一種急性單核細胞白血病相關(guān)抗原mlaa-34 表位多肽及其疫苗和制藥應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明提供的急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽CP701，能夠誘導(dǎo)特異性CTL，在體外對同時表達MLAA-34和HLA-A*0201的腫瘤細胞及負載肽的T2細胞產(chǎn)生確定的特異性殺傷作用，將該表位多肽為CP701應(yīng)用于制備針對急性單核細胞白血病的多肽疫苗，MLAA-34表位肽CP701(236ILDRHNFAI244)、T輔助性表位和弗氏不完全佐劑組成的多肽疫苗能夠抑制荷人單核細胞白血病細胞THP-1的hu-PBL-SCID小鼠瘤體增殖，延長其生存，體內(nèi)可誘導(dǎo)特異性CTL殺傷活性和NK細胞毒活性。
【專利說明】-種急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽及 其疫苗和制藥應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34 表位多肽及其疫苗和制藥應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 急性髓系白血?。╝cutemyeloidleukemia,AML)預(yù)后較差，特別是伴有不良 染色體或分子異常者，主要是由于化療誘導(dǎo)緩解后復(fù)發(fā)率較高。緩解后根除微小殘留 病變（microresidualdisease,MRD)的治療仍具有巨大挑戰(zhàn)。異基因造血干細胞移植 (hematopoieticstemcelltransplantation，HSCT)顯不有效的抗白血病作用，但因其配 型困難、費用昂貴，更重要的是本身存在一些危及生命的并發(fā)癥，如移植物抗宿主?。╣raft versushostdisease,GVHD)，僅適于少部分年輕合適的患者。因此，亟需發(fā)展基于不同抗 白血病機制的新的治療方法。免疫系統(tǒng)擁有特異性殺傷表達特殊抗原細胞的精巧能力，這 種特異性是免疫治療能夠清除腫瘤細胞而不傷害正常細胞的核心。免疫學(xué)新近進展和有價 值的白血病相關(guān)抗原的鑒定使得抗原特異性免疫治療能夠根除化療后白血病MRD，有望改 善AML患者的總生存。
[0003] 急性單核細胞白血病（acutemonocyticleukemia,M5)是AML中較常見的類型， 在我國AML中，M5發(fā)病率僅次于M2,占AML的23. 2% -26. 9%，明顯高于西方國家Beutler E等報導(dǎo)的8%。大多數(shù)M5患者臨床表現(xiàn)為白細胞過多癥、易發(fā)生髓外浸潤（包括肝、脾、 淋巴結(jié)、齒齦、皮膚、眼睛、喉、肺、膀胱、腦脊膜、中樞神經(jīng)系統(tǒng)）、不良染色體核型比例高、完 全緩解（completeremission,CR)率低、易復(fù)發(fā)、預(yù)后不佳。M5的異質(zhì)性和復(fù)雜性決定其 尚缺乏分子診斷和靶向治療的特異性腫瘤相關(guān)標志物。
[0004] 急性單核細胞白血病相關(guān)抗原-34(monocyticleukemiaassociated antigen-34,MLAA-34)是發(fā)明人的研究課題組利用"重組cDNA表達文庫血清學(xué)分析法 (serologicalidentificationofantigensbyrecombinantexpressioncloning, SEREX) "對人單核細胞白血病細胞株篩選的具有代表性的新抗原。后利用5'和3'-cDNA 末端快速擴增（rapidamplicationofcDNAends，RACE)技術(shù)擴增獲得MLAA-34的全長 cDNA序列，序列編號為：ΑΥ288977· 2。用NCBI網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov)的開放讀碼框 Finder軟件分析，發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因可能定位于人染色體13ql4. 2 ;是功能未知的I丐結(jié)合蛋 白樣39(calciumbingingprotein39-like，CAB39L)基因的一個新的轉(zhuǎn)錄剪接變體。應(yīng) 用RNAi技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因是和急性單核細胞白血病發(fā)生相關(guān)的新的抗凋亡分子， 慢病毒介導(dǎo)的過表達MLAA-34的U937細胞可顯著抑制細胞凋亡，并增加潛在的致瘤性。