一種蝦致敏蛋白pena1提取純化方法
【專利摘要】一種蝦致敏蛋白pena1提取純化方法,屬于蛋白分離純化方法的【技術(shù)領(lǐng)域】。其包括以下工藝步驟:1)制備蝦肉丙酮粉;2)抽提蝦過敏蛋白;3)硫酸銨分級沉淀;4)等電點(diǎn)沉淀;5)DEAE52陰離子交換層析;6)SephadexG-100凝膠層析;7)免疫親和層析。本發(fā)明首次采用致敏蛋白的表位抗體制備免疫親和柱來純化致敏蛋白,該方法對于表位序列已知的致敏蛋白的純化快速簡便,且可很好的保持致敏蛋白的免疫活性,對于致敏蛋白的純化具有重要的借鑒意義。
【專利說明】一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白分離純化方法的【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]根據(jù)蛋白質(zhì)本身的物理化學(xué)特性的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的蛋白分離純化方法主要有以下幾種:一是基于蛋白質(zhì)分子大小的透析、超濾、分析篩層析、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等;二是根據(jù)蛋白質(zhì)的帶點(diǎn)特性分離的等電點(diǎn)沉淀、離子交換層析、等點(diǎn)聚焦電泳等;三是根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解性分離的硫酸銨分級沉淀、有機(jī)溶劑分級等;四是根據(jù)蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性分離的,如采用尿素變性與復(fù)性方法從包涵體中純化原核表達(dá)蛋白;五是根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)晶特性分離,如從雞蛋中純化溶菌酶等;六是根據(jù)蛋白質(zhì)表面的表面特性分離,蛋白質(zhì)的吸附層析;七是根據(jù)蛋白質(zhì)的分子形狀分離,如酶與底物、酶與抑制劑或激活劑、抗原與抗體、凝集素與葡萄糖等的分離常采用的親和層析,等等(汪世華,2008)。
[0003]近年具有高選擇性、高分辨率及高容量的親和層析技術(shù)越來越受到人們的關(guān)注。親和層析具有純化過程簡單、快速且分離效率高等特點(diǎn),尤其對于含量極少、穩(wěn)定性較差的生物活性物質(zhì)尤為有效。同時,免疫親和色譜因能將結(jié)構(gòu)十分相近的目標(biāo)物得以分離,也受到人們的親睞。免疫親和色譜利用抗原與抗體間高度的特異性及較高的親和力可將非常相近的目標(biāo)物得以區(qū)分,并且具有從大量復(fù)雜蛋白基質(zhì)中一步分離出極少量目標(biāo)物的優(yōu)點(diǎn),是目前最具選擇性和最有效的純化方法之一(黃昕等,1999)。通常認(rèn)為在進(jìn)行免疫純化時需使用單克隆抗或多克隆抗體,最好是使用單抗,單抗特異性強(qiáng),分離的目標(biāo)抗原純度更高。但是由于單抗制備技術(shù)難,成本高,常規(guī)實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn),這也限制了免疫親和色譜的應(yīng)用。
[0004]目前,雖然免疫親和色`譜也已經(jīng)在一些領(lǐng)域開始使用,但是用于致敏蛋白的純化方面卻報(bào)道極少,但是基于較成熟的色譜制備技術(shù),開展免疫親和純化致敏蛋白也具有樂觀的前景。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題,本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法的技術(shù)方案。
[0006]所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法,其特征在于包括以下工藝步驟:
1)制備蝦肉丙酮粉
2)抽提蝦過敏蛋白
3)硫酸銨分級沉淀
將步驟2)抽提得到的蝦蛋白粗提液調(diào)pH至7.4,緩慢加入硫酸銨至飽和度30%,低溫下緩慢攪拌,靜置,充分沉淀后離心,收集沉淀,得到蝦蛋白;
