達(dá)的最佳條件，進(jìn)行IL-2蛋白的表達(dá)； 3. IL-2蛋白質(zhì)的純化精制 對(duì)目標(biāo)IL-2蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化，并對(duì)其進(jìn)行定量分析； 4. IL-2內(nèi)毒素檢測(cè) 將步驟（3)中純化后的IL-2進(jìn)行內(nèi)毒素含量的檢測(cè)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人白細(xì)胞介素-2(IL-2)蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，所 述步驟1)中PCR擴(kuò)增KSS片段和IL-2片段所用的引物為：IL-2_1F，序列如SEQ ID NO :1 所示，IL-2-1R，序列如 SEQ ID N0:2 所示，IL-2-2F，序列如 SEQ ID N0:3 所示，IL-2-2R， 序列如SEQ ID N0:4所示以及表達(dá)的質(zhì)粒設(shè)計(jì)中引物為：人工序列pTT5-KSS-IL-2,序列如 SEQ ID NO :5 所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的人白細(xì)胞介素-2(IL-2)蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，所 述步驟1)中所述PCR反應(yīng)條件為：在體系1中98°C預(yù)變性3min后進(jìn)行98°C變性30s、65°C 復(fù)性30s、72°C延伸45s，進(jìn)入體系2中進(jìn)行的30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，72°C延伸lOmin后保存于 16。。。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的人白細(xì)胞介素-2(IL-2)蛋白質(zhì)的制備方法，其特征 在于，步驟1)中連接和轉(zhuǎn)化PTT5-KSS-IL-2的步驟包括：將pTT5、KSS、IL-2、5X Enzyme Buffer以及10X Enzyme Mix的連接反應(yīng)體系混勻，在室溫下放置30min，將感受態(tài)細(xì)胞置 于冰上溶化后加入8ul連接產(chǎn)物到50ul感受態(tài)細(xì)胞中并輕輕混勻，冰上孵育30min ;然后 在42°C下準(zhǔn)確熱激30s，立即轉(zhuǎn)移至冰上放置2min ;再加入250ul室溫的S0C培養(yǎng)基，在 37°C，200rpm的條件下孵育lh ;最后取100ul細(xì)胞均勻涂布于LB平板（100ug/ml Amp)上， 在37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，觀察平板上細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的人白細(xì)胞介素-2(IL-2)蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，步 驟1)中瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌落通過(guò)PCR結(jié)果進(jìn)行顯示，所用引物為pTT5-F和pTT5-R，所 述的PCR反應(yīng)條件為：在體系1中94°C預(yù)變性lOmin后進(jìn)行94°C變性30s、55°C復(fù)性30s、 72°C延伸lmin，進(jìn)入體系2中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，72°C延伸lOmin后保存于16°C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人白細(xì)胞介素-2(IL-2)蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，所 述步驟2)中以最佳IL-2蛋白進(jìn)行表達(dá)的步驟是先對(duì)人類(lèi)胚腎細(xì)胞293F細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì) 算細(xì)胞密度和活率，細(xì)胞活率必須> 90% ;然后將所述的293F細(xì)胞密度調(diào)整至IX 106,接 種到玻璃三角細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；再進(jìn)行細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，具體為分別取相應(yīng)量的質(zhì)粒與 聚乙烯亞胺（PEI)混勻，室溫孵育5min，加入接種293F細(xì)胞的三角細(xì)胞培養(yǎng)；最后將轉(zhuǎn)染 后的細(xì)胞放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在37°C，二氧化碳濃度8%，搖床轉(zhuǎn)速170rpm/min 的條件下，培養(yǎng)7天，收細(xì)胞懸液，進(jìn)行蛋白純化。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人白細(xì)胞介素-2(IL-2)蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，步 驟3)中所述的分離純化步驟是先將層析系統(tǒng)和層析柱處理好，然后再進(jìn)行層析純化，通過(guò) 電泳檢測(cè)純化結(jié)果，純化中的條件為離心樣品速度4700rpm/min，在4°C條件下離心40min， 采用0. 22um濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，上樣流速5ml/min。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人白細(xì)胞介素-2(IL-2)蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于， 步驟4)中所述的內(nèi)毒素檢測(cè)步驟是先取lOOul準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品用加到去內(nèi)毒素的 管中，加lOOul的鱟試劑到每個(gè)管中，蓋上蓋子，混勻，放入37°C恒溫孵箱中45min ;然后加 lOOul顯色基質(zhì)到每個(gè)管中，混勻，放入37°C恒溫孵箱中6min ;再加不同的500ul顏色穩(wěn)定 劑到每個(gè)管中，混勻；最后從每個(gè)管中取lOOul液體加到酶標(biāo)板中，用讀板機(jī)在545nm的波 長(zhǎng)下讀板，利用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品內(nèi)毒素含量。
【文檔編號(hào)】C07K14/55GK104372021SQ201410617823
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月5日
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