免 疫共沉淀，鳥槍法測序和生物信息學(xué)分析示71種蛋白質(zhì)涉及細胞凋亡或增殖的生物過程 和信號通路。到目前為止，我們已應(yīng)用SYBRGreenI熒光染料法的實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多 聚酶鏈反應(yīng)（reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)及Western blot技術(shù)對M5、非M5白血病骨髓原始細胞及正常健康的外周血單個核細胞（peripheral bloodmononuclearcells，PBMCs)中表達情況進行了檢測，發(fā)現(xiàn)：MLAA_34基因的mRNA及 蛋白水平在AML-M5型白血病細胞中都是特異性高表達的，而在非M5患者和健康對照中低 表表或不表達。
[0005] 近年來，來源于白血病相關(guān)抗原的多肽疫苗已進行了臨床實驗，AML多肽疫苗有 WTl多肽疫苗、RHAMM多肽疫苗等，這些多肽疫苗對AML主動免疫治療有一定療效，但對M5 患者是否為特異有效的疫苗，未行單獨研究。目前尚未見有應(yīng)用MLAA-34多肽疫苗免疫治 療急性單核細胞白血病的報道。
[0006] 多肽疫苗是按照病原體/腫瘤抗原基因中已知或預(yù)測的某段抗原表位的氨基酸 序列,通過化學(xué)合成技術(shù)制備的疫苗。腫瘤多肽疫苗具有如下優(yōu)點：如抗原肽直接刺激產(chǎn) 生特異性免疫反應(yīng)而不會誘發(fā)自身免疫反應(yīng)或免疫抑制；生產(chǎn)過程簡單快速價格低廉，相 對易于規(guī)模化生產(chǎn)；無致癌性，安全。單一多肽疫苗的最大弱點是免疫原性差，多肽在體內(nèi) 易被肽酶降解，所誘導(dǎo)的CTL不易突破使腫瘤消退所需的閾值。如WTl表位肽疫苗雖然在 臨床試驗中初見成效，但由于目前的研究者往往是采用單一CTL表位的肽、分子量小易于 被蛋白水解酶降解，只能激發(fā)低水平的免疫應(yīng)答，通過聯(lián)合多個CTL表位、增加Th表位、使 用免疫佐劑、構(gòu)建多表位肽和融合肽等方法可提高多肽的免疫原性。
[0007]Th表位在體內(nèi)可以激活⑶4+的T細胞，⑶4+T細胞在激發(fā)和維持免疫治療起著重 要作用，故在表位肽疫苗中添加Th表位成為提高表位疫苗免疫原性和增強T細胞反應(yīng)的一 個有的途徑。Th表位亦可激活CD4+的CTLs而直接殺死腫瘤細胞。佐劑本身雖不能有效的 引起抗腫瘤免疫反應(yīng)，但可增強非特異性免疫應(yīng)答，參與淋巴細胞增殖與分化，而且可以保 護表位肽不易被蛋白酶降解。常用的佐劑有粒巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)、IL-2、熱 休克蛋白和弗氏不完全佐劑（incompleteFreund'sadjuvant，IFA)等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽及 其疫苗和制藥應(yīng)用，經(jīng)動物實驗驗證該多肽疫苗具有抗急性單核細胞白血病的效應(yīng)。
[0009] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0010] 一種急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽，該表位多肽為CP701，其氨 基酸序列如SEQ.ID.NO. 1所示。
[0011] 一種急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽疫苗，該多肽疫苗含有一個 CP701表位多肽和一個用于增強疫苗免疫原性的T細胞輔助表位多肽。
[0012] 所述的用于增強疫苗免疫原性的T細胞輔助表位多肽為破傷風(fēng)類毒素 tt830-843,其氨基酸序列如SEQ.ID.NO. 2所示。
[0013] 所述多肽疫苗中還添加用于增強疫苗免疫原性的弗氏不完全佐劑。
[0014] 急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽在制備針對急性單核細胞白血 病的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 所述的藥物為抑制人急性單核細胞白血病THP-I增殖的藥物。
[0016] 所述的藥物為誘導(dǎo)特異性CTL殺傷活性和NK細胞毒活性的藥物。
[0017] 所述的藥物為刺激⑶3+⑶8+T淋巴細胞增殖的藥物。