4)等電點(diǎn)沉淀將硫酸銨分級沉淀得到的蝦蛋白用IXPBS充分溶解,逐滴加入50%(v/v)硫酸溶液,直到PH至4.6,低溫下緩慢攪拌,靜置,充分沉淀后離心,收集沉淀,得到等電點(diǎn)沉淀后的蝦蛋白,將等電點(diǎn)沉淀后的蝦蛋白再用IX PBS充分溶解后,透析,冷凍干燥后得蛋白凍干粉;
5)DEAE52陰離子交換層析
用20 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl充分平衡柱子,將步驟4)得到的蛋白凍干粉用20mmol/L pH 8.0的Tris-HCl配制成5mg/ mL溶液,充分溶解后于離心,取上清上樣,上樣后換用 NaCl 濃度分別為 0,0.05,0.1,0.2,0.3,0.35,0.4,0.5,0.6,0.7,0.9 mol/L 梯度洗脫,洗脫流速設(shè)為I mL/min,自動收集器收集洗脫液,監(jiān)測A280值,收集洗脫峰做SDS-PAGE,鑒定分離純化效果;
6)Sephadex G-100 凝膠層析
先后用IXPBS及含有0.5 mol/L NaCl的I XPBS平衡柱子,平橫流速設(shè)為I mL/min,將經(jīng)步驟5)純化獲得的含目標(biāo)蛋白的峰濃縮后,上樣,用含有0.5 mol/L NaCl的IXPBS的緩沖液洗脫,洗脫流速設(shè)為0.9 mL/min,自動收集器收集洗脫液,2 min/管,監(jiān)測A280值,直到A280值接近O時,停止收集,收集洗脫峰做SDS-PAGE,得到目的蛋白的洗脫管;
7)免疫親和層析
penal多克隆抗體裝柱制作免疫親和柱層析柱,將目的蛋白用0.1 mol/L Tris緩沖液稀釋,過0.45m微孔濾膜后上樣,常溫孵育30 min后,用足量的0.1 mol/L Tris緩沖液做沖洗柱子,直到收集液中A280接近O時,換用pH 2.4,0.1 mol/L glycine鹽溶液做洗脫液洗柱,待檢測洗脫液A280接近O時停止洗脫,收集洗脫液得到蝦致敏蛋白penal。
[0007]所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法,其特征在于所述的步驟I)中制備蝦肉丙酮粉具體包括:將去頭去殼去腸線的蝦肉于勻漿機(jī)中勻漿,加生理鹽水懸浮,再向懸浮液中加入4倍體積的冷丙酮,充分混勻,(TC不斷攪拌30 min后8000 r/min離心15 min,回收沉淀物,重新用冷丙酮懸浮并混勻,重復(fù)上述過程,將沉淀物轉(zhuǎn)移至干凈濾紙上,于通風(fēng)櫥中分散,干燥后得蝦肉丙酮粉。
[0008]所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法,其特征在于所述的步驟2)中抽提蝦過敏蛋白具體包括:取步驟I)得到的蝦肉丙酮粉按1:10比例加入抽提液,所述的抽提液為pH 7.4、含5 mmol/L 二硫蘇糖醇的I mol/L,4°C低溫?cái)嚢柽^夜,4°C,8000 r/min離心15min后,收集上清液,得到蝦蛋白粗提液。
[0009]所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法,其特征在于所述的步驟3)中4°C低溫下緩慢攪拌1.5 h,靜置4 h,充分沉淀后于4°C,9000 r/min離心30 min后,收集沉淀。
[0010]所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法,其特征在于所述的步驟4)中4°C低溫下緩慢攪拌I h,靜置4 h,充分沉淀后于4°C,9000 r/min離心30 min后,收集沉淀。
[0011]本發(fā)明在充分總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上,以現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展為輔助,探索一種利用致敏蛋白表位抗體親和純化相應(yīng)的致敏蛋白,一方面可以免去純化目的蛋白所需的繁瑣的操作,另一方面也是對新方法、新技術(shù)的探索。