[0018] 所述的藥物為刺激T細胞分泌IFN-Y和IL-2的藥物。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0020] 本發(fā)明提供的急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽CP701，能夠誘導(dǎo) 特異性CTL，在體外對同時表達MLAA-34和HLA-A*0201的腫瘤細胞及負載CP701多肽的T2 細胞產(chǎn)生確定的特異性殺傷作用，是有效的MLAA-34抗原HLA-A*0201限制性CTL表位。
[0021] 一種急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽疫苗，含有MLAA-34表位肽 cp7〇i(236Ildrhnfai244)、τ輔助性表位和弗氏不完全佐劑組成的多肽疫苗能夠抑制荷人單 核細胞白血病細胞THP-I的人外周血淋巴細胞免疫重建重癥聯(lián)合免疫缺陷（hu-PBL-SCID) 小鼠瘤體增殖，延長其生存，體內(nèi)可誘導(dǎo)特異性CTL殺傷活性和NK細胞毒活性。通過一系 列的體內(nèi)動物實驗證實其具備的抗急性單核細胞白血病效應(yīng)：
[0022] 1、mlaa-34cp7〇i(236Ildrhnfai244)多肽疫苗對荷瘤小鼠腫瘤生長有明顯的抑制 作用，使腫瘤THP-I細胞明顯減少，白血病細胞大量變性壞死；
[0023] 2、MLAA-34多肽疫苗可延長荷THP-I白血病細胞hu-PBL-SCID鼠生存。MLAA-34 多肽疫苗組荷瘤小鼠的平均生存時間顯著長于WTl多肽疫苗組、滅活的THP-I細胞瘤苗組、 T輔助多肽疫苗組及對照組荷瘤小鼠的平均生存時間；
[0024] 3、MLAA-34多肽疫苗治療組脾細胞在不同效靶比對THP-I細胞CTL特異性和NK細 胞非特異性的殺傷效率均明顯高于空白對照組、WTl多肽疫苗組、T輔助多肽疫苗組及滅活 的THP-I瘤苗組，隨著效靶比增高，殺傷效率明顯增高。MLAA-34多肽疫苗治療組脾細胞對 在不同效靶比對THP-I細胞特異性CTL和NK細胞非特異性的殺傷效率均明顯高于人單核 細胞白血病細胞U937、人乳腺癌細胞MCF-7和人肺腺癌細胞A549 ;
[0025] 4、MLAA-34多肽疫苗治療組CD3+CD8+T細胞的比例顯著高于其他組別，而Treg細 胞的比例顯著低于其他組別。MLAA-34多肽疫苗治療組MLAA-34合成肽刺激的T細胞分泌 IFN-γ和IL-2明顯增高，與對照組相比有顯著差異，其余各組與對照組比亦有一定差異， 但IFN-γ和IL-2分泌量明顯低于MLAA-34多肽疫苗治療組。檢測IL-10和IL-4結(jié)果顯 示，MLAA-34多肽疫苗治療組MLAA-34合成肽刺激的T細胞分泌IL-10和IL-4顯著低于其 他各組。
[0026] 通過作用機制研究表明，本發(fā)明的表位多肽為CP701能夠有效應(yīng)用于制備針對急 性單核細胞白血病的藥物，為M5型急性髓系白血病的治療開辟了新的研究方向。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為各實驗組與對照組的HE染色病理切片照片；其中，（a)為對照組移植瘤 組織病理切片；(b)為T輔助肽疫苗治療組移植瘤組織病理切片；（c)為滅活的THP-I細 胞瘤苗組移植瘤組織病理切片；（d)為WTl多肽疫苗治療組移植瘤組織病理切片；（e)為 MLAA-34多肽疫苗治療組移植瘤組織病理切片；
[0028] 圖2為不同疫苗治療組小鼠的生存時間比較圖；
[0029] 圖3為不同疫苗治療組小鼠的Kaplan-Meier生存分析圖；
[0030] 圖4為不同疫苗對THP-I細胞（HLA-A^ZOllLAASf)的CTL殺傷活性測定圖；
[0031] 圖5為CP701多肽疫苗對不同細胞的CTL毒性測定圖；
[0032] 圖6為不同疫苗對THP-I細胞（HLA-A^ZOllLAASf)的NK細胞毒活性測定圖；
[0033]圖7為CP701多肽疫苗對不同細胞的NK細胞毒活性測定圖；
[0034] 圖8為不同免疫治療組荷瘤hu-PBL-SCID鼠外周血中CD3+CD4+T細胞測定圖；其 中，（a)為對照組；(b)為WTl多肽疫苗組；（c)為T輔助肽疫苗組；（d)為MLAA-34多肽疫 苗組；（e)為滅活的THP-I細胞瘤苗組；
[0035] 圖9為不同免疫治療組荷瘤hu-PBL-SCID鼠外周血中CD3+CD8+T細胞測定圖；其 中，（a)為對照組；(b)為WTl多肽疫苗組；（c)為T輔助肽疫苗組；（d)為MLAA-34多肽疫 苗組；（e)為滅活的THP-I細胞瘤苗組；
[0036] 圖10為不同免疫治療組荷瘤hu-PBL-SCID鼠外周血中Treg細胞測定圖；其中， (a)為對照組；(b)為WTl多肽疫苗組；（c)為T輔助肽疫苗組；(d)為MLAA-34多肽疫苗組； (e)為滅活的THP-I細胞瘤苗組；