[0012]本發(fā)明首次采用致敏蛋白的表位抗體制備免疫親和柱來純化致敏蛋白,該方法對于表位序列已知的致敏蛋白的純化快速簡便,且可很好的保持致敏蛋白的免疫活性,對于致敏蛋白的純化具有重要的借鑒意義。【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為蛋白(NH4)2SO4結(jié)合pi沉淀的SDS-PAGE分析圖,圖中:M蛋白Marker,1-蛋白抽提液,2、4、6、8分別是飽和度為30%、40%、50%、60%的(NH4)2SO4溶液沉淀后的蛋白溶液,
3、5、7、9分別經(jīng)30%、40%、50%、60%的(NH4)2SO4沉淀后又經(jīng)pi沉淀后的蛋白溶液,IOUl分別是經(jīng)30%、40%(NH4)2SO4及pi沉淀后的上清液;
圖2為蝦致敏蛋白等電點(diǎn)沉淀后的陰離子交換層析圖;
圖3為SDS-PAGE分析蝦致敏蛋白經(jīng)陰離子交換層析得到的蛋白峰圖;
圖4為蝦致敏蛋白陰離子交換P3峰的凝膠層析圖;
圖5為SDS-PAGE分析蝦致敏蛋白經(jīng)凝膠層析得到的蛋白Pl峰圖;
圖6為Western Blot分析蟲下致敏蛋白經(jīng)凝膠層析得到的蛋白Pl峰圖;
圖7為間接競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線圖;
圖8為洗脫液洗脫效果圖;
圖9為洗脫峰的電泳圖,圖中M:蛋白分子量marker,1:上樣液,2、3洗脫峰;
圖10為洗脫峰的免疫印記圖,圖中Μ:蛋白分子量marker,1:陰性對照,2洗脫峰; 圖11為免疫親和柱的柱容量。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明`本發(fā)明。
[0015]實(shí)施例1:
一、試劑的配置
1、十二烷基硫酸鈉(10% SDS,W/V):將10 g SDS加入80 mL蒸餾水中,充分溶解后,定容至100 mL,常溫下貯存。
[0016]2、過硫酸銨(10% AP,W/V):將I g AP用蒸餾水定容至10 mL,4°C儲存,或分裝后-20°C冷凍保存。
[0017]3、Tris-HCl 緩沖液(I mol/L, pH 6.8):將 12.1 g Tris 加入 60 mL 蒸餾水中,充分溶解后,緩慢加濃鹽酸調(diào)PH至6.8,待溶液冷卻至室溫后,蒸餾水定容至100 mL,4°C儲存。
[0018]4、Tris-HCl 緩沖液(1.5 mol/L,pH 8.8):將 18.15 g Tris 加入 60 mL 蒸餾水中,充分溶解后,緩慢加濃鹽酸調(diào)PH至8.8,待溶液冷卻至室溫后,蒸餾水定容至100 mL,4°C儲存。
[0019]5、凝膠貯液(30% Acr-0.8% Bis):將29.2 g丙烯酰胺(Acr)、0.8 g甲叉雙丙烯酰胺(Bis)用80 mL蒸餾水充分溶解后,定容至100 mL, 0.45 Mm微孔濾膜過濾,濾液儲存于棕色瓶中,4°C存放。
[0020]6> 10X 電極緩沖液(Tris-Glycine, pH 8.3):將 188 g Glycine、30.2 g Tris、10.0 g SDS,加入800 mL蒸餾水中,充分溶解后,定容至1000 mL,常溫保存,使用時配置成為IX電極緩沖液,調(diào)PH至8.3。
[0021]7、2X 蛋白質(zhì)樣品緩沖液(Loading Buffer):取0.24 mL Tris-HCl 緩沖液(I mol/L,pH 6.8),1 mL 50%甘油、0.8 mL 10% SDS,40 mg 溴酚藍(lán),7.76 mL 蒸餾水,0.2 mL β-疏
基乙醇,充分混合后,4 V存放。[0022]8、蛋白凝膠染色液(R-250考馬斯亮藍(lán)):將I g考馬斯亮藍(lán)R-250,置于I L燒杯中,向燒杯中加入250 mL的異丙醇,攪拌使溶解,再加入100 mL冰乙酸,650 mL蒸懼水,充分?jǐn)嚢?,用濾紙除去不溶性顆粒后,常溫保存。
[0023]9、凝膠脫色液:將50 mL乙醇、100 mL冰乙酸、850 mL蒸餾水,混勻后備用。
[0024]免疫印跡試劑的配制
1、10X 轉(zhuǎn)膜緩沖液(pH 7.6):將 29 g Tris-Base、144 g Glycine,加入 800 mL 蒸餾水中,充分溶解后4°C保存。使用時取上述溶液100 mL,再加入500 mL蒸餾水,200 mL甲醇,混勻后,逐滴加入濃鹽酸調(diào)pH至7.6,后定容到1000 mL備用。