[0037]圖 11 為外周血中IFNi、IL-2、IL-10、IL-4 的檢測圖；其中，（a)為IFNi;(b) 為IL-2 ; (c)為IL-10 ; (d)為IL-4 ;
[0038] 圖12為不同疫苗治療組瘤體的大體標本照片。

【具體實施方式】
[0039] 下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0040] 本發(fā)明提供了一種急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽，為CP701 CTL表位肽九肽，其氨基酸序列為236Ildrhnfai244 (如seq.id.no. 1所示），分子量為 1098. 8Da〇
[0041] 本發(fā)明提供了一種新的抗急性單核細胞白血病多肽疫苗，給出了該多肽疫苗的 制備方法，且通過動物實驗證實此多肽疫苗抗急性單核細胞白血病的療效。該多肽疫苗的 組成為MLAA-34CP701多肽（50μg) +通用性T輔助細胞表位（T)(破傷風(fēng)內(nèi)毒素）（50μg) + 弗氏不完全佐劑（incompletefreund'sadjuvant，IFA) (ImL)。
[0042] 其中，急性單核細胞白血病抗原MLAA-34CP701CTL表位肽為九肽，氨基酸序列 為236ildrhnfai244,分子量為1098.8Da，τ輔助細胞表位為破傷風(fēng)類毒素（tt83〇-843)，氨基 酸序列為QYIKANSKFIGITE。根據(jù)設(shè)計的序列人工來合成，具體的委托上海強耀生物科技有 限公司利用多肽合成儀合成這2條多肽，采用半自動固相多肽方法合成，多肽的純化和純 度分析采用RP-HPLC(美國Waters公司）方法，用電噴霧質(zhì)譜（electrosprayionization massspectrometers，ESI_MS)串聯(lián)質(zhì)譜（美國PE公司）測定其分子量并進行鑒定。MLAA-34 CP701多肽與T輔助細胞表位肽純度均達到95%以上。合成的多肽凍干粉，以10μmol/L 的濃度溶于DMSO中，置于-20°C條件下備用。
[0043] 前期采用生物信息學(xué)預(yù)測、半自動固相多肽方法合成MLAA-34表位肽，經(jīng)典 肽-MHC結(jié)合力實驗顯示mlaa-34表位肽cp7〇i(236Ildrhnfai244)與hla-a*〇2〇i具有很強的 親和力，且體外實驗顯示mlaa-34表位肽cp7〇i(236Ildrhnfai244)可以誘導(dǎo)特異性ctl，對同 時表達MLAA-34和HLA-A*0201的腫瘤細胞及負載CP701多肽的T2細胞產(chǎn)生確定的特異性 殺傷作用，這些結(jié)果提示cp7〇i(236Ildrhnfai244)是有效的mlaa-34抗原h(huán)la-a*〇2〇i限制性 CTL表位。
[0044] 本發(fā)明公開了急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽在制備針對急性 單核細胞白血病的藥物中的應(yīng)用，該藥物為生物基因工程抗體藥物。
[0045] 本發(fā)明的MLAA-34多肽疫苗體內(nèi)抗白血病療效的測定：
[0046]一、制備疫苗
[0047]1、多肽疫苗：臨用前配制。
[0048] 多肽治療組疫苗組成為多肽（50μg)+通用性T輔助細胞表位（T)(破傷風(fēng)內(nèi)毒 素）（50Ug) +弗氏不完全佐劑（incompletefreund'sadjuvant，IFA);
[0049]WTl多肽疫苗組即為WTl多肽（126RMFPNAPYL134, 50yg)+T(50yg)+IFA，T輔助多肽 疫苗組為T(50μg)+IFA;
[0050] 空白組為IAF。
[0051] 抗原與IFA佐劑按100μg:ImL完全乳化后注射給小鼠。
[0052] 2、滅活的THP-I細胞瘤苗制備：取對數(shù)生長良好的THP-I細胞，加入絲裂霉素C終 濃度為20mg/mL滅活THP-I細胞，37°C作用30min后，以2000轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清液， PBS洗2遍，調(diào)細胞數(shù)IXIOfVmL于PBS中，加入IFA，二者的體積比例是1 :1。
[0053] 二、動物模型的建立
[0054] 以HLA-A*0201陽性人外周血淋巴細胞重建SCID小鼠免疫系統(tǒng)24h后，皮下接種 THP-I細胞，建立人免疫重建的荷瘤SCID小鼠模型；
[0055] 1、人外周血淋巴細胞分離
[0056] (1)健康人的濃縮白細胞懸液購自西安市中心血站，HLA-A*0201抗體標注后采用 流式細胞儀檢測，以HLA-A*0201陽性者作為研究對象。
[0057] (2)在IOmL離心管中加入5mL淋巴細胞分離液，取健康女性志愿者肝素抗凝靜脈 血5mL，用滴管沿管壁緩慢疊加于淋巴細胞分離液液面上，保持清楚的界面，2000rpm水平 離心20min。
[0058] (3)離心后管內(nèi)分為三層，上層為血清，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴 細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞（包括淋巴細胞和單核細胞）為主的白色 云霧層即白膜層。
[0059] (4)用毛細吸管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一I. 5mL離心管中，加入PBS 液，1200rpm離心5min，洗漆細胞兩次。
[0060] (5)末次離心后，棄上清，加入ImLPBS液重懸細胞。取一滴細胞懸液于細胞計數(shù)板 上，計數(shù)四個大方格內(nèi)的細胞總數(shù)。
[0061]單個核細胞濃度（細胞數(shù)/ImL細胞懸液）=4個大方格內(nèi)細胞總數(shù)/4XIO4
[0062](6)用淋巴細胞分離液常規(guī)分離后用PBS重懸細胞并調(diào)細胞密度為8X107/mL。
[0063] 2、選擇合格C.B17/SCID純系小鼠（已用ELISA方法測定鼠IgG<1μg/mL)，6-8 周齡，雌性，用anti-asialoGMl封閉NK細胞活性后進行人外周血淋巴細胞的免疫重建。
[0064] 第-Id:每只SCID小鼠腹腔注射20μIanti-asialoGMl以封閉NK細胞活性，并 行X線亞致死量照射（3Gy，X線電離箱M-150WE)。
[0065] 第Od:免疫重建：腹腔注射0. 5mL外周血淋巴細胞（濃度為8XIOVmL)。
[0066] 第Id:免疫重建24h后每只hu-PBL-SCID鼠皮下接種體外培養(yǎng)的對數(shù)生長期 THP-I細胞（濃度為IXIO7個/mlPBS)，每只左右腋窩和背部共3點，每點接種量為0. 2ml。
[0067] 3、實驗分組，選擇無免疫滲漏SCIID鼠45只，隨機分為5組。
[0068] 第一組9只，空白組：疫苗成份僅為弗氏不完全佐劑；
[0069] 第二組9只，WTl多肽疫苗組：疫苗成份為WTl多肽+通用性T輔助細胞表位（破 傷風(fēng)內(nèi)毒素）+弗氏不完全佐劑；
[0070] 第三組9只，T輔助多肽疫苗組：疫苗成份為通用性T輔助細胞表位（破傷風(fēng)內(nèi)毒 素）+弗氏不完全佐劑；
[0071] 第四組9只，MLAA-34多肽疫苗治療組：疫苗成份為前面優(yōu)選的MLAA-34多肽 (cp7〇i，236Ildrhnfai244) +通用性τ輔助細胞表位（破傷風(fēng)內(nèi)毒素）+弗氏不完全佐劑；
[0072] 第五組：9只，滅活的THP-I細胞瘤苗組：疫苗成份為滅活的THP-I細胞瘤苗。
[0073] 4.接種疫苗
[0074] 當(dāng)腫瘤體積約為100_120mm3時，三次于背部皮下接種疫苗，每次接種間隔一周。免 疫治療結(jié)束第14d，處死SCID鼠，各組分別隨機留6只觀察自然生存時間。
[0075] 5.HLA_A*0201 檢測
[0076]SCID小鼠HLA_A*0201陽性人外周血淋巴細胞免疫重建2周后采集小鼠外周血，淋 巴細胞分離液常規(guī)分離后獲得淋巴細胞，用人HLA-A*0201單克隆抗體標記后，流式細胞儀 測定顯示小鼠外周血淋巴細胞中人HLA-A*0201陽性的淋巴細胞占95%，提示SCID小鼠免 疫重建成功，且小鼠體內(nèi)的人淋巴細胞的HLA型別為HLA-A*0201。
[0077] 6.血清中人IgG的測定
[0078] 處死SCID鼠前，經(jīng)眼球采集未抗凝血液，用ELISA法測定人IgG。
[0079] (1)血標本裝離心管，離心，37°C，1500rpmX20min，分離得到血清，-80°C保存，所 有標本同時檢測；
[0080] (2)取出酶標板，依照次序?qū)?yīng)分別加?οομ1的標準品與質(zhì)控品于空白微孔中；
[0081] (3)分別標記樣品編號，加100μ1樣品于空白微孔中；
[0082] (4)每孔加入50μ1的酶標記溶液，18-25°C孵育反應(yīng)90min;
[0083] (5)洗板機清洗5次，每次靜置10-20s;
[0084] (6)每孔加入底物A、B液各50μ1，18-25°C避光孵育反應(yīng)15min;
[0085] (7)每孔加入50μ1終止液，終止反應(yīng)；