[0025]2、10 X TBS:將 24.2 g Tris-Base, 85 g NaCl,加入800 mL蒸餾水中,充分溶解后,用適量蒸餾水溶解,用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.6,定容至1000 mL。
[0026]3、洗膜緩沖液(TBS/T):量取100 mLlOXTBS加入I mL吐溫-20,定容至1000 mL。
[0027]4、封閉緩沖液:將15 mL 10XTBS.5 g脫脂奶粉、50 μ L吐溫-20,加入80 mL蒸餾水充分混勻,定容至100 mL,4°C保存。
[0028]5、10X麗春紅儲液:將2 g麗春紅、30 g三氯乙酸,30 g磺基水楊酸,溶于蒸懼水解并定容至100 mL。使用時蒸餾水稀釋成IX使用液。
[0029]6、Tris_HCl (0.1 mol/L, pH 7.5):將 21 g Tris-Base,溶于 80 mL 蒸懼水中,用濃鹽酸調(diào)PH至7.5,后定容至100 mL。
[0030]7、DAB 母液:將` 0.1 g DAB 溶于 20 mL Tris-HCl (0.1 mol/L, pH 7.5)中,充分
混勻,4 °C保存。
[0031]8、DAB 顯色液:取 I mL DAB 母液,5 mL Tris-HCK0.1 mol/L, pH 7.5),5 μ L30%的H202,加4 mL蒸餾水混合均勻,現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0032]CNBr-Activated Sepharose 4B偶聯(lián)抗體所需試劑的配制
1、偶聯(lián)緩沖液(0.2 mol/L NaHC03+0.5 mol/L NaCl,pH 8.3):稱取 16.8 g NaHC03,29.22 g NaCl加800 mL蒸餾水充分溶解后,I mol/LHCl調(diào)pH至8.3,后定容至1000 mL。
[0033]2、封閉緩沖液(0.2 mol/L甘氨酸):稱取15.014 g Glycine,加800 mL蒸餾水充分溶解后,6 mol/L NaOH調(diào)pH至8.0,后定容至1000 mL。
[0034]3、沖洗緩沖液(0.1 mol/L NaAC+0.5 mol/L NaCl, pH 4.0):稱取 13.61 gNaAC 3H20,29.22 g NaCl,加800 mL蒸餾水充分溶解后,濃鹽酸調(diào)pH 4.0,后定容至1000mL。
[0035]4、Tris-HCl (0.1 mol/L, pH 8.0):稱取 12.11 g Tris-Base,29.22 g NaCl,加800 mL蒸懼水充分溶解后,6 mol/L NaOH調(diào)pH至8.0,后定容至1000 mL。
[0036]二、實(shí)驗(yàn)方法:蝦致敏蛋白Pena I提取、純化及鑒定
1、制備蝦肉丙酮粉
將去頭去殼去腸線的蝦肉于勻漿機(jī)中勻漿,I g組織加1.5 mL生理鹽水懸浮。然后向懸浮液中加入4倍體積的冷丙酮,充分混勻,(TC不斷攪拌30 min后8000 r/min離心15 min,回收沉淀物,重新用冷丙酮懸浮并混勻,重復(fù)上述過程。將沉淀物轉(zhuǎn)移至干凈濾紙上,于通風(fēng)櫥中分散,干燥后得丙酮粉。若遇較大塊狀物,低溫下研磨成粉。
[0037]2、抽提蝦過敏蛋白
取蝦丙酮粉按1:10比例加入抽提液(I mol/L KC1,其中含5 mmol/L 二硫蘇糖醇,pH7.4),低溫?cái)嚢柽^夜。4°C,8000 r/min離心15 min后,收集上清液,得到奸蛋白粗提液。
[0038]3、硫酸銨((NH4) 2S04)分級沉淀
將蝦蛋白粗提液調(diào)PH至7.4,緩慢加入(NH4)2SO4至以下飽和度:30%、40%、50%、60%。4°C低溫下緩慢攪拌1.5 h,后靜置4 h,充分沉淀后于4 °C,9000 r/min離心30 min后,收集沉淀,得到對應(yīng)飽和度下的蝦蛋白,SDS-PAGE鑒定分離純化效果。
[0039]SDS-PAGE 分析
(1)凝膠的配制
凝膠的配置見表1,分離膠首先抽氣30min,抽氣完畢,加入10% AP和TEMED,配好后迅速混勻,灌膠。加入少量蒸餾水,待出現(xiàn)明顯界面時傾去蒸餾水,加入濃縮膠,并插入梳子。
[0040]表1 SDS-PAGE電泳凝膠的配方
【權(quán)利要求】
1.一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法,其特征在于包括以下工藝步驟: 1)制備蝦肉丙酮粉; 2)抽提蝦過敏蛋白; 3)硫酸銨分級沉淀 將步驟2)抽提得到的蝦蛋白粗提液調(diào)pH至7.4,緩慢加入硫酸銨至飽和度30%,低溫下緩慢攪拌,靜置,充分沉淀后離心,收集沉淀,得到蝦蛋白; 4)等電點(diǎn)沉淀 將硫酸銨分級沉淀得到的蝦蛋白用IXPBS充分溶解,逐滴加入50%(v/v)硫酸溶液,直到PH至4.6,低溫下緩慢攪拌,靜置,充分沉淀后離心,收集沉淀,得到等電點(diǎn)沉淀后的蝦蛋白,將等電點(diǎn)沉淀后的蝦蛋白再用IX PBS充分溶解后,透析,冷凍干燥后得蛋白凍干粉; 5)DEAE52陰離子交換層析 用20 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl充分平衡柱子,將步驟4)得到的蛋白凍干粉用20mmol/L pH 8.0的Tris-HCl配制成5mg/ mL溶液,充分溶解后離心,取上清上樣,上樣后換用 NaCl 濃度分別為 0,0.05,0.1,0.2,0.3,0.35,0.4,0.5,0.6,0.7,0.9 mol/L梯度洗脫,洗脫流速設(shè)為I mL/min,自動收集器收集洗脫液,監(jiān)測A280值,收集洗脫峰做SDS-PAGE,鑒定分離純化效果; 6)Sephadex G-100 凝膠層析 先后用IXPBS及含有0.5 mol/L NaCl的I XPBS平衡柱子,平橫流速設(shè)為I mL/min,將經(jīng)步驟5)純化獲得的含目標(biāo)蛋白的峰濃縮后,上樣,用含有0.5 mol/L NaCl的IXPBS的緩沖液洗脫,洗脫流速設(shè)為0.9 mL/min,自動收集器收集洗脫液,2 min/管,監(jiān)測A280值,直到A280值接近O時,停止收集,收集洗脫峰做SDS-PAGE,得到目的蛋白的洗脫管; 7)免疫親和層析 penal多克隆抗體裝柱制作免疫親和柱層析柱,將目的蛋白用0.1 mol/L Tris緩沖液稀釋,過0.45m微孔濾膜后上樣,常溫孵育30 min后,用足量的0.1 mol/L Tris緩沖液做沖洗柱子,直到收集液中A280接近O時,換用pH 2.4,0.1 mol/L glycine鹽溶液做洗脫液洗柱,待檢測洗脫液A280接近O時停止洗脫,收集洗脫液得到蝦致敏蛋白penal。
2.如權(quán)利要求1所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法,其特征在于所述的步驟O中制備蝦肉丙酮粉具體包括:將去頭去殼去腸線的蝦肉于勻漿機(jī)中勻漿,加生理鹽水懸浮,再向懸浮液中加入4倍體積的冷丙酮,充分混勻,(TC不斷攪拌30 min后8000 r/min離心15 min,回收沉淀物,重新用冷丙酮懸浮并混勻,重復(fù)上述過程,將沉淀物轉(zhuǎn)移至干凈濾紙上,于通風(fēng)櫥中分散,干燥后得蝦肉丙酮粉。
3.如權(quán)利要求1所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法,其特征在于所述的步驟2)中抽提蝦過敏蛋白具體包括:取步驟I)得到的蝦肉丙酮粉按1:10比例加入抽提液,所述的抽提液為pH 7.4、含5 mmol/L 二硫蘇糖醇的I mol/L,4°C低溫?cái)嚢柽^夜,4°C,8000 r/min離心15 min后,收集上清液,得到奸蛋白粗提液。
4.如權(quán)利要求1所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法,其特征在于所述的步驟3)中4°C低溫下緩慢攪拌1.5h,靜置4 h,充分沉淀后于4°C,9000 r/min離心30 min后,收集沉淀。
5.如權(quán)利要求1所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法,其特征在于所述的步驟4)中4°C低溫下緩慢攪拌I h,靜置4 h,充分沉淀后于4 °C,9000 r/min離心30 min后,收集沉 淀。
【文檔編號】C07K14/435GK103755794SQ201410004632
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月6日
【發(fā)明者】張弛, 潘家榮, 趙潔, 張勇勇, 陸高翔 申請人:中國計(jì)量學(xué)院