[0086] (8)在酶標儀上讀取各孔的OD值，波長為450nm。
[0087] 人外周血淋巴細胞（PBL)腹腔注射2周后，ELISA法在小鼠血清中便能檢測到 人IgG。第4周不同組別小鼠血清人IgG水平：空白對照組（3. 84±0. 20mg/mL)，WTl多肽 疫苗組（8. 42±0· 28mg/mL)，T輔助肽疫苗組（6. 36±0· 35mg/mL)，MLAA-34多肽疫苗組 (17. 20±2· 21mg/mL)，滅活的THP-I細胞瘤苗組（4. 66±0· 30mg/mL)。移植第6周空白對照 組小鼠血清人IgG水平為6. 18±0· 36mg/mL，而MLAA-34多肽疫苗組為37. 31±4· 68mg/mL， 顯著增高（P〈〇. 01)。第8周MLAA-34多肽疫苗組小鼠血清人IgG水平為76. 18±8. 36mg/ mL，呈逐漸升高趨勢。
[0088] 三、療效觀察
[0089] 皮下接種THP-I細胞后每3天測量免疫治療后SCID小鼠瘤體體積，瘤體體積（mm3) =瘤體長度X(瘤體寬度）2Χπ/6。免疫治療后第14d,各組隨機取SCID小鼠三只，處死 后，取瘤體組織進行常規(guī)固定、石蠟包埋及切片，觀察腫瘤病理改變（HE染色）。觀察模型小 鼠生存期，確定多肽疫苗的體內(nèi)作用效果。
[0090] 參見圖12,免疫治療2周后瘤體大小分別為：對照組（11. 06±5. 64cm3)，T輔助 肽疫苗組（7. 28±2. 21cm3)，滅活的THP-I細胞瘤苗組（6.82±I. 70cm3)，WTl多肽疫苗組 (3. 03±0· 33cm3)，MLAA-34 多肽疫苗組（1. 39±0· 36cm3)。由此可見，MLAA-34 多肽疫苗對 荷瘤小鼠腫瘤有明顯的生長抑制作用（P= 〇. 002)，腫瘤生長緩慢，而對照組和單純T輔助 肽疫苗組、滅活的THP-I細胞瘤苗組腫瘤呈進行性生長。與對照組相比，WTl多肽疫苗對腫 瘤亦有顯著的抑制作用（P= 0. 006)，由此可見MLAA-34多肽疫苗可抑制荷THP-I白血病細 胞hu-PBL-SCID鼠瘤體生長。
[0091] 參見圖1，（a)?（e)的各個實驗分組HE染色的病理切片，對照組HE病理切片中 可見大量白血病細胞，生長明顯活躍，大小均勻，形態(tài)一致，輪廓清晰，細胞胞膜完整，胞核 較大，染色深藍。與對照組相比，T輔助肽疫苗治療組THP-I細胞形態(tài)無變化；滅活的THP-I 細胞瘤苗組可見小部分THP-I細胞死亡，胞膜破損，大小不一，輪廓模糊；WTl多肽疫苗組多 數(shù)細胞形態(tài)不規(guī)則，胞膜破損，細胞核皺縮，多數(shù)白血病細胞變性壞死；MLAA-34多肽疫苗 組腫瘤切片中THP-I細胞明顯減少，細胞輪廓模糊，胞膜破損，核固縮碎裂，白血病細胞大 量變性壞死。
[0092] 參見圖2,觀察小鼠的生存期，結(jié)果顯示，對照組荷瘤小鼠平均生存時間為 48.5〇±4.89d;MLAA-34cp7〇i(236Ildrhnfai244)多肽疫苗治療組和WTi多肽疫苗組荷瘤 小鼠平均生存時間分別為88. 33 ± 1. 63d和66. 17 ± 3. 06d，T輔助多肽疫苗組和滅活的 THP-I細胞瘤苗組荷瘤小鼠平均生存時間分別為52. 50±3. 02d和54. 34±3. 14d。MLAA-34 cp7〇i(236Ildrhnfai244)多肽疫苗治療組、WTi多肽疫苗組和滅活的THP-i細胞瘤苗組荷瘤 小鼠的平均生存時間顯著長于對照組（P〈〇. 01，P〈〇. 01，P= 〇. 034)，而T輔助多肽疫苗組 荷瘤小鼠的平均生存時間與對照組相比，無顯著性差異（P= 0. 119)。T輔助多肽疫苗組和 滅活的THP-I細胞瘤苗組荷瘤小鼠的平均生存時間相比，亦無顯著性差異（P= 0. 334)，而 這兩組與mlaa-34cp7〇i(236Ildrhnfai244)多肽疫苗組和WTi多肽疫苗組相比，具有顯著性 差異（ρ〈0·01，ρ〈0·01，ρ〈0·01，ρ〈0·01)。MLAA-34CP701 (236ILDRHNFAI244)多肽疫苗組荷瘤 小鼠的平均生存時間長于WTl多肽疫苗組（p〈0. 01)。
[0093] 參見圖3,采用Kaplan-Meier進行生存分析，結(jié)果顯示與對照組相比，MLAA-34 cp7〇i(236Ildrhnfai244)多肽疫苗可顯著改善THP-i荷瘤小鼠的生存（ρ〈ο.οι)。WTi多肽疫 苗和滅活的THP-I細胞瘤苗亦改善了THP-I荷瘤小鼠的生存（P= 0. 01，P= 0. 007)，而單純 T輔助多肽疫苗未能明顯改善THP-I荷瘤小鼠的長期生存（P= 0. 055)，由此可見，MLAA-34 多肽疫苗可延長荷THP-I白血病細胞hu-PBL-SCID鼠生存。
[0094] 四、作用機制研究
[0095] 疫苗注射后，檢測白血病小鼠CTL活性和NK細胞毒活性、外周血T細胞亞群和 Treg細胞、外周血中IFN-Y、IL-2、IL-10、IL-4的變化，以確定不同疫苗的作用效果和作用 機制。
[0096]I、CTL活性和NK細胞毒活性測定
[0097] 1)白血病模型小鼠予以疫苗注射結(jié)束后14d時，檢測其特異性CTL殺傷活性及NK 細胞毒活性；
[0098] 2)CTL活性測定
[0099] 效應(yīng)細胞制備：無菌條件下取各實驗及對照組小鼠的脾細胞制備單細胞懸液，用 RPMI1640培養(yǎng)液（含10%FCS)調(diào)整細胞濃度至5X106/mL，3mL/孔接種至6孔板培養(yǎng)。力口 入mlaa-34 多肽cp7〇i(236Ildrhnfai244)，5〇μg/ 孔。培養(yǎng)基中加入重組人il-2 2〇u/mL(每 三天補充一次）。培養(yǎng)5d后，IOOOrpm離心5min，收集細胞，并計數(shù)，即為效應(yīng)細胞。
[0100]靶細胞制備：收集對數(shù)生長期THP-I細胞（HLA-A21LAA-34+)、人單核細胞 系U937 (HLA-A211LAA-34+)、人乳腺癌細胞MCF-7 (HLA-A2+MLAA-340 和人肺腺癌細胞 A549 (HLA-A211LAA-34〇，用含 5%FCS的RPMI1640 培養(yǎng)液調(diào)整靶細胞濃度至IX105/mL。
[0101] 效/靶細胞共培養(yǎng)：按不同效靶比例（50 :1、25 :1、12· 5 :1和6. 25 :1)加效應(yīng)細胞 和靶細胞各50μL于96孔培養(yǎng)板（3孔重復(fù)），培養(yǎng)4h，用乳酸脫氫酶法測定CTL活性。
[0102] 3)NK細胞毒活性測定
[0103] 無菌條件下取小鼠脾臟，制備單細胞懸液作為效應(yīng)細胞。收集對數(shù)生長期 THP-I細胞（HLA-A21LAA-34+)、人單核細胞系U937 (HLA-A2-MLAA-34+)、人乳腺癌細胞 MCF-7 (HlA-AZ+MLAA-SO和人肺腺癌細胞A549 (HLA-A2-MLAA-34-)，用含 5 %FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至4XIO5AiL,即為靶細胞。其余操作步驟同CTL活性測定。
[0104] 參見圖4?7,體外CTL殺傷活性結(jié)果：mlaa-34cp7〇i(236Ildrhnfai244)多肽疫 苗治療組脾細胞在不同效靶比對THP-I細胞（HLA-A2+MLAA34+)特異性CTL和NK細胞的殺 傷效率均明顯高于空白對照組、WTl多肽疫苗組、T輔助多肽疫苗組及滅活的THP-I細胞 瘤苗組（ρ〈〇· 〇5)，隨著效靶比增高，殺傷效率明顯增高。mlaa-34cp7〇i(236Ildrhnfai244) 多肽疫苗治療組脾細胞對在不同效靶比對THP-1細胞（HLA-A21LAA34+)特異性CTL和 NK細胞的殺傷效率均明顯高于人單核細胞系U937 (HLA-A2_MLAA-34+)、人乳腺癌細胞 MCF-7 (HLA-A21LAA-340 和人肺腺癌細胞Α549 (HLA-A2TMLAA-34〇 (ρ〈0. 05)。這些體內(nèi) 實驗結(jié)果提示mlaa-34cp7〇i(236Ildrhnfai244)多肽疫苗誘導(dǎo)的CTL特異殺傷作用具有 MHC(HLA-A*0201)和MLAA-34表位雙重限制性。
[0105] 2、外周血中T細胞亞群及Treg細胞的檢測
[0106] 白血病模型小鼠予以疫苗注射結(jié)束后14d時，眼球取血。T細胞亞群的測定，取肝 素鈉抗凝全血50μ1加入10μIPerCp-⑶3/FITC-⑶4/PE-⑶8三聯(lián)抗體，4°C下避光孵育 30min，溶血并洗滌后用FACS檢測，并采用BDFACSDiva軟件分析數(shù)據(jù)，以分析⑶4+、⑶8+T細 胞的變化。以⑶4、⑶25單抗標記細胞，用FACS檢測Treg細胞的變化。
[0107] 參見圖8?10,檢測不同免疫治療組別中⑶3+CD4+T細胞比例：對照組（13. 2%)， WTl多肽疫苗組（21. 7% ) ;T輔助肽疫苗組（23. 8% ) ,MLAA-34多肽疫苗治療組（25. 4% )， 滅活的THP-I細胞瘤苗組（16. 3% )，MLAA-34多肽疫苗治療組⑶3+⑶4+T細胞比例顯著 高于對照組（P〈〇. 05)，比其他組別升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；⑶3+⑶8+T細胞比例：對照組 (15. 7% )，WTl多肽疫苗組（18. 3% ) ;T輔助肽疫苗組（16. 5% )，MLAA-34多肽疫苗治療 組（58. 7% )，滅活的THP-I細胞瘤苗組（17. 1% )。MLAA-34多肽疫苗治療組⑶3+⑶8+T細 胞的比例顯著高于其他組別（P〈〇. 05)。Treg細胞的比例：對照組（45. 2% )，WTl多肽疫 苗組（37. 7% ) ;T輔助肽疫苗組（40.6% )，MLAA-34多肽疫苗治療組（16.4% )，滅活的 THP-I細胞瘤苗組（41. 7 % )。MLAA-34多肽疫苗治療組Treg細胞的比例顯著低于其他組 別（ρ〈0· 05)。
[0108] 3、外周血中IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4 的檢測
[0109] 白血病模型小鼠予以疫苗注射結(jié)束后14d時，眼球取血。應(yīng)用ELISA方法，分別檢 測血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-IO的水平。
[oho]檢測IFN-γ結(jié)果顯示，參見圖li，mlaa-34cp7〇i(236Ildrhnfai244)多肽疫苗 治療組MLAA-34合成肽刺激的T細胞分泌IFN-γ明顯增高，與對照組相比有顯著差 異（p〈0. 05)，其余各組與對照組比亦有一定差異，但IFN-γ分泌量明顯低于MLAA-34 cp7〇i(236Ildrhnfai244)多肽疫苗治療組（p〈o. 〇5)。檢測il-2 結(jié)果顯示，mlaa-34 CP701 (236Ildrhnfai244)多肽疫苗治療組MLAA-34合成肽刺激的τ細胞分泌IL-2顯著高于 其他各組（ρ〈〇·〇5)。檢測iL-io和il-4 結(jié)果顯示，mlaa-34cp7〇i(236Ildrhnfai244)多肽 疫苗治療組MLAA-34合成肽刺激的T細胞分泌IL-10和IL-4顯著低于其他各組（ρ〈0. 05)。 上述結(jié)果提示MLAA-34多肽可誘導(dǎo)Thl和Th2活化，Thl型細胞因子水平顯著增加，Th2型 細胞因子水平下降，可以誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答逐漸向Thl方向發(fā)展，誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。
【權(quán)利要求】
1. 一種急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽，其特征在于，該表位多肽為 CP701，其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
2. -種急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽疫苗，其特征在于，該多肽疫 苗含有一個CP701表位多肽和一個用于增強疫苗免疫原性的T細胞輔助表位多肽。
3. 如權(quán)利要求2所述的一種急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽疫 苗，其特征在于，所述的用于增強疫苗免疫原性的T細胞輔助表位多肽為破傷風(fēng)類毒素 tt830-843,其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
4. 如權(quán)利要求2或3所述的一種急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽疫 苗，其特征在于，所述多肽疫苗中還添加用于增強疫苗免疫原性的弗氏不完全佐劑。
5. 權(quán)利要求1所述的急性單核細胞白血病相關(guān)抗原MLAA-34表位多肽在制備針對急性 單核細胞白血病的藥物中的應(yīng)用。
6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為抑制人急性單核細胞白血病 THP-1增殖的藥物。
7. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為誘導(dǎo)特異性CTL殺傷活性和 NK細胞毒活性的藥物。
8. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為刺激CD3+CD8+T淋巴細胞增殖 的藥物。
9. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為刺激T細胞分泌IFN-γ和 IL-2的藥物。
【文檔編號】C07K7/08GK104262459SQ201410452959
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】白菊, 何愛麗, 張王剛, 王劍利, 楊云, 賀軍濤 申請人:西安交通大學(xué)